专利名称：一种吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种新的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶热稳定性提高的突变体以及筛选热稳定性突变体的高通量筛选方法，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术：
血糖浓度测定在糖尿病的临床诊断和管理中极为重要。目前，我国约有成年糖尿病患者9700万人，还有1. 48亿糖尿病前期患者，已经超越西方发达国家，成为全球糖尿病人最多的国家，糖尿病将是未来我国严重的公共卫生问题之一，而血糖监测越来越受到重视。血糖检测在自我诊断检测市场中占据了近16%的市场份额，资料显示，目前全球糖尿病患者已达3. 66亿人，全世界血糖检测市场容量为50亿美元，90%欧美等发达国家的糖尿病患者通过血糖仪进行自我监测。可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1. 5. 2，简称s-GDH)，是一种可以将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的氧化还原酶，因此该类型酶可用于检测血糖。吡咯喹啉醌(PQQ)是继黄素核苷酸(FMN、FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD、NADP)后的第三种新型辅酶。后来又相继发现一些与PQQ结构类似的辅酶topaquinone (TPQ) Uysine tymsylqllinone (LTQ)、tryptophantryptophylquinone (TTQ)，这四种辅酶并称为醌式辅酶，以PQQ、TPQ、LTQ、TTQ为辅酶的氧化还原酶统称为醌蛋白酶或醌酶。吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶是一类主要的以PQQ为辅酶的醌蛋白，因其独特的性质而备受关注。醌蛋白广泛存在于革兰阴性菌的胞外周质中，部分溶于胞外周质，部分与细胞膜的外表面相连，组成了一个与细胞膜上呼吸链相偶联的胞外周质氧化还原系统，传递电子到细胞膜上的电子受体。这种胞外周质氧化还原系统的特征是缩短了电子传递的路径，减少了底物氧化和产物释放所需的能量。吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶因其存在的部位不同，又分为膜结合型即m-GDH 和水溶型即s-GDH。m-GDH存在于多种革兰阴性菌中，如不动杆菌属、假单胞菌属和醋酸菌属的细菌，位于这些细菌的细胞膜外表面，可直接氧化D-葡萄糖生成脂类或葡萄糖酸。该酶是单亚基组成的醌蛋白，只由一条87kD的肽链构成，有5个穿膜结构，为高度疏水。其底物专一性较高，除了葡萄糖可以氧化己糖、戊糖等单糖，但不会氧化二糖。s-GDH是来源于醋酸钙不动杆菌的可溶性醌蛋白，发现于醋酸钙不动杆菌的周质空间内，目前只在不动杆菌属中有发现。s-GDH被证明是区别于m-GDH的第二种PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶，且二者同源性很低。该酶是同型二聚体，每个亚基的相对分子质量为50，000，N端是一个由对个氨基酸残基组成的信号肽，在分泌到胞外周质中后被切除。该酶不参与醋酸钙不动杆菌中的呼吸链，生理学功能未知。该酶可以催化各种单糖和二糖氧化成相应的酮，酮再进一步水解成醛糖酸，并且s-GDH可以将电子提供给PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP (2，6- 二氯靛酚)、 WB(ffurster氏蓝)短链泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工电子受体如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和导电聚合物等。
