专利名称：一种原代细胞大规模继代培养的方法
技术领域：
本发明涉及在生物制品领域中原代细胞大规模继代培养的方法，具体说是一种将原代细胞通过一定的技术手段培养并筛选出保持其细胞二倍体生物学性状的，高活力的继代细胞(指自组织分离后体外培养不超过5代细胞)，并利用生物反应器或细胞工厂方式实现大规模培养的方法。
背景技术：
目前，国内外已有许多关于利用生物反应器，微载体及细胞工厂培养动物细胞的报道。细胞微载体培养方法是由Van Wezel于1967年构思发明的，经过40年来人类大量的摸索，该技术已经日趋成熟和完善，并广泛应用于生物工程领域以及一些具有重要价值的细胞产品。微载体细胞培养技术具有许多传统细胞培养技术无法取代的优势，例如在生 物反应器中，微载体增加了单位容积中的表面积；为细胞提供了均相的生长环境；环境条件容易测量与监控；细胞培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。但该技术主要用于传代细胞系的培养，但用于原代细胞培养，因无法批量获得保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的细胞，限制了其大规模生产应用。原代细胞可用于生产狂犬疫苗、乙脑疫苗、流感疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗和流行性出血热病毒疫苗等，这些疫苗的生产需要使用大量动物，而传统的细胞培养技术不能完全排除外源因子污染的可能，质量难以控制，制约了疫苗制品的规模化生产。基于上述原因，也限制了原代细胞或其继代细胞在生物制品生产中无传代细胞系潜在致肿瘤性风险优势的应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是一种原代细胞大规模继代培养的方法。本发明是一种原代细胞大规模继代培养的方法，在本发明中用来培养的原代细胞是本领域技术人员所熟悉的那些原代细胞，例如猴肾细胞、地鼠肾细胞、家兔肾细胞、鸡胚细胞、沙鼠细胞、牛肾细胞等。该方法包括下列步骤a)批量获取保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞(指自组织分离后体外培养不超过5代细胞)；b)适于利用生物反应器或细胞工厂细胞的筛选；c)利用生物反应器或细胞工厂大规模培养筛选出的细胞。在本发明中，批量获取保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞的培养方法如下来源于动物机体组织的细胞在利用转瓶培养的方法初代培养成功后，要保持其在反复传代中不发生转化或不停止生长其措施是严格控制pH值(7. 2 . 4之间)；最好在5%C02 (指CO2浓度)环境中培养；并最好根据原代细胞的种类及分化程度，在转瓶的内表面包被胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等；严格控制换液时间，不宜太长(最长8天或连续灌注)，换液时，不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉1/2 2/3为宜；细胞生长至75、5%汇合阶段即按一分为二的原则进行传代；培养液与液面以上空间的体积比例保持在1:8 1:12之间；加入培养液的高度要控制在8mm以下。利用上述方式获得的细胞含有细菌、真菌、支原体、外源病毒的潜在可能性较大，其生物学性状改变或活力不够的可能性也较大。因此，利用生物反应器或细胞工厂立即进行大规模扩增，失败的风险性很高，导致其不能实现工业化应用，必须进行细胞的鉴别与筛选，其措施如下a)原代细胞培养物细菌、真菌、支原体、病毒等外源污染检测，可采取《中国药典》收载的常规检测 方法，更适宜采用检测时间短的酶标等替代方法，b)用乳糖脱氢酶法测定乳糖浓度，用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度，通过葡萄糖消耗来判定原代动物细胞的生长状态；c)细胞损伤检测，通过细胞损伤检测来调整批量获取高活力的继代细胞的操作工艺参数，是不同种类及分化程度原代细胞利用生物反应器或细胞工厂进行大规模培养成功的重要条件之一，该项检测在确定某一具体细胞培养工艺时，十分必要。根据用正常不能渗透的大分子示踪剂标记细胞质的原理鉴别受伤细胞。细胞膜破裂，示踪剂进入细胞质，然后破裂处封闭，示踪剂位于细胞内。死细胞的细胞膜破裂后不能封闭，只要洗去全部外源性示踪剂则不被标记。有几种示踪剂供选择。荧光素标记的右旋糖酐比较适宜。如果使用醛固定的标本，须用结合有赖氨酸的右旋糖酐。外加性示踪剂的优点是已知加入和除去示踪剂的时间，如荧光素标记的右旋糖酐。因此可用于脉冲追踪标记方案，以便确定细胞损伤时间的选择。