专利名称：一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学分析技术领域，涉及一种定量检测病毒的方法，特别是一种一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法。
背景技术：
肾综合征出血热(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒属中的某些血清型病毒引起的一种以发热、出血、低血压休克和肾衰竭为主要临床特征的急性传染病。HFRS全球广泛流行，以中国的疫情最为严重，约占全球病例的90%，该病死亡率1% 15%左右。我国的主要流行型别为汉滩型(Hantaan Virus)和汉城型(SeoulVirus)。肾综合征出血热的基本病理改变为全身小血管和毛细血管广泛损害、通透性增加，然而其发病机制至今仍未阐明。汉滩病毒引起的肾综合征出血热是一个多因素参与的过程，汉坦病毒感染直接损伤以及病毒感染后引起的免疫病理损伤可能在疾病发生发展中共同发挥作用。汉坦病毒感染机体后，无论通过哪种致病机制引起疾病的发生，了解病毒载量在疾病过程中的动态变化规律及其与疾病严重程度的相关性，有助于了解在疾病进展中病毒与机体的相互作用以及病毒对机体的影响，为临床判断病情、制定合理的治疗方案及进一步深入研究HFRS的发病机制提供重要的实验依据。一步法实时荧光探针定量逆转录聚合酶链式反应是检测RNA病毒载量的灵敏度高、特异性好，操作安全简便的方法。汉坦病毒其他型别包括多普拉病毒(DobravaVires)、普马拉病毒(puumala Vires)及新诺伯病毒(Sin Nombre Vires)载量的一步法实时荧光探针定量逆转录聚合酶链式反应检测方法有研究报道，然而国内外至今未见汉滩病毒载量与疾病关系的研究，也未见一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，不仅可以定量检测，而且特异性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，非常适合于肾综合征患者血浆及其他组织或体液中汉滩病毒载量的定量检测。为了实现上述任务，本发明采用的技术解决方案是—步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，其特征在于，该方法利用汉滩病毒定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。所述的汉滩病毒定量检测标准品是用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒，体外转录获得76-118株S片段RNA，并通过紫外分光光度计对其准确定量，依据其分子量计算、出单位体积内的摩尔浓度作为标准品。所述的引物及探针的设计是在对汉滩病毒标准株及中国流行代表株A16及84Fli的S片段的序列比较分析的基础上，采用Primer 5. 0进行引物及探针的设计，引物对间距离为200bp长度以及引物与探针完全与目的片段互补，反转录引物选择随机六聚物，其中上游引物为5’-TACAGAGGGAAATCAATGCC-3’，下游引物为5’-TGITCAACTCATCTGGATCCTT-3’ ；探针为5’-(FAM)ATCCCTCACCTTCTGCCTGGCTATC(TAMRA)-3’。所述的一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法是以定量的体外转录RNA为标准品，调整至合适的浓度后，I 10倍比稀释10个梯度作为标准曲线，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，患者RNA提取标本为样本，PCR检测反应总体积为25 ii I，反应体系含样本3 ii I，一步法酶混合物0. 5 ii I，2 X缓冲液12. 5iU，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，lOOnmol/L探针，无RNA酶水补齐到25 ill ;real time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为42°C 15min,95°C :2min，然后 95°C 15s,53°C 30s, 72°C :30s，共 50 个循环，每次循环的72°C延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。采用本发明的方法，可以快速准确定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他组织中汉滩病毒载量，并且其特异性强，灵敏度高。因为这是一种以准确定量的体外转录76-118S片段RNA为标准品的一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应，体外转录76-118S片段RNA能实现准确定量，而且与单纯以质粒为标准品相比，体外转录标准品与样本经历完全一致的检测过程，减少了由于操作以及反应体系不一致带来的误差；采用一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应，将逆转录与实时定量聚合酶链式反应的两步反应简化为一步，减少了操作步骤以及由此产生的误差；在特异性引物的基础上，利用与目的片段完全互补的荧光探针作为检测信号指示系统，与没有序列特异性的荧光染料相比，检测的特异性进一步加强；聚合酶链式反应产物的指数增长特性使检测具有高度的灵敏性。
