专利名称：一种人外周血免疫细胞库的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人外周血免疫细胞库的构建方法。
背景技术：
免疫细胞是指与免疫应答有关的所有细胞，主要包括T细胞、B细胞、杀伤细胞、自然杀伤细胞、单核细胞等。近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术已经慢慢的应用到了临床。如肿瘤疫苗和过继免疫疗法，这些方法主要是通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力，目前该类细胞主要有DC，CIK, NK, DC-CIK等。这些免疫细胞治疗都主要是取自患者自己的外周血，通过得到外周血单个核细胞然后经过一系列的操作来实现的，但是一般接受免疫细胞治疗的群体主要是肿瘤或病毒感染人群，一般此类人的年龄较大，并且患有疾病，其本身的免疫细胞的机能已经十分低下，此时分离出的免疫细胞的活性非常不理想。所以，在年轻时免疫能力强的时候分离出免疫细胞并保存起来具有非常大的意义。为了便于人们有效储存和使用组织和细胞资源，目前在世界范围内已经有多种细胞库或组织库建立，比如脐血造血干细胞库，间充质干细胞库等细胞库。所谓细胞库是在约为-196°C液氮中储存细胞及搜集相关资料的场所。然而，检索表明目前尚无人自体外周血免疫细胞库建立，因此，构建人成体外周血免疫细胞库，将人健康或者年轻时的免疫细胞通过一定方法建库，是充分保存和利用现有免疫细胞资源的有效方法，它为存储者本人在需要采用免疫细胞治疗技术时提供有力的支持，具有重要意义。目前，要冻存人外周血免疫细胞，通常是直接冻存人外周血单个核细胞。但是，人外周血单个核细胞成分复杂，既有免疫细胞又有非免疫细胞，即使是免疫细胞，也是多种类型细胞的组合，这些细胞对冻存条件要求各有不同，若将它们直接一起冻存，因冻存条件不是最适，冻存的单个核细胞复苏时活率十分不理想，不能满足临床要求。同时，目前冻存细胞的冻存液，一般都含有胎牛血清，胎牛血清含有多种蛋白，且和人体相比属于异种蛋白，应用上存在隐患。也有报道使用无血清冻存液，但无血清冻存液价格昂贵，且成分复杂，难以临床推广。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人外周血免疫细胞库的构建方法。本发明所述人外周血免疫细胞库的构建方法，步骤包括采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库；其特征在于所述人外周血采集前,供体应查体符合献血标准；、
所述分离自体血浆的方法是将采集的外周血转到离心管中，以1000-2500转/分钟离心5 15分钟，取上清液得到自体血浆，56°C灭活30分钟后，置_20°C冻存，备用；所述分离外周血单个核细胞的方法是将上述去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其0. 5 2倍体积量的lwt% 6wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置10 40分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，2000 5000转/分离心10 30分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞；所述分离单核细胞并冻存的方法是将得到的外周血单个核细胞按照0. I IOXlOVml的密度悬浮在组分为10 wt%FBS+90 wt%1640的培养基中，并按照30ml/瓶的量分装在灭菌的150cm2细胞培养瓶中，静置Ih 5h，然后吸取上清液，备用；剩余贴壁细胞即为单核细胞，用生理盐水或PBS将贴壁的单核细胞吹打下来，800 1500转/分离心5 10分钟后，以I IOX IO5的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6wt9^5乙基淀粉+84 wt%自体血浆； 所述分离T淋巴细胞的方法是采用免疫磁珠法对分离单核细胞收集的上清液进行T淋巴细胞分选，免疫磁珠法采用正分选法，抗体选用CD3抗体，分离出T淋巴细胞后800 1500转/分离心5 10分钟，再以0. I IOXlO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMS0+6 wt%甲基纤维素400CP+84 wt%自体血浆；所述分离B淋巴细胞的方法是继续用分离T淋巴细胞的方法对分离单核细胞收集的上清液进行B淋巴细胞分选，同样采用正分选法，抗体采用CD19或CD20，分离出B淋巴细胞后800 1500转/分离心5 10分钟，再以0. I IOXlO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMS0+6 wt%S旋糖酐40+84 wt%自体血浆；所述分离NK细胞的方法是继免疫磁珠法分离T和B淋巴细胞后，剩余的细胞即为NK细胞，将所述细胞800 1500转/分离心5 10分钟后，以0. I IOX IO6的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMS0+6 wt%海藻糖+84 wt%自体血浆；所述编码入库的方法是对分离并冻存的各种细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，用于管理与检索。上述人外周血免疫细胞库的构建方法中所述分离外周血单个核细胞的方法优选是将去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其0. 