定义与鉴定细胞损伤的标准(A)机械性应力引起细胞膜破裂；(B)正常情况下不能渗透的分子可通过破裂处进出细胞；(C)损伤处迅速封闭(< 5s，受钙离子介导的细胞膜移动和融合的调节)，细胞存活；(D)在存在损伤示踪分子(正常情况下不能渗透)条件下发生细胞破裂时；(E)示踪分子进入细胞内；(F)细胞膜封闭时，示踪分子滞留于细胞。如果在显微镜测定或荧光方面可观察到损伤示踪剂，能鉴定受伤细胞。经过上述两个步骤进行培养筛选的细胞可立即利用生物反应器或细胞工厂进行大规模扩增，也可冻存为种子细胞，用于生产时，解冻一支或数支，这样可以实现一批冻存细胞进行长期生产使用，实现大规模工业化生产的目的。筛选出的细胞利用生物反应器或细胞工厂大规模培养的措施是选取细胞工厂或剪切力小的固定床篮式培养系统的生物反应器进行原代细胞大规模继代培养，选取连续灌注方式，以获得保留一部分旧培养液培养效果，其它培养参数设定也应选取较连续传代细胞系更温和的培养条件。本发明的效果是利用a)批量获取保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞(指自组织分离后体外培养不超过5代细胞)；b)适于利用生物反应器或细胞工厂细胞的筛选；c)利用生物反应器或细胞工厂大规模培养筛选出的细胞三个步骤中全部或大部分操作工艺达到原代细胞大规模继代培养的目的。本发明与现有转瓶培养原代细胞方式比较，生物反应器综合可比因素分析对比，用本发明的产量比现有技术中的转瓶方法提高了 100倍以上，可以达到传代细胞系利用生物反应器达到的产量；细胞工厂综合可比因素分析对比，用本发明的产量比现有技术中的转瓶方法提高了 10倍以上，不仅提高了培养原代细胞单位体积的细胞培养率，还提高了原代细胞的质量，将此技术应用于疫苗制品的生产，也会提高疫苗制品的产品质量和生产规模及生产效率。
具体实施例方式以下的实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。实施例一地鼠肾细胞筛选及利用生物反应器及以聚酯切片为载体培养
在本发明的实施方案中，所述细胞为原代地鼠肾细胞经转瓶继代培养一代后；采用总体积为5升的生物反应器(Cellige n Plus 生物反应器,购自New Brunswick ScientificCo.，Inc.公司)和聚酯切片载体(Fibra-Cel Disks);所用的培养基是M199培养基或DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、胰酶等。I、将地鼠解剖取肾细胞，用胰蛋白酶进行消化，制得原代细胞；严格控制pH值为7.2 ;将盖有透气塞的三L转瓶置于37°C，5%co2环境中培养，三L转瓶内表面经O. Γ mg/ml的多聚赖氨酸包被后,用无Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；换液时间为4天，换液时,保留1/3旧培养液，细胞生长至95%汇合阶段即按一分为二的原则进行传代，培养液与液面以上空间的体积比例保持在1:10，加入培养液的高度要控制在4mm。2、采取《中国药典》收载的常规检测方法对原代细胞培养物细菌、真菌、支原体、病毒等外源污染检测；用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度，通过葡萄糖消耗来判定原代动物细胞的生长状态；细胞损伤检测将待检细胞放于无菌的盖玻片上，用适量细胞培养液培养至单层，用无菌Dulbecco磷酸盐水浸先一次；将盖玻片细胞面朝上放于培养皿中，将5mg/mlFDxLys溶液(100 μ I)注于盖玻片上面，然后吸去，如此反复几次；模拟工艺操作参数建立可引起细胞损伤的实验条件，不要干扰阴性对照；作为阳性对照，用单刃剃须刀刮盖玻片约10次后用位相差显微镜观察，以确保用此方法从底物上刮除细胞；受伤细胞后示踪剂处理时间应尽量短，再用无菌Dulbecco磷酸盐水浸先一次，然后加入培养液，将培养皿放入培养箱，使细胞在理想时间内尽快恢复正常状态；用无菌Dulbecco磷酸盐水将盖玻片清洗3次,然后用3. 7%甲醛浸泡10 — 30min ;用注射用水将盖玻片洗2次,然后用抗漂白封固液封片，在突光显微镜下观察。3、通过上述1、2项操作，剔除不合格细胞，然后以IX l(TlX IO7个细胞/ml的密度接种于装有聚酯切片载体的生物反应器内；接种后，使搅拌速度调节为90rpm，在37°C下培养5-8天，培养期间补加新鲜的培养基，使培养基中葡萄糖含量保持在5克/升。调节02，N2，C02气体的流速，培养期进行检测。乳糖浓度，用乳糖脱氢酶法测定；葡萄糖浓度，用葡萄糖氧化酶法测定，通过葡萄糖消耗来判定地鼠肾细胞的生长状态。实施例二 鸡胚细胞筛选及利用细胞工厂方式培养
