从α-酮庚二酸制备6-氨基己酸的制作方法

专利名称：从α-酮庚二酸制备6-氨基己酸的制作方法
从α -酮庚二酸制备6-氨基己酸本发明涉及制备6-氨基己酸(下文也称作“6-ACA”)的方法。本发明还涉及从6-ACA制备己内酰胺(下文称作“己内酰胺”)的方法。本发明还涉及可用于制备6-ACA或己内酰胺的宿主细胞。己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙-6或尼龙-6，12(己内酰胺和十二内酰胺的共聚物)。由大宗化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的，并且包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，期望提供一种方法，其中由能够从生物可再生来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被转化成己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法比利用来自石油化学来源的大宗化学品的传统化学工艺需要更少能源。由6-ACA制备己内酰胺是已知的，例如如US-A6，194，572中所述。如W02005/068643中所公开的，可以在存在具有α，β -烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转化6-氨基己-2-烯酸(6-ΑΗΕΑ)来生物化学地制备6-ACA。可以例如通过生物化学方式或通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-ΑΗΕΑ。尽管可以通过W02005/068643中公开的方法，通过6-ΑΗΕΑ的还原制备6-ACA是可行的，但是本发明人发现在还原反应条件下，6-ΑΗΕΑ可自发并且基本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是高脯氨酸。所述环化可以形成6-ACA生产中的瓶颈，并可导致产率的可观损失。W02009/113855公开了用于制备6-ACA的新反应途径，即从α-酮庚二酸(AKP)经由中间产物5-甲酰戍酸(也称作5-甲酰纟颜草酸(5-formyl valeric acid), 5-FVA)或经由中间产物α-氨基庚二酸(AAP)制备6-ACA。W02009/113855还公开了下述生物催化剂，其能在由AKP制备6-ACA中催化反应步骤的至少一个。尽管W02009/113855公开了产生6-ACA的有效的方法，但是期望增加生物催化产生的6-ACA的生产率，特别是在从AKP完全生物催化产生6-ACA的方法中。本发明的一个目的是提供用于制备6-ACA或己内酰胺(尤其可以被用于制备聚酰胺的己内酰胺)或用于制备6-ACA或己内酰胺的中间产物化合物的新颖方法，所述方法可以作为已知方法的替代方式。本发明的又一个目的是提供克服上文提到的现有技术中的一种或多种上述缺点的新颖方法。根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书得到。
目前发现有可能使用具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的特定生物催化剂，由AAP制备6-ACA。因此，本发明涉及用于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的至少一种生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧，其中所述酶包含由SEQUENCE ID N0’s:2、5、8和11和所述序列的具有α -氨基庚二酸脱羧酶活性的同源物之任一表不的氨基酸序列。在一种实施方式中，在本发明方法中制备的6-ACA用于制备己内酰胺。这类方法包括任选地在存在生物催化剂时环化6-氨基-己酸。
根据本发明，未发现关于中间产物的不想要的环化的问题，当形成6-ACA并任选地形成己内酰胺时，这些问题会导致产率的损失。预期本发明的方法允许得到与W02005/68643中所述方法相当或甚至更好的产率。预期在利用活生物时，尤其是在要考虑生物的生长和维持的方法中，本发明的方法尤其是有利的。还预期在本发明的一种实施方式中，本发明方法中6-ACA的生产力(形成的g/I.h )被提闻ο除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”被定义为“和/或”。除非另有说明，在本文中使用的术语“一”(“a”或“an”)被定义为“至少一个”。涉及单数名词(例如化合物、添加剂等)时，复数旨在被包括在内。本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、AAP、另一氨基酸、或AKP时，这些术语旨在包括质子化的羧酸基(即中性基团)、它们相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。在本文中提到氨基酸例如6-ACA时，所述术语旨在包括两性离子形式的氨基酸(其中氨基被质子化且羧酸酯基是去质子化的形式)，其中氨基被质子化且羧基为中性形式的氨基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。涉及存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组合。因此，涉及例如存在对映异构体的氨基酸时，氨基酸可以是L-对映异构体、D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是天然立体异构体。当涉及一个酶的在括号中的酶种类(EC)时，所述酶种类是以NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry and MolecularBiology(NC-1UBMB)提供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见http: //www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类在特定种类中的其他合适的酶旨在包括在内。