具体实施例方式本发明的设计思路是，利用汉滩病毒定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。汉滩病毒定量检测标准品是用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒(P⑶NA3. 0-76-118S)体外转录获得76-118株S片段RNA，并通过紫外分光光度计对其准确定量，结合其分子量计算出单位体积内的摩尔浓度作为标准品。调整至合适的浓度后，I 10倍比稀释10个梯度作为标准曲线。汉滩病毒定量检测标准品按如下步骤制备 (1)PCDNA3. 0-76-118S 质粒线性化PCDNA3. 0-76-118S 质粒 20 ii I (约含 10 y g)，缓冲液 5 y 1，BglII2. 5u 1，去离子水 22. 5 ill，反应条件 37 °C，2h ；(2)纯化酶切产物并定量酶切产物加入50 ill无RNA酶水，100 U I的苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中苯酹氯仿异戍醇=25 24 I ;13000rpm室温离心15min,吸取上清水相至新离心管，加入100 U I氯仿，13000rpm室温离心5min,吸取上清水相至新离心管,加入2. 5倍体积的无水乙醇，-80°C放置2h，然后以13000rpm、4°C，离心15min，弃上清，加入500 的质量分数为70 %的乙醇，13000rpm, 4 °C，离心15min，弃上清，室温干燥后加入50 无RNA酶水重悬，I 50稀释纯化后样本，紫外分光光度计260nm波长检测DNA含量；(3) 76-118S片段体外转录缓冲液25 U 1，线性化质粒20 U 1，体外转录酶5 U 1，37°C作用Ih ；(4)体外转录产物DNA酶去除与纯化加入无RNA酶的DNA酶，IU/ u g DNA, 37°C作用15min，加入等体积苯酚、氯仿和异戍醇混合物，其中，苯酹(pH 4. 5):氯仿异戍醇=125 24 I,混悬Imin,微量离心机13000rpm离心2min，吸取上层水相到另一个离心管，加等体积氯仿和异戊醇混合物，其中，氯仿异戍醇=24 I,混悬Imin,微量离心机13000rpm离心2min,吸取上层水相到另一个离心管，短暂离心10s，吸取底层相弃去，加0. I体积3M乙酸钠(pH5. 2)和等体积异戊醇/2. 5倍体积无水乙醇,混勻冰上放置5min, 13000rpm离心IOmin,小心倒掉上清,用ImL70%乙醇洗涤，13000rpm离心2min，倒掉上清，风干沉淀，20 无RNA酶水重悬，_80°C保存；(5)体外转录的RNA定量I 100稀释体外转录RNA样本，紫外分光光度计260nm波长检测RNA含量，依据检测的RNA含量计算每ml体外转录产物RNA样本的拷贝数，公式为copies/mL = 6. 02 X IO23X 1(T3XC/MW ;式中，C为浓度，丽表示体外转录RNA产物的分子量，即碱基数X3. 45X 102。引物及探针的设计是在对汉滩病毒标准株及中国流行代表株A16及84Fli的S片段的序列比较分析的基础上，采用Primer 5. 0进行引物及探针的设计，要求为软件评分高、引物对间距离为200bp长度以及引物与探针完全与目的片段互补，反转录引物选择随机六聚物。一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法是以定量的体外转录RNA为标准品，调整至合适的浓度后，I 10倍比稀释10个梯度作为 标准曲线，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，患者RNA提取标本为样本，PCR检测反应总体积为25 u 1，反应体系含样本3 u 1，一步法酶混合物0. 5 yl，2X缓冲液12. 5iU，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，100 nmol/L探针，无RNA酶水补齐到25 ill ;real time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为42°C 15min,95°C :2min，然后 95°C 15s,53°C 30s,72°C :30s，共 50 个循环，每次循环的72°C延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。以下是发明人给出的实施例实施例I :肾综合征出血热患者血浆中汉滩病毒载量的定量检测
用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒体外转录获得76-118株S片段RNA，紫外分光光度计对其准确定量，结合其分子量计算出单位体积内的摩尔浓度作为标准品；调整标准品浓度为IOltl拷贝/毫升，并I : 10倍比稀释10个梯度作为标准曲线。经过引物和探针的设计筛选后，反转录引物为随机六聚物，其中上游引物为5 ’ -TACAGAGGGAAATCAATGCC-3 ’ ；下游引物为5’ -TGITCAACTCATCTGGATCCTT-3’ ；探针为5，- (FAM) ATCCCTCACCTTCTGCCTGGCTATC (TAMRA) -3，。以定量的体外转录RNA为标准品，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，肾综合征出血热患者血浆RNA提取物为样本，PCR检测反应总体积为25 ill，反应体系含样本3 ill，一步法酶混合物0. 5 ill，2 X缓冲液12. 5 ill，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，lOOnmol/L探针，无RNA酶水补齐到25iil ；realtime PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为42°C 15min,95°C :2min，然后95°C 15s,53°C 30s, 72°C :30s，共50个循环，每次循环的72°C延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。经分析，该方法检测灵敏度为2700COpieS/mL血浆，特异性良好，汉城病毒L99株和常见病毒HBV、HCV、流感病毒不会引起假阳性，批内差异和批间差异分别为0. 6% 4. 5%和3. 9% 7. 3%，重复性好。除4名轻型患者外，肾综合征出血热患者急性期血浆中均能检测到病毒的存在，病毒载量在3. 43 7. 331ogl0 copies/mL之间。并发现①汉滩病毒载量在发热期、低血压休克期明显升高，随病程进展到少尿期迅速下降，多尿期与恢复期检测不到病毒载量，这与汉滩病毒感染的重要特征-自限性一致。②疾病早期重型/危重型患者血浆病毒载量高于轻型/中型患者(分别为5. 90和5. 031ogl0copies/mL ；P = 0. 001)，患者发热期/休克期病毒载量与血小板最低值呈负相关，与肌酐最高值呈正相关，提示汉滩病毒感染病毒载量与疾病严重程度相关。权利要求
