专利名称：白地霉zjb-09214及在生物催化合成l-色氨酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及色氨酸合成方法，特别涉及一种产酰胺酶的新菌种一白地霉 ZJB-09214 (Geotrichum candidum ZJB-09214)及在生物催化制备L-色氨酸中的应用。背景技术：
酰胺酶(Amidase，EC3. 5. I. 4)是一类催化酰胺C-N键水解生成相应羧酸和氨的重要生物催化剂。酰胺酶底物谱广，能高效催化各种非天然脂肪族、杂环及芳香族酰胺的水解，并具有高度化学选择性、区域选择性、立体选择性和不需辅酶等优点，在制备复杂结构手性羧酸及酰胺衍生物中具有独特优势。因此，获得酰胺酶新酶源在手性生物合成中具有十分重要的价值。
目前已报道的酰胺酶产生菌主要为Rhodococcus、Bacillus、Pseudomonas、 Paracoccus、Comamonas、Pseudonocardia 等细菌(Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 2009,8: 343-366)ο仅Prasad和Linardi等报道了少数产酸胺酶的酵母如Kluyveromyces thermotolerans、 Candida famata 等(World J. Microbiol. Biotechnol. 2005,21: 1447-1450, FEMS Microbiol. Lett. 1996, 15:67-71)。
色氨酸化学名为α -氨基-β -吲哚丙酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。 L-色氨酸是人和动物所需的重要限制性氨基酸之一，参与肌体蛋白质合成和代谢网络调节，在生长发育中发挥着重要作用。因此，L-色氨酸被广泛用于医药、饲料和食品等行业， 是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三大饲料添加用氨基酸。通过添加L-色氨酸，能够调节日粮中氨基酸的平衡，促进禽畜的生长。L-色氨酸生产方法主要有发酵法、化学合成法和酶促转化法。发酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用谷氨酸棒杆菌、枯草杆菌生产 L-色氨酸，但合成途径长，代谢流较弱，且需多种前体物质。化学合成法主要有直接以吲哚为原料及在合成过程中生成吲哚两大类。该法反应条件复杂，周期长，污染严重，不宜工业化生产。酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，是生产廉价 L-色氨酸的有效方法。酶促工艺中涉及的酶催化剂主要有氨基酸酰化酶、转氨酶、海因酶、 色氨酸酶、丝氨酸消旋酶和色氨酸合成酶等。
发明内容
本发明目的是提供一种新菌株——白地霉ZJB-09214，及其在生物转化制备L-色氨酸中的应用。
本发明采用的技术方案是
白地霉ZJB-09214 (Geotrichum candidum ZJB-09214)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2012年3月7日，保藏编号CCTCC No M 2012063。
本发明所述白地霉ZJB-09214是通过以下程序筛选得到的
I)将从浙江省杭州市周边地区采回的土样1.0 g加入生理盐水中，用振荡器充分打散均匀并接种到富集培养基，在30°C、150 rpm下，摇床培养4飞天后，移取2 ml富集培养液转入新鲜的富集培养基中，再在同样条件下培养4 5天，如此重复3 4次；富集培养基终浓度组成为(g/L):葡萄糖 6. (KK2HPO4 2. O, NaCl I. O、MgSO4 · 7H20 O. 2、FeSO4 · 7H200.01、生物素O. 001、盐酸硫胺O. 001、丙烯酰胺2.0，pH 7.0，溶剂为水。
2)取最后一次富集培养液用质量浓度O. 85%生理盐水稀释IO6IOki倍后涂布到平板培养基上，在30°C培养2天，挑取单菌落接种至斜面培养基，在30°C培养2天，获得菌体斜面。平板培养基为富集培养基中加入质量浓度I. 7%的琼脂。斜面培养基终浓度组成为(g/L) =KH2PO4 I. O, MgSO4 · 7H20 O. 5，NaNO3 2. O, KCl O. 5，FeSO4 O. 01，蔗糖 30. 0，琼脂 18. 0，pH为7.0，溶剂为水。
3)挑取一接种环斜面菌体接种至发酵培养基，在25 45°C、10(T300 rpm下，摇瓶培养48 72小时，将发酵液离心，获得湿菌体(即沉淀)和上清液。然后根据浙江工业大学郑裕国等(Appl. Microbiol. Biotechnol. , 2007, 74 :256_262)所述的立体选择性酸胺酶筛选方法进行产酰胺酶菌株的筛选，最终获得产酰胺酶菌株一白地霉ZJB-09214。发酵培养基终浓度组成为(g/L):葡萄糖10.0 20.0，酵母膏5. 0 10. 0，蛋白胨2. 0 5. 0，K2HPO41.0 2· O, KH2PO4 I. 0 2· O, MgSO4 · 7Η20 0. 2 0. 5，FeSO4 · 7Η20 0. θΓθ. 05，NaCl I. 0 3· O,乙酰胺I. 0 3· O, pH 6. 0 8· 5，溶剂为水(121 0C下，灭菌20 min)；
本发明所述白地霉Z JB-09214的鉴定
a)菌株形态和生理生化特征
I)形态特征
菌落形态28 °C培养5天，在PDA培养基上菌落呈平面扩散，直径4 cm左右，扁平，短绒状，有同心圆，呈放射状，中心突起。
菌丝形态有真菌丝，两支分叉，横隔少。节孢子连接成链，椭圆形，末端圆钝。
2)生理生化特征见表I。