术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少40%、更优选地至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其是至少85%、更尤其是至少90%、至少91%、92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一'I"生的多核苷酸或多肽。另外，同源物通常具有显著的序列相似性，通常多于30%的、尤其至少35%、优选地至少40%、更优选地至少60%、更优 选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤其至少85%、更尤其至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列相似性。多肽或多核苷酸的同源物通常与其自身具有相同的期望的功能，例如编码各自能催化相同反应(典型地相同底物向相同化合物转化)或类似反应的相同肽。“类似反应”典型地是相同类型的反应，例如脱羧、转氨化、Cl-延伸。因此，按照经验法则，同源物酶可归类在共有EC种类(x.y.Z)的头三个数字的EC种类中，例如针对羧化酶的EC4.1.1。典型地，在类似反应中，作为用于与类似反应类似的反应的底物的相同种类(例如胺、羧酸、氨基酸)的底物被转化为作为与类似反应类似的反应的产物的相同种类的产物。类似反应尤其包括通过相同化学转化定义的反应，如通过相同KEGG RDM模式定义的，其中R-原子和D-原子描述化学转化(KEGG RDM patterns: Oh, M.et al.(2007) Systematic analysis ofenzyme-catalyzed reaction patterns and prediction of microbial biodegradationpathways.J.Chem.1nf.Model.，47，1702 - 1712))。术语同源物也旨在包括由于遗传密码子的简并性或实验偏性而与另一核酸序列不同并且编码相同多肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。本文中术语“功能类似物”用于下述核酸序列，所述核酸序列不同于所述类似物为类似物的给定序列，但编码具有相同氨基酸序列的肽(蛋白、酶)或编码此类肽的同源物。尤其，优选的功能类似物是在感兴趣的宿主细胞中与称其为功能类似物的核苷酸序列相比具有类似的、相同的或更好的表达水平的核苷酸序列。在这方面，注意到，如技术人员所理解的，若期望肽(蛋白、酶)表达，更好的表达水平通常是更高的表达水平。但是，在特定实施方式中，更好表达水平可以是更低的表达水平，因为这在所述宿主细胞的代谢途径背景中可能是期望的。功能类似物可以是天然存在的序列，即野生型功能类似物，或遗传修饰的序列，即非野生型功能类似物。编码具体肽的密码子优化的序列通常是野生型序列的非野生型功能类似物，其被设计来实现期望的表达水平。尤其，优选的功能类似物是在感兴趣的宿主细胞中与称其为功能类似物的核苷酸序列相比具有类似的、相同的或更好的表达水平的核苷酸序列。序列同一性或类似性在本文中被定义为如通过比较序列测定的，两条或更多条多肽序列或两条或更多条核酸序列之间的关系。通常，序列同一性或相似性在序列全长上比较，但是也可以仅针对彼此比对的序列的一部分进行比较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列之间的序列相关性程度，根据情况由这类序列之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP 和 BLASTN (Altschul, S.F.et al.，J.Mol.Biol.1990，215，403-410)，公众可以从NCBI 和其他来源(BLAST Manual, Altschul, S., et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894)获得。使用BLASTP进行多肽序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，Blosum62矩阵。使用BLASTN进行核酸序列比较的优选参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。根据本发明，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材料或来自生物来源的部分(例如来自生物来源的生物或生物分子)催化。生物催化剂可尤其包含一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一种实施方式中，使用从天然环境中分离(从生产它们的生物中分离)的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻干细胞(悬浮液)、作为裂解物、或固定在支持物上。在一种实施方式中，一种或多种酶形成了活细胞的部分(如活的全细胞)。 酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所述细胞存在的培养基中。活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可能使用酶形成通透化(即使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部分。本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物，获得自或来自任何生物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物(包括人)、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。在一种实施方式中，生物催化剂源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、脑、肾、心或其他器官。动物可尤其选自哺乳动物的组，更尤其选自Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae 的组。