s-GDH与其他的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶相比，具有极高的反应活性，反应灵敏；而且辅酶与蛋白结合紧密不需反应中额外添加辅酶(如NAD)；此外，反应过程中氧气不会作为电子的受体而不受氧分压干扰及广泛的人工电子受体特异性。这些优点使s-GDH在血糖检测以及微体积、快速响应的葡萄糖传感器等方面有着重要作用和应用。尽管使用s-GDH有上述讨论的优点，但是其热稳定性较差，在使用过程中如果遇到较高温度的环境很容易失活。近来，针对热稳定性差的缺点，Sode等在用PCR方法进行了一系列的定点突变，选择多肽链侧链基团表面231位的丝氨酸残基分别代之以半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，都使酶的稳定性得到了一定程度的提高，其中以Ser231LyS在保持高活力的前提下稳定性增加最明显，与野生型相比，55°C半衰期提高了 8倍，但仍然保持其原有酶活力。根据通过增加两个亚基之间的结合力而提高稳定性的原理，采用的其他方法有①采用戊二醛将两个亚基的C、N端进行化学交联，55°C半衰期达到63min ；②利用基因工程的方法，在两个亚基的中间添加了一段连结肽 Glu-Leu-Gly-Thr-Arg-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Leu-Gln,半衰期 16min ；③在两个亚基的接触表面进行突变，Asn340Phe/Tyr418Ile和Thr416Val/Thr417Val，增加亚基间的疏水作用力，半衰期16min。选择sPQQGDH多肽链侧链基团表面415位的丝氨酸残基代之以半胱氨酸，突变后的sPQQGDH与野生型相比，在保持其原有的催化活力的前提下，55°C热稳定性增加了 30倍，70°C孵育IOmin后，Ser415Cys仍然保持着90%的活力。定向进化属于非理性设计，已经成为体外改造酶分子的一种策略，不用事先了解蛋白质的结构、保守位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，在体外模拟达尔文进化过程，通过建立随机突变文库或重组基因库，再经过合适的筛选，获得具有性质明显提高的蛋白质。酶定向进化技术在一定程度上弥补了定点突变技术的不足，具有很大的应用价值。可溶性葡萄糖脱氢酶的优良性质使其在血糖检测和葡萄糖传感器等方面的应用有着极大的潜能，但是较差的热稳定性则限制了其进一步的应用，因此通过生物技术手段提高它的热稳定性成为s-GDH研究中的一个重要方向，得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶具有重要的意义，不仅可拓宽酶的工业应用范围，而且可研究酶结构与稳定性的关系。
发明内容
本发明的目的在于针对市场上可溶性葡萄糖脱氢酶热稳定性差的问题，发明的任务是通过定向进化技术与高通量的筛选方法提供与野生型酶相比热稳定性得到显著提升的新型s-GDH突变体或变异体。本发明的技术方案一种热稳定性提高的S-GDH突变体，其特征在于野生型S-GDH 位于111，263，270，331，347，416位中的氨基酸中有一个或多个被取代，其中这些位置对应于由醋酸钙不动杆菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列 (SEQ ID NO 2)已知的氨基酸位置。s-GDH突变体的高通量筛选方法，通过易错PCR构建 s-GDH的高容量突变文库，利用浸有有色底物的滤纸在菌落平板上进行原位筛选，并结合菌落直接转化法获得s-GDH克隆子，得到s-GDH热稳定性提高的突变体。与野生型S-GDH相比，所述的S-GDH突变体的热稳定性获得了显著提高。得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶为进一步扩大葡萄糖脱氢酶的应用范围奠定了基础。编码本发明的s-GDH突变蛋白的多核苷酸序列以及含这种多核苷酸序列的表达载体和含所述表达载体的宿主细胞也是本发明的方案。本发明还涉及本发明的突变体在葡萄糖检测方法中的用途，尤其是在通过测试条装置或用生物传感器进行的葡萄糖检测方法。
图1 含有野生型或s-GDH突变体的表达载体结构2 易错PCR的琼脂糖凝胶电泳3 定向进化筛选示意4 野生型及s-GDH突变体在55 °C的热稳定性分析