在本发明的实施方案中，所述细胞为原代鸡胚细胞转瓶继代培养一代后；采用ThermoScientific Nunc细胞工厂(10层，培养面积6320cm2，工作容量2000ml)对鸡胚细胞进行培养；所用的培养基是M199培养基或DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、胰酶等。I、将9日龄鸡胚去头、脚后解剖，用胰蛋白酶进行消化，制得原代细胞；严格控制PH值为7. 2 ;将盖有透气塞的三L转瓶置于37°C，5%co2环境中培养，三L转瓶内表面经O. Γ1 mg/ml的多聚赖氨酸包被后,用无Ca2+, Mg2+的BSS浸洗平衡；换液时间5天，换液时，保留一部分旧培养液，以弃掉1/2，细胞生长至95%汇合阶段即按一分为二的原则进行传代，培养液与液面以上空间的体积比例保持在1:10，加入培养液的高度要控制在4mm。
2、细胞质量筛选措施同实施例一。3、通过上述实施例二 1、2项操作，剔除不合格细胞，然后以1Χ1(Τ6Χ104个细胞/ml的密度接种于Nunc细胞工厂内；在37°C下培养5 8天，培养期间补加新鲜的培养基，使培养基中葡萄糖含量保持在2-2. 5克/升。乳糖浓度，用乳糖脱氢酶法测定；葡萄糖浓度，用葡萄糖氧化酶法测定，通过葡萄糖消耗来判定鸡胚细胞的生长状态。本发明的特点是
培养用的细胞可以为猴肾细胞、地鼠肾细胞、家兔肾细胞、鸡胚细胞、沙鼠细胞、牛肾细胞等原代动物细胞，取材广泛；
克服了传统原代细胞培养技术外源污染的风险高，质量难以控制，制约了生物制品的规模化生产的缺点。批量获取与筛选保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞，使细胞的生长空间增大，提高了培养效率， 充分利用了培养基中的营养成分；同时，又使细胞在均一的环境下生长，保证了细胞的质量，原代细胞经自组织分离后体外培养不超过5代的继代扩增，大大降低了活体动物的使用量，将此技术应用于生物制品的生产，将会提高生物制品的产品质量和生产规模及生产效率，既可以造福于人类，又具有巨大的商业价值。
权利要求
1.一种原代细胞大规模继代培养的方法，其步骤是 (1)批量获取保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞； (2)对步骤(I)获取的继代细胞，进行筛选； (3)利用生物反应器或细胞工厂大规模培养步骤(2)筛选出的继代细胞。
2.根据权利要求I所述的原代细胞大规模继代培养的方法，其特征在于，所述原代细胞是猴肾细胞、地鼠肾细胞、家兔肾细胞、鸡胚细胞、沙鼠细胞、牛肾细胞、狗肾细胞中的一种。
3.根据权利要求2所述的原代细胞大规模继代培养的方法，其特征在于，在步骤(I)中，来源于动物机体组织的细胞在利用转瓶培养的方法初代培养成功后，保持其在反复传代中不发生转化或不停止生长其措施是 (I. I)控制pH值为7. 2 7. 4; (I. 2)在5%C02环境中培养； (I. 3)根据原代细胞的种类及分化程度在转瓶内表面包被胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白； (I. 4)换液间隔时间最长为8天，或连续灌注，换液时，弃掉1/2 2/3旧培养液； (I. 5)细胞生长至75、5%汇合阶段即按一分为二的原则进行传代； (I. 6)培养液与液面以上空间的体积比例保持在1:8 1:12之间，加入培养液的高度控制在8mm以下。
4.根据权利要求2所述的原代细胞大规模继代培养的方法，其特征在于，步骤(2)所说的筛选的措施是 (2. I)原代细胞培养物细菌、真菌、支原体、病毒外源污染检测； (2. 2)用乳糖脱氢酶法测定乳糖浓度，用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度，通过葡萄糖消耗来判定原代动物细胞的生长状态； (2. 3)细胞损伤检测，通过细胞损伤检测来调整批量获取高活力细胞操作工艺参数。
5.根据权利要求2所述的原代细胞大规模继代培养的方法，其特征在于，步骤(3)所说的大规模培养的措施是选取细胞工厂或剪切力小的固定床篮式培养系统生物反应器进行原代细胞大规模继代培养。
全文摘要
本发明提供了一种原代细胞大规模继代培养的方法，该方法包括下列步骤a)批量获取保持其细胞二倍体生物学性状的、高活力的、适于利用生物反应器或细胞工厂的继代细胞；b)适于利用生物反应器或细胞工厂细胞的筛选；c)利用生物反应器或细胞工厂大规模培养筛选出的细胞。该方法解决了原代细胞用于生产需要使用大量动物，外源污染风险高，质量难以控制，规模化生产困难问题，同时也发挥了原代细胞或其继代细胞在生物制品生产中无传代细胞系潜在致肿瘤性风险的优势。
文档编号C12N5/071GK102965333SQ201210537870
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者李伟, 苏文全 申请人:李伟, 苏文全