合适的植物尤其包括选自下组的植物:Asplenium ；Cucurbitaceae,尤其是Curcurbita,例如Curcurbita moschata(南瓜)或Cucumis ;Mercurialis,例如Mercurialisperennis ；Hydnocarpus ;和 Ceratonia0合适的细菌可尤其选自下组:Vibrio、Pseudomonas > Bacillus、Corynebacterium、 Brevibacterium、 Enterococcus、 Streptococcus、 Klebsiella、Lactococcus、Lactobacillus、Clostridium、Escherichia、Thermus> Mycobacterium、Zymomonas、Proteus、Agrobacterium、Geobacillus、Acinetobacter、Ralstonia、Rhodobacter> Paracoccus、Novosphingobium> Nitrosomonas、Legionella、Neisseria、Rhodopseudomonas、Staphylococcus、Thermotoga、Deinococcus 和 Salmonella。合适的古细菌可尤其选自下组:Archaeoglobus、Aeropyrum、Halobacterium、Methanosarcina> Methanococcus、Thermoplasma、Pyrobaculum、Methanocaldococcus、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanopyrus和 Methanobrevibacter。合适的真菌可尤其选自Rhizopus、Neurospora、Penicillium 和 Aspergillus 的组。合适的酵母可尤其选自Candida、Hansenula、Kluyveromyces 和 Saccharomyces 的组。本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然存在的生物催化剂(野生型)或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等)修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分(如酶)。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于W02008/000632中所述方法。突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面:底物选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、PH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。提到来自具体来源的生物催化剂(尤其是酶)时，来自第一生物但是实际上在(经遗传修饰的)第二生物中生产的重组生物催化剂(尤其是酶)也旨在包括在来自所述第一生物的生物催化剂(尤其是酶)内。AAP可以以任 何方式获得。在特定实施方式中，通过化学转化AKP获得AAP。另外，如针对类似化合物所描述的，可通过催化的Leuckart-Wal Iach反应由2_氧庚二酸制备MP0该反应用在甲醇中的甲酸铵和[RhCp*Cl2]2作为均相催化剂来进行(M.Kitamura, D.Lee, S.Hayashi, S.Tanaka, M.Yoshimura J.0rg.Chem.2002, 67, 8685-8687)。或者，如S.0go, K.Uehara and S.Fukuzumi in J.Am.Chem.Soc.2004, 126, 3020-3021 所描述的，使用[IrmCp*(bpy)H2O]SO4作为催化剂用水性甲酸铵来进行Leuckart-Wallach反应。通过与(手性)苄胺反应并随后在Pd/C或Pd(0H)2/C上对中间产物亚胺进行氢化，α -酮酸转化为(对映异构富集的)氨基酸也是可能的。在本发明的一个优选的方法中，6-ACA的制备包括在存在能够在存在氨基供体时催化转氨化反应的酶时的酶促反应，所述酶选自氨基转移酶(E.C.2.6.1)的组。在一种特定的实施方式中，通过将AKP生物催化转化为AAP，来获得AAP，所述转化由氨基转移酶(E.C.2.6.1)、氨基酸脱氢酶、或能催化AKP向AAP转化的另一生物催化剂催化。通常，此类生物催化剂具有α-氨基庚二酸酯2-氨基转移酶活性或α-氨基庚二酸酯2-氨基脱氢酶活性。氨基转移酶可尤其选自以下组:β -氨基异丁酸酯:α -酮戊二酸酯氨基转移酶、β -丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC2.6.1.36),2-氨基己二酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.39),5-氨基戊酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.48)、2_氨基己酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.67)和赖氨酸:丙酮酸酯6-氨基转移酶(EC2.6.1.71 )。在一种实施方式中，氨基转移酶可选自下组:丙氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.2)、亮氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.6)、丙氨酸-氧代-酸氨基转移酶(EC2.6.1.12)、β-丙氨酸-丙酮酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.18)、(S)_3_氨基-2-甲基丙酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.22)、L, L- 二氨基庚二酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.83)。