具体实施例方式具有葡萄糖脱氢酶活性(膜结合型和可溶型)的两种完全不同的醌蛋白酶类型同被分组在EC 1. 1. 5. 2下，但这两种类型的酶并不相关。对于本发明而言，只有可溶型葡萄糖脱氢酶s-GDH是有关的，下文讨论其改良变体。本领域知道，s-GDH的野生型DNA序列可从不动杆菌属(AcinetcAacter)的菌株中分离出来。最优先的是从醋酸钙不动杆菌菌株LMD79. 41中分离出来。该野生型s-GDH的 DNA序列及多肽序列分别在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2中给出。本发明的重组载体是表达载体，可以根据表达及纯化的需要等目的使用适当的载体，例如pET系列、pQE系列、pMAL系列、pGEX系列等适于大肠杆菌的表达载体或分别适于枯草菌等其他原核细胞、酵母、霉菌等丝状菌的表达载体。本发明的转化细胞，例如在制备s-GDH时，可以使用大肠杆菌、枯草菌等其他原核细胞、酵母、霉菌等丝状菌等。上述转化细胞可以通过采用电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将重组载体导入细胞进行制备。作为重组载体及转化细胞的具体例中，可以举出下述实施例中给出的重组载体pET28-gdh和由此载体得到的转化大肠杆菌BL21 (DE3)。随着创建基因文库方法的不断建立和完善，建立一个突变库已变得很常规，而建立一个合适的高通量筛选方法却变得非常关键，建立一个通用的高通量筛选方法目前仍是一个很大的挑战。在过去几年，出现了许多有应用价值的筛选方法。催化活性的选择往往是通过表型或在固相和微孔中进行筛选。选择压力的使用往往导致突变体中出现不影响催化活性的突变。本发明目的筛选热稳定性提高的突变体，因此选择热处理作为选择压力。s-GDH为胞内酶，若要通过平板直接筛选则需要以细胞为单位进行酶活反应，预实验发现，诱导表达的BL21 (DE3) /pET28-gdh也表现出与s_GDH相同的酶反应活性，可以使反应底物溶液的颜色褪去。除此之外，由于pET28a载体会有少量的泄露表达，当用可以使表达的s-GDH形成有活性的全酶的筛选平板培养时，平板上的菌落表达出一定的酶活性。以上两点决定了可以通过底物颜色变化进行原位筛选。
由于热处理过程中菌体大部分已死亡，正常接种无法生长，为了获得阳性突变子， 可以采用平板影印，原位PCR或菌落直接转化等方法，本发明采用菌落直接转化法。对于本发明而言，采用菌落直接转化法获得阳性突变子的克隆。热处理使得部分菌体裂解，所含质粒释放，通过直接将热处理失活菌落转化宿主细胞，使阳性突变子的质粒得到转化，从而得到其克隆子。使野生型或s-GDH突变体在宿主细胞中表达后，为了从培养物中分离纯化得到目的蛋白，可以组合公知的分离操作进行分离。例如可以举出用超声波处理、酶消化、盐析或溶剂沉淀法、透析、离心、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、离子交换色谱法、亲和色谱法等。本实验的具体方案是利用野生型或s-GDH突变体C端融合表达的His标签进行亲和纯化。由于大肠杆菌没有合成PQQ的能力，只能得到sPQQGDH的重组酶蛋白，因此测定酶活之前需要添加相应的辅酶辅基以形成有功能活性的全酶。向纯酶或粗酶的酶液加入一定浓度的PQQ以及Ca2+，使辅酶与酶蛋白完全的结合即形成有活性的全酶溶液，可用酶活测定反应。如上所述，s-GDH可以利用多种电子受体，如PMS (吩嗪硫酸甲酯)、DCIP 0，6-二氯靛酚)、WB (ffurster氏蓝)短链泛酸如泛醌Ql和泛醌Q2以及某些人工电子受体如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯和导电聚合物。通过这些电子受体对s-GDH氧化葡萄糖的活性进行间接测定。本发明采用PMS和DCIP对s_GDH活性进行测定。s-GDH氧化葡萄糖的酶活测定原理如下D-Glucose+ox-PMS — D-glucono- δ-lactone+re-PMSre-PMS+ox-DCIP — ox-PMS+re-DCIP氧化态的DCIP溶液为蓝色，在600nm下有吸光值，而还原态的DCIP溶液为无色， 因此当反应进行时，蓝色为慢慢褪去，相应的0D_值会逐渐减少，通过0D_值的变化对酶活进行测定计算。一个酶活单位(U)为25 °C条件下，在Imin内能够使Iymol的葡萄糖氧化(或 Iumol DCIP还原)的酶量。