表I白地霉ZJB-09124的生理生化特征
权利要求
1.白地霉ZJB-09214(Geotrichum candidum)保藏于中国典型培养物保藏中心，地址 中国武汉武汉大学，保藏日期2012年3月7日，保藏编号CCTCC No M 2012063。
2.权利要求I所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述的应用为以外消旋色氨酰胺为底物，以白地霉ZJB-09214发酵培养获得的酶为酶源， 于pH 6. 5、. O的缓冲溶液存在的反应体系中，在20 45°C下转化反应获得的转化反应液即为含L-色氨酸的混合液，将混合液分离纯化得到L-色氨酸。
3.如权利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述酶源为以白地霉ZJB-09214发酵培养获得的含湿菌体发酵液离心后取得的上清液为酶源。
4.如权利要求3所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述酶源按如下方法获得将白地霉ZJB-09214接种于发酵培养基中，25 45°C 下，10(T300 rpm振荡培养48 72小时，获得含湿菌体的发酵液，将发酵液离心，弃去沉淀，取上清液，即获得酶源；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖10. (Γ20. Og/L，酵母粉8.0 16· O g/L，蛋白胨 2. 0 5· O g/L, K2HPO4 O. 5 2. O g/L,KH2PO4 O. 5 2. O g/L,MgSO4 ·7Η200.2 O. 5 g/L, NaCl I. 0 3· O g/L，乙酰胺 3· 0 8· 0 g/L, pH 6· 0 8· 5，溶剂为水。
5.如权利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述pH 6. 5^9. O的缓冲溶液为pH 6. 5^7. 8的磷酸盐缓冲溶液或pH 7. 4^9. O的 Tris-HCl缓冲溶液。
6.如权利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述反应体系中还添加有机溶剂，所述有机溶剂为下列之一石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚或异辛烷。
7.如权利要求6所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述有机溶剂的体积用量是反应体系总体积的5 30%。
8.如权利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述底物初始浓度为6 20 g/L。
9.如权利要求3所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液离心前发酵液中湿菌体的菌体干重计为1.25 5. O g/L ο
10.如权利要求2所述白地霉ZJB-09214在生物催化合成L-色氨酸中的应用，其特征在于所述应用按如下步骤进行(I)斜面培养将白地霉ZJB-09214单菌落接种至斜面培养基，于30°C恒温培养48 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂18 g/L，溶剂为水，自然pH值；(2)发酵培养取一接种环斜面菌体接种至发酵培养基，于25°C、300 rpm振荡培养72 h，获得含湿菌体的发酵液，将发酵液离心，弃去沉淀，获得上清液；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖15. (Γ20. Og/L,酵母粉 10. 0 16· O g/L，蛋白胨 3. 0 5· O g/L, K2HPO4 O. 5 I. 5 g/L, KH2PO4 O. 5 I. 5 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 3 g/L, NaCl I. 0 2· O g/L,乙酰胺 4. 0 8· O g/L, pH 6. 0 8· 5，溶剂为水；(3)转化反应将外消旋色氨酰胺和步骤(2)获得的上清液加入pH 6. 5^9. O的缓冲溶液中，和/或加入有机溶剂构成反应体系，在20 40°C下转化反应:Γ6 h，反应结束后，获得的转化反应液即为含L-色氨酸的混合液，将混合液分离纯化获得所述L-色氨酸；所述底物初始浓度为18 g/L，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液离心前发酵液中湿菌体的菌体干重计为I. 9^4. 75 g/L ;所述有机溶剂的体积用量是反应体系总体积的5 30% ;所述有机溶剂为石油醚、正己烷、环己烷、甲基叔丁基醚或异辛烷中的一种。
全文摘要
本发明公开了一种白地霉ZJB-09214及在生物催化合成L-色氨酸中的应用，所述的应用以外消旋色氨酰胺为底物，以白地霉ZJB-09214发酵培养获得的上清液a为酶源，于pH 6.5~9.0的缓冲溶液中构成反应体系，在20~ 45℃下转化反应2~8 h，转化率大于40%，光学纯度大于99%；本发明提供了一种产胞外酰胺酶的白地霉ZJB-09214新菌株，酶活回收容易；利用该菌株所产胞外酰胺酶可制备高光学纯度的L-色氨酸，反应条件温和，环境友好。
文档编号C12R1/645GK102936571SQ20121043581
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者郑裕国, 郑仁朝, 沈寅初 申请人:浙江工业大学