5倍体积量的4wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置30分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，3000转/分离心20分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞。本发明提供的人外周血免疫细胞库的构建方法把健康或青年人的免疫细胞分离出单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK样T细胞，并分别单独冻存，关联编号保存入库，使保存的人免疫细胞具有活性高、纯度高、使用方便的特点，并且在制备人外周单个核细胞时，本发明分离出人体血浆，用人自体血浆可以代替胎牛血清使用，避免了引入外源蛋白。本发明与现有技术相比，具有以下优点利用本发明建立的免疫细胞库，免疫细胞在冻存前处于最佳活性时刻，在保存人使用本库保存的免疫细胞进行自体免疫细胞治疗时，细胞活性比当时采血分离的免疫细胞活性要强。
利用本发明建立的免疫细胞库，库中保存的是各免疫细胞亚群，使用时更加方便，可以直接复苏某一亚群的免疫细胞来进行诱导，扩增。本发明方法具有成本低、实验室条件要求不高，应用前景广阔，并为临床或理论研究提供了大量的细胞资源基础。
图I本发明所述人外周血免疫细胞库的构建方法流程图。
具体实施方式
·实施例I人外周血免疫细胞库的构建方法( I )、采集人外周血对供着进行体检，按照献血标准对其进行检查，符合标准者两天后抽血；(2)、分离自体血浆将抽取的外周血转移到离心管中，在离心机中以1500转/分离心10分钟，取上清液，56°C灭活30分钟，完成后置_20°C冻存，备用。(3)、分离外周血单个核细胞将上述步骤去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其0. 5倍体积量的4wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置30分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，3000转/分离心20分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞。(4)、分离单核细胞并冻存将步骤3得到的单个核细胞按照0. 1-10XlOVml的密度悬浮在分为10wt%FBS+90wt%1640的培养基中，并按照30ml/瓶的量分装在灭菌的150cm2细胞培养瓶中，静置4h 5h，然后吸取上清液，备用；剩余贴壁细胞即为单核细胞。用生理盐水或PBS将贴壁的单核细胞轻轻吹打下来，1200转/分离心10分钟，后以I IOX IO5的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%羟乙基淀粉+84wt%自体血浆。(5)、分离T淋巴细胞采用免疫磁珠法分选出步骤4中吸取的上清液中的T淋巴细胞，免疫磁珠法采用正分选法，抗体选用CD3抗体，分离出T淋巴细胞后1200转/分离心10分钟，后以0. I IOXlO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%甲基纤维素400CP+84wt%自体血浆。(6)、分离B淋巴细胞继续用分离T淋巴细胞的方法对分离单核细胞收集的上清液进行B淋巴细胞分选，同样采用正分选法，采用抗体为CD19或CD20，分离出B淋巴细胞后1200转/分离心10分钟，后以0. I-IOXlO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%右旋糖酐40+84wt%自体血浆。(7)、分离NK细胞继免疫磁珠法分离T和B淋巴细胞后，剩余的细胞为NK细胞，将所述细胞1200转/分离心10分钟后，以0. I IOX IO6的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%海藻糖+84wt%自体血衆。(8)、编码入库对分离并冻存的各种细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，用于管理与检索。实施例2人外周血免疫细胞库的构建方法( I )、采集人外周血对供着进行体检，按照献血标准对其进行检查，符合标准者两天后抽血；
(2)、分离自体血浆将抽取的外周血转移到离心管中，在离心机中以2500转/分离心5分钟，取上清液，56°C灭活30分钟，完成后置_20°C冻存，备用。(3)、分离外周血单个核细胞将上述步骤去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其I倍体积量的3wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置40分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，4000转/分离心15分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞。(4)、分离单核细胞并冻存将步骤3得到的单个核细胞按照0. 1-10XlOVml的密度悬浮在分为10wt%FBS+90wt%1640的培养基中，并按照30ml/瓶的量分装在灭菌的150cm2细胞培养瓶中，静置5h，然后吸取上清液，备用；剩余贴壁细胞即为单核细胞。用生理盐水或PBS将贴壁的单核细胞轻轻吹打下来，1500转/分离心5分钟，后以I 10 X IO5的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%羟乙基淀粉+84wt%自体血浆。