单位体积酶溶液中酶活单位的计算公式如下Enzyme activity (U/ml) = (( Δ ODtest- Δ ODblank) X df X Vt) / (tminX kX Vs)tmin:反应时间长度Omin)Vt 总的反应体积Oml)Vs 加入的酶液体积(0. Olml)k =DCIP 在 600nm 下的吸光系数(1/ μ Μ)df 酶液稀释倍数本领域知道，稳定性可涉及不同方面，分别例如储存温度或储存时间。短期温度应力模型常用于评价稳定性。本发明的稳定性以此短期温度应力模型评价，因此称为热稳定性。热稳定性通过检测样品的无应力和有应力的s-GDH酶活性来测定。通过将无应力样品活性设定为100%，应力处理后的剩余活性可以百分率计算。对于具体的野生型或s-GDH突变体，选择65°C处理30分钟或是测定55°C下的半衰期。使用这些条件，65°C处理30分钟下野生型s-GDH剩下其原始活性在15%以下，而s-GDH突变体在实施此短期应力模型后剩下初始酶活的大大高于15%。本发明最后得到的突变s-GDH热稳定性显著提升。由于新型s-GDH的提升的热稳定性，所以有可能使各种应用领域中的葡萄糖测定取得显著技术进步。本发明的改良型s-GDH突变体可以巨大优势用于生物样品中葡萄糖的检测，尤其是通过测试条装置或通过生物传感器进行的检测。本发明的改良s-GDH变异体的主要应用之一是用于测试条，以监测糖尿病患者的血糖水平。如上所述，s-GDH对氧的不敏感性是超越葡萄糖氧化酶的巨大优势。现在具有提高的热稳定性的新型s-GDH变异体，可更好的储存和应用。本发明还包括使用本发明的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法。尤其优选的是，用于检测样品中葡萄糖的改进方法的特征在于，使用传感器或测试条装置进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。用于检测或测量样品中葡萄糖的装置也发球本发明范围，所述装置包含符合本发明的s-GDH突变体以及所述测量所需要的其他试剂。热稳定性提高的本发明s-GDH突变体还可以非常有利地用于生物传感器中，以在线监测样品中或反应器中的葡萄糖。对于此目的，所述s-GDH突变体例如可用于包被具有锇络合物的氧不敏感玻璃电极，以更加准确地测定葡萄糖浓度。通过以下步骤进一步说明本发明，步骤1易错PCR本发明采用GeneMorph II易错PCR试剂盒进行突变，按说明书所述，突变率与所采用的模板加入的量及PCR循环数有关，模板量越多，循环数越少，突变率越低，反之则突变率越高。以含野生型s-GDH基因(SEQ ID NO 2)的重组载体pET28_gdh (如图1)为模板，以 F(5~-GCCCATGGAAAACATTTATTGGCT-3~)( = SEQ ID NO 5)和 R(5，-GGAAGCTTATACATAGCCTTATAGG-3") ( = SEQ ID NO 6)为引物进行易错PCR，采用50 μ L反应体系如下，60ng/ μ L pET28_gdh 5 μ L ；250ng/ yL 引物 F 0. 5 μ L ；250ng/ μ L 引物 R 0. 5 μ L ；IOXMutazyme II 缓冲液 5 μ L ；40mM dNTP 1 μ L ；Mutazyme II DNA 聚合酶 1 μ L ；ddH20 37 yL。PCR条件为95°C预变性:3min ；32个循环_95°C变性40s，56°C退火40s，72°C延伸1. 5min ；72°C延伸lOmin。PCR产物通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。 步骤2构建高容量突变文库 将易错PCR产物电泳后利用DNA胶回收试剂盒(Axyft^p DNA Gel ExtractionKit)进行切胶回收并与载体pED8分别进行Ncol/Hindlll的双酶切反应。酶切后回收的片段通过260nm处吸光度值进行浓度测定。将目的片段与载体片段按照物质的量比为10 1的比例混合，利用T4连接酶在12°C条件下连接10h。将连接产物利用PCR回收试剂盒(Axyft^p PCR cleanup Kit)进行除盐回收，最后以10 μ L去离子水溶解，以防止连接过程中缓冲液的离子对电转化产生影响。