氨基转移酶可尤其选自来自以下的的氨基转移酶:哺乳动物Wercurialis，尤其是 Mercurialis perennis,更尤其是 Mercurialis perennis 的嫩芽(shoots);Asplenium,更尤其是 Asplenium、unilaterale 或 Asplenium septentrionale ；Ceratonia,更尤其是Ceratonia siliqua ;Rhodobacter,尤其是 Rhodobacter sphaeroides, Staphylococcus,尤其是 Staphylococcus aureus ；Vibrio,尤其是 Vibrio fluvialis ；Pseudomonas,尤其是 Pseudomonas aeruginosa ；Rhodopseusomonas ；Bacillus,尤其是 Bacillusweihenstephanensis 和 Bacillus subtilis ；Legionella ；Nitrosomas ；Neisseria ；或酵母，尤其是 Saccharomyces cerevisiae。当酶是哺乳动物的酶时，其尤其可源自哺乳动物肾，来自哺乳动物肝，来自哺乳动物心或来自哺乳动物脑。例如，合适的酶可选自下组:来自哺乳动物肾的氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肾的氨基异丁酸酯:α-酮戊二酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物肝的丙氨酸氨基转移酶，尤其是来自兔肝的丙氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物心的天冬氨酸氨基转移酶；尤其是来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自哺乳动物肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自猪肝的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶；来自哺乳动物脑的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶，尤其是来自人、猪或大鼠脑的4-氨基丁酸酯氨基转移酶。在一种实施方式中,来自真菌、尤其来自Neurospora的α-酮己二酸酯-谷氨酸酯氨基转移酶，更尤其是来自Neurospora crassa的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶。

在一种实施方式中，氨基转移酶选自下述组:来自Ε.coli的4-氨基-丁酸酯氨基转移酶、来自Thermus的α -氨基己二酸酯氨基转移酶,尤其是来自Thermus thermophilus的α_氨基己二酸酯氨基转移酶，和来自Clostridium、尤其是来自Clostridiumaminovalericum的5-氨基戍酸酯氨基转移酶。一种合适的2_氨基己二酸酯氨基转移酶可例如由Pyrobaculum islandicum提供。氨基供体尤其可选自氨、铵离子、胺和氨基酸的组。合适的胺是伯胺和仲胺。氨基酸可具有D-构型或L-构型。氨基供体的例子是丙氨酸、谷氨酸、异丙胺、2-氨基丁烷、2-氨基庚烧、苯甲胺、1-苯基-1-氨基乙烧、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、β _氨基异丁酸酯、丙氨酸、4-氨基丁酸酯和α-氨基己二酸酯。在又一个优选的实施方案中，制备6-ACA的方法包含在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CH-NH2基团上的氧化还原酶(EC1.4)的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化5-FVA转化成为6-ACA的6-氨基己酸6-脱氢酶活性，或者具有催化AKP转化成为AAP的α-氨基庚二酸酯2-脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)、赖氨酸6-脱氢酶(EC1.4.1.18)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.3 ；EC1.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)的组。在一种实施方式中，氨基酸脱氢酶选自被归类为以下的氨基酸脱氢酶:以NAD或NADP作为受体发挥作用的谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.3)、以NADP作为受体发挥作用的谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.4)、亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)、二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)和赖氨酸6-脱氢酶(EC1.4.1.18)。

氨基酸脱氢酶可尤其源自选自下组的生物:Corynebacterium,尤其是Corynebacterium glutamicum ;Proteus,尤其是 Proteus vulgaris ;Agrobacterium,尤其是Agrobacterium tumefaciens ;Geobacillus,尤其是Geobacillus stearothermophiIus ；Acinetobacter,尤其是 Acinetobacter sp.ADPl ；Ralstonia,尤其是 Ralstoniasolanacearum ；Salmonella,尤其是 Salmonella typhimurium ；Saccharomyces,尤其是 Saccharomyces cerevisiae ；Brevibacterium,尤其是 Brevibacterium flavum ；和Bacillus,尤其是 Bacillus sphaericus、Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis。