专利名称：H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒核酸的检测方法，尤其涉及一种检测H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法。
背景技术：
禽流感(Avian influenza, Al)是由Al病毒(AIV)引起的一种急性、高度接触性传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。按病毒表面结构蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原性的不同，可将禽流感病毒(Avian influenza vrius,AIV)分成16个H亚型和9个N亚型。由H5亚型禽流感病毒引起的高致病性禽流感(Highlypathogenic avian influenza,HPAI)近几年愈演愈烈，马来西亚、俄罗斯、中国、波黑、罗马尼亚、法国、印度、埃及、德国、奥地利、伊朗、希腊、斯洛文尼亚、意大利等国相继报道了禽流感疫情。目前，我国流行的禽流感病毒以H5亚型为主。因此，建立H5亚型禽流感病毒快速、灵敏、特异的鉴别诊断方法，可为我国禽流感的防控提供技术支持与保障。现有禽流感病毒检测方法主要分为抗体检测及抗原检测方法。抗体检测方法包括血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition, HI)、琼脂免疫扩散试验(Agarosegel immunodiffusion, AGID)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked ImmunosorbentAssay, ELISA)、补体结合试验(Complement FixationAssays, CF)、神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibitor test, NIT)以及病毒中和试验(Virusneutralization Test,VNT)等。抗体检测方法因不能区分人工注射疫苗和病毒感染，故在实际中应用价值不大，所以目前基于抗原检测技术为AIV的主流检测方法。针对AIV抗原检测，经典的金标准检测方法为鸡胚病毒分离鉴定技术，该方法检测周期长，操作步骤繁杂。常见的快速检测方法包括ELISA和荧光RT-PCR。二者相比，ELISA检测灵敏度较低，免疫试剂质量稳定性、批间重复性较差；而RT-PCR技术灵敏性高、特异性好，正越来越为人们所接受。然而，传统的RT-PCR方法，一方面需经过“高温变性、中温延伸、低温退火”等温度循环过程；另一方面，样品处理所涉及的细胞裂解、核酸提取纯化、扩增等步骤，需要在几个独立的检测区，使用儿台(套)设备才能实现，因此实际应用中存在以下缺陷(I)检测成本较高，基层单位难以应用；(2)不能在养殖场、检疫站和临床等场所现场使用，须配备专门的实验室，需使用具有热循环功能的专用PCR仪；(3)操作繁琐，检测时间冗长(几小时以上)，直接影响了疫情的及早发现与防控。进入21世纪，日本科学家Notomi等开发出环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)技术,核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，不需要PCR仪。LAMP的扩增效率是目前最高的一种，其灵敏度比传统PCR高出约2-3个数量级。扩增产物的DNA数量比PCR产物高很多，能够达到几个微克。然而，由于该技术太过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极其容易被污染。I个扩增的LAMP产物，往往又是同一片段的重复序列，因此，如果实验室一旦遭到气溶胶污染，假阳性率会很高而且难于去除。所以，有人认为，LAMP最终的应用方向，应该是不开盖的检测。1990年瑞士的Manz等提出微全分析O -TAS)概念,也称之为芯片实验室(Lab on a Chip)或微流控芯片(Microfluidic Chip)技术,具有自动化、集成化、便携化等优势。 因此，将LAMP与y -TAS进行系统集成，利用二者各自独特的技术优势，恰恰可以解决上述问题，提供一种简便、快速、敏感性高、特异性强、自动化程度高的禽流感病毒核酸分子检测方法，在微全分析系统上实现样本的细胞裂解、核酸提取纯化、核酸扩增及检测，全分析为程序化自动控制过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法。本发明是在微全分析系统上使用环介导等温扩增技术，能实现包括样本处理在内的全分析过程，如病毒裂解、核酸提取纯化、等温扩增等步骤的全部自动化，具有敏感度高、特异性好和快速等特点，且价格低廉，适用于现场快速检测禽流感病毒，从而克服了目前核酸分析方法操作繁杂、费时、易于污染且须在几个独立的分区实验室完成等问题。