然后将连接产物电转化高效感受态细胞Ε. coliBL21 (DE3)，电击条件200 Ω ,25 μ F, 2. 5kV。将复原细胞均勻的涂布于筛选平板上，37°C培养12 16h，待菌落长出。筛选平板0. 5%酵母粉(Yeast Extract)，1 %胰蛋白胨(Tryptone)，1 %氯化钠，IOmM氯化钙，1. 5%琼脂粉，混勻在121°C灭菌20min，冷却至55 °C左右，加入终浓度30 μ g/ml卡那霉素以及ImM经过滤灭菌的PQQ，倒平板。步骤3高通量筛选热稳定性突变体利用平板对S-GDH热稳定性突变文库进行高通量的筛选，具体方法如下1)将新开封的滤纸在无菌操净台内按平板大小的直径进行裁剪备用；2)配制酶反应底液，IOmM MOPS (pH 7. 0)，20mM葡萄糖，0. 6mM PMS, 0. 3mM DCIP,混合均勻；3)将突变文库置于60°C的烘箱内热处理30分钟，然后冷却至室温；4)将剪裁过的滤纸完全浸润反应液，然后将其小心铺于突变文库的平板上^后拿起。滤纸上与菌体接触的部分会发生酶反应，就会出现褪色出现白色的斑点；若由于热处理导致酶已失活，则菌落会被染至深蓝色，而其对应的滤纸部分不会发生颜色变化，因此根据这一颜色变化，仍可使滤纸褪色的菌落则有可能是具有高热稳定性的突变位点；5)由于热处理过程中菌体大部分已死亡，正常接种无法生长，因此将挑出的可能的突变子直接加入到BL21(DE3)的感受态中，利用热激法进行转化，(即采用落直接转化法获得s-GDH克隆子)；6)将二次转化后长出的菌落进行热稳定性验证复筛7)将复筛得到的稳定性有提高的突变菌株进行培养，提取质粒，由生工测序，测序结果如下，
权利要求
1.一种热稳定性提高的S-GDH突变体，其特征在于野生型S-GDH位于111，沈3，270， 331，347，416位中的氨基酸中有一个或多个被取代，其中这些位置对应于由醋酸钙不动杆菌Acinetobactercalcoaceticus L. M. D. 79. 41的s-GDH野生型序列已知的氨基酸位置。
2.如权利要求1所述的s-GDH突变体，其特征在于野生型s-GDH中位于111位的天冬氨酸被谷氨酸取代，位于263位的甘氨酸被半胱氨酸取代，位于270位的谷氨酰胺被组氨酸取代，位于331位的苏氨酸被甲硫氨酸取代，位于347位的丝氨酸被脯氨酸取代，位于416 位的苏氨酸被异亮氨酸取代。
3.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求2的s-GDH突变体。
4.一种重组载体，其特征在于载有权利要求3所述的分离的多核苷酸。
5.一种转化细胞，其特征在于由权利要求4所述的重组载体转化而制成。
6.一种应用权利要求3的s-GDH突变体检测、测定或测量样品中葡萄糖的方法，所述方法包括使所述样品与所述突变体接触。
7.根据权利要求6的方法，其特征还在于使用传感器或试纸条装置来进行葡萄糖的所述检测、测定或测量。
8.一种用于检测或测量样品中的葡萄糖的装置，所述装置包括权利要求2中的s-GDH 突变体。
9.一种高通量筛选如权利要求1所述的s-GDH突变体的方法，其特征在于利用浸有有色底物的滤纸在菌落平板上进行原位筛选。
10.根据权利要求9所述的高通量筛选s-GDH突变体的方法，筛选得到的阳性突变子通过菌落直接转化法得到其克隆子。
全文摘要
本发明涉及一种定向改造可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(s-GDH)的分子结构，并采用高通量技术筛选热稳定性突变体的方法。其特征在于通过易错PCR构建s-GDH的高容量突变文库，利用浸有有色底物的滤纸在菌落平板上进行原位筛选，并结合菌落直接转化法，获得s-GDH热稳定性提高的突变体。与野生型s-GDH相比，所述的s-GDH突变体的热稳定性获得了显著提高。得到高热稳定性的可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶为进一步扩大葡萄糖脱氢酶的应用范围奠定了基础。
文档编号C12Q1/54GK102559624SQ20121005498
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月5日 优先权日2012年3月5日
发明者于怡, 徐志南, 朱建忠, 杨叶东, 黄磊 申请人:浙江德清汇宁生物科技有限公司