例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自来自Bacillus,尤其是Bacillus sphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacterium glutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶,尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Agrobacterium、尤其是Agrobacterium tumefaciens的赖氛酸 6_ 脱氧酶，来自 Geobacillus、尤其是来自 Geobacillus stearothermophiIus 的赖氨酸6-脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3),尤其是来自Acinetobacter sp.ADPl的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氛酸酷脱氧酶(EC1.4.1.3),尤其是来自Ralstonia solanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子发挥作用的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4),尤其是来自Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium 的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4),尤其是来自 Brevibacterium fIavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶,尤其是来自Bacillus cereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。在一种特定的实施方式中，用于AKP向AAP转化的氨基转移酶选自下述组:来自猪心的天冬氨酸氨基转移酶；来自Neurospora crassa或酵母的α-酮己二酸酯:谷氨酸酯氨基转移酶；来自Mercurialis perennis的嫩芽的氨基转移酶；来自E.coli的4-氨基丁酸酯氨基转移酶；来自Thermus thermophilus的α -氨基己二酸酯氨基转移酶；来自Asplenium septentrionale 或 Asplenium unilaterale 的氨基转移酶；和来自 Ceratoniasiliqua的氨基转移酶。在一种特定的实施方式中，用于AKP向AAP转化的氨基转移酶选自下述组:来自Vibrio，Pseudomonas、Bacillus、Legionella、Nitrosomonas、Neisseria、RhodobacterΛEscherichia 和 Rhodopseudomonas 的氛基转移酶。已发现尤其来自从下述组中选择的生物的氨基转移酶适于催化AKP向AAP转化:Bacillus subtilis、Rhodobacter sphaeroides、Legionella pneumophila、Nitrosomonaseuropaea、 Neisseria gonorrhoeae、 Pseudomonas syringae、 Rhodopseudomonaspalustris、Vibrio fluvialis、Escherichia coli 和 Pseudomonas aeruginosa。在一种特别优选的实施方式中，就AKP向AAP转化而言，使用了下述氨基转移酶，所述氛基转移酶包含根据 Sequence ID N015、Sequence ID N018、Sequence ID N021、Sequence ID N023、Sequence ID N026、Sequence ID N028、Sequence ID N030、SequenceID N032、 Sequence ID N034、 Sequence ID N036、 Sequence ID N038、 Sequence IDN040Sequence ID N042、Sequence ID N044、Sequence ID N046 的氨基酸或这些序列之任一的同源物。

在其他实施方式中，用于由AKP制备AAP的方法包括在存在下述酶时的生物催化反应，所述酶能够在存在氨来源时催化还原性氨基化反应，所述酶选自作用于供体CH-NH2基团上的氧化还原酶(EC1.4)的组，尤其是选自氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组。通常，合适的氨基酸脱氢酶具有催化AKP转化为AAP的α -氨基庚二酸酯2_脱氢酶活性。合适的氨基酸脱氢酶尤其选自下述组:二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)、谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3; ECl.4.1.4)和亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)。在一种实施方式中，氨基酸脱氢酶选自归类为下述类别的氨基酸脱氢酶:以NAD或NADP作为受体起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3)、以NADP作为受体起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4)、亮氨酸脱氢酶(EC1.4.1.9)和二氨基庚二酸酯脱氢酶(EC1.4.1.16)。