本发明的目的是提供一种自动化、快速、简便、灵敏且经济的用于检测人或动物的分泌物、血清、尿液、气管试子、泄腹腔试子、粪便或者组织浸提液中禽流感病毒的核酸分子等温扩增微全分析方法。本发明利用自动化程序控制的微全分析系统实现环介导等温扩增技术，从待测试样中提取核酸，利用所设计的引物进行扩增反应，采用三种检测方式(一)直接荧光目视法，在可见光下直接观察反应管中是否有明显的荧光来判断待测试样是否含有禽流感病毒；(二)紫外光照射荧光目视法，在紫外光激发下观察反应管的荧光来判断待测试样是否含有禽流感病毒；(三)凝胶电泳法，检测反应产物是否含有特异性的梯状条带。本发明以人或动物的分泌物、血清、尿液、气管试子、泄腹腔试子、粪便或者组织浸提液中核酸提取物为模板，选择H5亚型禽流感病毒HA基因的一段高度保守片段作为靶序列，所使用的特异性6条特异性引物如表I。其中，LF和LB分别是位于FlC和F2之间，BIC和B2之间的环引物，其作用是提高扩增效率，加快反应速率。表I H5亚型禽流感病毒RT-LAMP弓I物序列
权利要求
1.H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法所使用的特异性6条特异性引物，LF和LB分别是位于FlC和F2之间，BIC和B2之间的环引物，其引物序列为引物名称引物序列 Primer nameSequence (5'-3') H5-F3GGGAATTTAATACTTAGAAAGGAGA H5-B3CTTCGAAAACAGCGTACC H5-FIPATGAGAACCAGAAGTTCAGCATTAT-TAGAGAATTTAAACAGAAGATGGGA H5-BIPTAGACTTTCATGACTCAATTGTCCA-TGGCATATCCTAAGGCGTA H5-LFGTCAGACATCTAGGAATCCGTCTH5-LB_GAACTTTACGACAGGTCCGAC_
2.如权利要求I所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法,其特征在于，待测人或动物的分泌物、血清、尿液、气管试子、泄腹腔试子、粪便或者组织浸提液等试样的预处理，包括细胞裂解、核酸提取纯化、等温扩增均集成在微全分析系统(见图I)上自动完成，该微全分析系统由微膜片泵(阀)驱动，通过程序控制微膜片泵(阀)的开启与闭合实现微流体样品的驱动控制。
3.如权利要求2所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法，其特征在于，检测方法包括1)直接荧光目视法，在扩增反应前向体系中加入IU L钙黄绿素作为荧光指示剂，可直接通过肉眼观测结果，呈绿色的为阳性结果，呈较浅桔红色的为阴性结果；2)紫外光照射荧光目视法，在紫外光下照射下，呈红色荧光的为阳性结果，不显色的为阴性结果；3)凝胶电泳法，有明显梯形条带者为阳性结果，反之为阴性结果。
4.如权利要求3所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法，其特征在于，扩增反应的适宜时间为30-60min,优选时间为60min。
5.如权利要求4所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法，其特征在于，扩增反应的适宜温度为60-65°C，优选温度为64°C。
6.如权利要求5所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法，其特征在于，扩增反应所使用的甜菜碱浓度为甜菜碱浓度为5-15mmol/L，优选浓度为lOmmol/L。
7.如权利要求6所述H5亚型禽流感病毒环介导等温扩增微全分析方法，其特征在于，扩增反应所使用的MgSO4溶液浓度为10-1 OOmmoI/L,优选浓度为50mmol/L。
全文摘要
本发明提供一种检测H5亚型禽流感病毒的环介导等温扩增微全分析方法，在微膜片泵(阀)驱动的微全分析系统(见
图1)上，对试样中H5亚型禽流感病毒进行自动化预处理和核酸环介导等温扩增，步骤如下1)裂解；2)核酸提取及洗脱；3)核酸扩增。实现细胞裂解、核酸提取纯化、等温扩增等步骤均集成在微全分析系统上自动完成。可用直接荧光目视法、紫外光照射荧光目视法及凝胶电泳法等进行结果判定。与传统的RT-PCR方法相比，本发明的方法检测灵敏度可提高约103倍，检测时间从4-5小时缩短至约1小时内。
文档编号C12Q1/68GK102618670SQ20121011373
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者薛强, 邹明强 申请人:中国检验检疫科学研究院