(5)、分离T淋巴细胞采用免疫磁珠法分选出步骤4中吸取的上清液中的T淋巴细胞，免疫磁珠法采用正分选法，抗体选用CD3抗体，分离出T淋巴细胞后1500转/分离心 5分钟，后以0. I IOX IO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%甲基纤维素400CP+84wt%自体血浆。(6)、分离B淋巴细胞继续用分离T淋巴细胞的方法对分离单核细胞收集的上清液进行B淋巴细胞分选，同样采用正分选法，采用抗体为CD19或CD20，分离出B淋巴细胞后1500转/分离心5分钟，后以0. 1-10 X IO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%右旋糖酐40+84wt%自体血浆。(7)、分离NK细胞继免疫磁珠法分离T和B淋巴细胞后，剩余的细胞为NK细胞，将所述细胞1500转/分离心5分钟后，以0. I IOX IO6的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10wt%DMS0+6wt%海藻糖+84wt%自体血衆。(8)、编码入库对分离并冻存的各种细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，用于管理与检索。
权利要求
1.一种人外周血免疫细胞库的构建方法，步骤包括采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库；其特征在于 所述人外周血采集前，供体应查体符合献血标准； 所述分离自体血浆的方法是将采集的外周血转到离心管中，以1000-2500转/分钟离心5 15分钟，取上清液得到自体血浆，56°C灭活30分钟后，置_20°C冻存，备用； 所述分离外周血单个核细胞的方法是将上述去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其0. 5 2倍体积量的lwt% 6wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置10 40分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，2000 5000转/分离心10 30分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞； 所述分离单核细胞并冻存的方法是将得到的外周血单个核细胞按照0. I 10X107/ml的密度悬浮在组分为10 wt%FBS+90 wt%1640的培养基中，并按照30ml/瓶的量分装在灭菌的150cm2细胞培养瓶中，静置Ih 5h，然后吸取上清液，备用；剩余贴壁细胞即为单核细胞，用生理盐水或PBS将贴壁的单核细胞吹打下来，800 1500转/分离心5 10分钟后，以I IOXlO5的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 Wt%DMS0+6Wt°/c^5乙基淀粉+84 wt%自体血楽； 所述分离T淋巴细胞的方法是采用免疫磁珠法对分离单核细胞收集的上清液进行T淋巴细胞分选，免疫磁珠法采用正分选法，抗体选用CD3抗体，分离出T淋巴细胞后800 1500转/分离心5 10分钟，再以0. I IOXlO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%甲基纤维素400CP+84 wt%自体血浆； 所述分离B淋巴细胞的方法是继续用分离T淋巴细胞的方法对分离单核细胞收集的上清液进行B淋巴细胞分选，同样采用正分选法，抗体采用⑶19或⑶20，分离出B淋巴细胞后800 1500转/分离心5 10分钟，再以0. I IOX IO7的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%S旋糖酐40+84 wt%自体血浆； 所述分离NK细胞的方法是继免疫磁珠法分离T和B淋巴细胞后，剩余的细胞即为NK细胞，将所述细胞800 1500转/分离心5 10分钟后，以0. I IOX IO6的密度进行分装并液氮冻存，冻存液配方为10 wt%DMSO+6 wt%海藻糖+84 wt%自体血浆； 所述编码入库的方法是对分离并冻存的各种细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，用于管理与检索。
2.如权利要求I所述人外周血免疫细胞库的构建方法，其特征在于所述分离外周血单个核细胞的方法是将去除自体血浆后的沉淀物按体积量计用生理盐水或PBS稀释I倍，再加入其0. 5倍体积量的4wt%的羟乙基淀粉溶液，混匀后静置30分钟，分离出上清，并将上清液加入到等体积量的淋巴细胞分离液液面上，3000转/分离心20分钟，离心后管内分三层，取中间层细胞即得到外周血单个核细胞。
全文摘要
本发明公开了一种人外周血免疫细胞库的构建方法，步骤包括采集人外周血，分离自体血浆，分离外周血单个核细胞，由外周血单个核细胞分离单核细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离T淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离B淋巴细胞并冻存，由外周血单个核细胞分离NK细胞并冻存，编码入库。本发明把健康或青年人的免疫细胞分离出，并分别单独冻存，关联编号保存入库，使保存的人免疫细胞具有活性高、纯度高、使用方便的特点，并且用人自体血浆可以代替胎牛血清使用，避免了引入外源蛋白。同时本发明方法具有成本低、实验室条件要求不高，应用广的优势。
文档编号C12N5/0783GK102758259SQ20121026973
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者李财新, 王肇光, 田甜, 蔡平平, 薛书奎, 邢晓, 陈莉 申请人:济南赛尔生物科技有限公司