氨基酸脱氢酶可尤其源自从下述组中选择的生物:Corynebacterium,尤其是Corynebacterium glutamicum; Proteus,尤其是 Proteus vulgaris ;Agrobacterium,尤其是Agrobacterium tumefaciens ;Geobacillus,尤其是Geobacillus stearothermophiIus ；Acinetobacter,尤其是 Acinetobacter sp.ADPl ；Ralstonia,尤其是 Ralstoniasolanacearum ；Salmonella,尤其是 Salmonella typhimurium ；Saccharomyces,尤其是 Saccharomyces cerevisiae ；Brevibacterium,尤其是 Brevibacterium flavum ；和Bacillus,尤其是 Bacillus sphaericus、Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis。例如，合适的氨基酸脱氢酶可选自:来自Bacillus,尤其是来自Bacillussphaericus的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium sp.的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Corynebacterium的二氨基庚二酸酯脱氢酶，尤其是来自Corynebacteriumglutamicum的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Proteus的二氨基庚二酸酯脱氢酶,尤其是来自Proteus vulgaris的二氨基庚二酸酯脱氢酶；来自Acinetobacter的以NADH或NADPH作为辅因子起作用的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3)，尤其是来自Acinetobacter sp.ADPl的谷氨酸酯脱氢酶；来自Ralstonia的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.3),尤其是来自Ralstoniasolanacearum的谷氨酸酯脱氢酶；来自Salmonella的以NADPH作为辅因子(EC1.4.1.4)起作用的谷氨酸酯脱氢酶，尤其是来自Salmonella typhimurium的谷氨酸酯脱氢酶；来自Saccharomyces 的谷氛酸酷脱氧酶(EC1.4.1.4),尤其是来自 Saccharomyces cerevisiae的谷氨酸酯脱氢酶；来自Brevibacterium的谷氨酸酯脱氢酶(EC1.4.1.4),尤其是来自Brevibacterium flavum的谷氨酸酯脱氢酶；和来自Bacillus的亮氨酸脱氢酶,尤其是来自 Bacillus cereus 或 Bacillus subtilis 的亮氨酸脱氢酶。另一合适的氨基酸脱氢酶可选自下述组:来自Agrobacterium tumefaciens或Geobacillus stearothermophilus的赖氨酸6_脱氢酶；或选自下述组:来自Bacilluscereus或Bacillus subtilis的亮氨酸脱氢酶。用于制备6-AAP的AKP原则上可以通过任何方式获得。例如，AKP可基于H.Jageret al.Chem.Ber.1959，92，2492-2499所述方法获得。可以如下制备AKP:使用乙醇酸钠作为碱，用二乙基草酸酯烷基化环戊酮，将得到的产物在强酸(2M HCl)中回流并例如通过从甲苯中结晶来回收产物。还可能从天然来源，例如从产甲烧的Archaea,从Asplenium septentrionale,或从Hydnocarpus anthelminthica获得AKP。可例如从这种生物或其部分中，例如从Hydnocarpus anthelminthica种子中提取AKP。合适的提取方法可例如基于A.1.Virtanenand A.M.Berg in Acta Chemica Scandinavical954, 6, 1085-1086 中所述方法,其中描述了使用70%乙醇从Asplenium中提取氨基酸和AKP。在一种特定的实施方式中，在下述方法中制备AKP，所述方法包括将α-酮戊二酸(AKG)转化成α-酮己二酸(ΑΚΑ)，并将α-酮己二酸转化成α-酮庚二酸。该反应可以由生物催化剂催化。AKG可例如以本领域本身已知的方式，从碳源例如碳水化合物生物催化地制备。用于从AKG制备AKP的合适的生物催化剂可尤其选自催化下述反应的生物催化齐U: α -酮戊二酸成为α -酮己二酸的C1-延长和/或α -酮己二酸成为α -酮庚二酸的C1-延长。在一种特定的实施方式中，AKP的制备由包含以下的生物催化剂催化:a.AksA酶或其同源物；b.至少一种选自AksD酶、AksE酶、AksD酶同源物和AksE酶同源物的组的酶；和c.AksF酶或其同源物。优选地，催化剂包含选自AksD酶和其同源物的组的酶以及选自AksE酶和其同源物的组的酶二者。所述AksD酶或其同源物和所述AksE酶典型地形成异二聚体。一种或多种AksA、A ksD, AksE, AksF酶或其同源物可存在于下述生物中，所述生物选自产甲烧古细菌的组，优选地选自Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosarcina、Methanothermobacter、Methanosphaera、Methanopyrus 和Methanobrevibacter 的组。在一种特定的实施方式中，催化由α-酮戊二酸(AKG)制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系形成赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸酯通路的部分。术语“酶体系”在本文中尤其用于能够催化特定转化的单个酶或一组酶。从AKG制备AKP可包括具有已知或未知中间产物的一个或多个化学反应，例如AKG成为AKA的转·化或AKA成为AKP的转化。这类体系可存在于细胞中，或从细胞中分离。