1.一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，其特征在于，该方法利用汉滩病毒定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的汉滩病毒定量检测标准品是用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒，体外转录获得76-118株S片段RNA，并通过紫外分光光度计对其准确定量，依据其分子量计算出单位体积内的摩尔浓度作为标准品。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的引物及探针的设计是在对汉滩病毒标准株及中国流行代表株A16及84Fli的S片段的序列比较分析的基础上，采用Primer5.O进行引物及探针的设计，引物对间距离为200bp长度以及引物与探针完全与目的片段互补，反转录引物选择随机六聚物，其中 上游引物为5’ -TACAGAGGGAAATCAATGCC-3’ ； 下游引物为5’ -TGITCAACTCATCTGGATCCTT-3’ ；探针为5’ - (FAM)ATCCCTCACCTTCTGCCTGGCTATC (TAMRA)-3’。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法是以定量的体外转录RNA为标准品，调整至合适的浓度后，I 10倍比稀释10个梯度作为标准曲线，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，患者RNA提取标本为样本，PCR检测反应总体积为25 u I,反应体系含样本3iil，一步法酶混合物0. 5iil，2X缓冲液12. 5iU，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，100臟)1/1探针，无1 應酶水补齐到25111;代&1 time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为42°C 15min,95°C :2min，然后95°C 15s,53°C .30s, 72°C 30s,共50个循环，每次循环的72°C延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的汉滩病毒定量检测标准品按如下步骤制备 (1)PCDNA3.0-76-118S 质粒线性化 PCDNA3. 0-76-118S 质粒 20 yl (约含 10 y g)，缓冲液 5 yl，BglII2. 5u I,去离子水.22. 5111，反应条件371，211; (2)纯化酶切产物并定量 酶切产物加入50 ill无RNA酶水，100 u I的苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中苯酚氯仿异戍醇=25 24 I ;13000rpm室温离心15min,吸取上清水相至新离心管,加入.100 u I氯仿，13000rpm室温离心5min,吸取上清水相至新离心管,加入2. 5倍体积的无水乙醇，-80°C放置2h，然后以13000rpm、4°C，离心15min，弃上清，加入500 的质量分数为.70%的乙醇，13000rpm，4°C，离心15min，弃上清，室温干燥后加入50 无RNA酶水重悬，.1 50稀释纯化后样本，紫外分光光度计260nm波长检测DNA含量； (3)76-118S片段体外转录 缓冲液25iU，线性化质粒20iU，17启动子体外转录酶5iU，37°C作用Ih ； (4)体外转录产物DNA酶去除与纯化 加入无RNA酶的DNA酶，IU/ug DNA，37°C作用15min，加入等体积苯酚、氯仿和异戊醇混合物，其中，苯酹氯仿异戍醇=125 24 I,混悬Imin,微量离心机13000rpm离心2min，吸取上层水相到另一个离心管，加等体积氯仿和异戊醇混合物，其中，氯仿异戊醇=24 : I,混悬Imin,微量离心机13000rpm离心2min,吸取上层水相到另一个离心管,短暂离心10s，吸取底层相弃去，加0. I体积3M乙酸钠和等体积异戊醇/2. 5倍体积无水乙醇，混勻冰上放置5min, 13000rpm离心IOmin,小心倒掉上清,用ImL 70%乙醇洗漆，13000rpm离心2min，倒掉上清，风干沉淀，20 ill无RNA酶水重悬，-80°C保存； (5)体外转录的RNA定量 I 100稀释体外转录RNA样本，紫外分光光度计260nm波长检测RNA含量，依据检测的RNA含量计算每ml体外转录产物RNA样本的拷贝数，公式为copies/mL = 6. 02 X IO23X KT3X C/MW ; 式中，C为浓度，MW表示体外转录RNA产物的分子量，即碱基数X 3. 45 X IO2。
全文摘要
本发明公开了一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，该方法利用汉滩病毒的体外转录S全长片段作为定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。与常规PCR检测方法相比，具有标本检测操作步骤少，灵敏度高，并且具有良好的线性关系，实验表明本发明检测方法具有良好的特异性和重复性，将为肾综合征出血热的科学研究与防治提供有力工具。
文档编号C12Q1/68GK102634609SQ20121013210
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者刘志佳, 刘蓓, 周幸春, 宋朝君, 庄然, 张宇丝, 张赟, 張春梅, 徐竹蔚, 方亮, 易静, 李琦, 杨琨, 金伯泉, 陈丽华, 马樱 申请人:中国人民解放军第四军医大学