酶体系可尤其来自下述生物，所述生物选自酵母、真菌、古细菌和细菌的组，尤其来自 Penicillium、Cephalosporium、Paelicomyces、Trichophytum、Aspergillus、Phanerochaete、Emericella、Ustilago、Schizosaccharomyces、Saccharomyces、Candida、Yarrowia、Pichia、Kluyveromyces、Thermus> Deinococcus、Pyrococcus、Sulfolobus、Thermococcus、Methanococcus、Methanocaldococcus、Methanosphaera、Methanopyrus、Methanobrevibacter、Methanosarcina 和 Methanothermobacter 的组。在一种特定的实施方式中，催化从α-酮戊二酸制备AKP的生物催化剂包含催化α-酮戊二酸转化成α-酮己二酸的酶体系，其中所述酶体系的至少一种酶源自固氮细菌，所述固氮细菌选自蓝细菌、根瘤菌、Y -变形菌(proteobacteria)和放线菌(actinobacteria)的组，尤其选自 Anabaena、Microcystis、Synechocystis、Rhizobium、Bradyrhizobium> Pseudomonas、Azotobacter、Klebsiella 和 Frankia 的组。这些Aks酶的同源物和编码这些酶的基因的例子在下文的表IA和IB中给出。表 IA
权利要求
1.关于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的至少一种生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧，其中所述酶包含选自由序列编号:2、5、8和11的之任一表示的序列和具有α -氨基庚二酸脱羧酶活性的所述序列的同源物的组的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酶包含与序列编号:2、5、8和11之任一具有至少40%，优选地至少60%，尤其至少80%，更尤其至少90%序列同一性的同源物。
3.根据权利要求1或2的方法，其包括从α-酮庚二酸制备α -氨基庚二酸。
4.根据权利要求3的方法，其中，在存在氨基供体时，由生物催化剂催化α-氨基庚二酸的制备，所述生物催化剂具有使α-酮庚二酸转氨化或还原性氨基化的催化活性。
5.根据权利要求4的方法，其中所述生物催化剂包含具有使α-酮庚二酸转氨化或还原性氨基化的催化活性且选自氨基转移酶(E.C.2.6.1)和氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1)的组的酶。
6.根据权利要求5的方法，其中所述氨基转移酶或氨基酸脱氢酶选自下组:β-氨基异丁酸酯:α -酮戊二酸酯氨基转移酶、β -丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、4-氨基-丁酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.19)、L-赖氨酸6-氨基转移酶(EC2.6.1.36)、2_氨基己二酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.39)、5_氨基戊酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.48)、2_氨基己酸酯氨基转移酶(EC2.6.1.67)、赖氨酸:丙酮酸酯-6-氨基转移酶(EC2.6.1.71)和赖氨酸_6_脱氢酶(EC1.4.1.18)。
7.求3-6任一项的方法，其中使用了下述氨基转移酶，所述酶包含根据序列编号15、序列编号18、序列编号21、序列编号23、序列编号26、序列编号28、序列编号30、序列编号32、序列编号34、序列编号36、序列编号38、序列编号40、序列编号42、序列编号44、序列编号46的氨基酸序列、在说明书表8、9或11中提到的氨基转移酶、或这些序列之任一的同源物。
8.关于制备己内酰胺的方法，其包括对通过根据上述权利要求任一项的方法制备的6-氨基己酸环化，因此形成己内酰胺。
9.组宿主细胞，其包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的异源酶的基因，其中所述酶包含由序列编号:2、5、8和11和所述序列的同源物之任一表示的氨基酸序列。
10.根据权利要求9的重组宿主细胞，其包含编码具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的核酸序列，所述核酸序列包含根据序列编号:1、3、4、6、7、9和10和所述序列的功能类似物之任一的序列。
11.根据权利要求9或10的重组宿主细胞，其包含编码能催化转氨化反应或还原性氨基化的生物催化剂的核酸序列，借以由α-酮庚二酸形成α-氨基庚二酸。
12.根据权利要求11的重组宿主细胞，其中编码能催化转氨化反应或还原性氨基化反应的生物催化剂的核酸序列选自序列编号15、序列编号18、序列编号21、序列编号23、序列编号26、序列编号28、序列编号30、序列编号32、序列编号34、序列编号36、序列编号38、序列编号40序列编号42、序列编号44、序列编号46或这些序列之任一的同源物的组。
13.核苷酸，其包含根据序列编号:3、6和9和在Escherichia宿主细胞中具有类似、相同或更好的表达水平的其功能类似物之任一的序列。
全文摘要
本发明涉及用于制备6-氨基己酸的方法，其包括使用至少一种包含具有α-氨基庚二酸脱羧酶活性的酶的生物催化剂，使α-氨基庚二酸脱羧。本发明还涉及用于由通过所述方法制备的6-氨基己酸制备己内酰胺的方法、涉及适用于根据本发明的方法的宿主细胞和编码可在本发明的方法中使用的脱羧酶的多核苷酸。
文档编号C12P13/00GK103097541SQ201180043687
公开日2013年5月8日 申请日期2011年8月26日 优先权日2010年9月10日
发明者斯特凡纳斯·克尼里斯·翰德里克斯·蒂尔科, 马丁·斯库尔曼, 埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽, 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯, 希尔德加德·汉纳·曼克 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司