专利名称：一种促进植酸酶在毕赤酵母中表达的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及ー种含翻译调控因子Hacl的表达载体及含有该载体的毕赤酵母工程菌。
背景技术：
蛋白质的异源表达是常用分子生物学领域研究的重点之一；特别是对于エ业化生产而言，超水平表达是提高生产效率和节省成本的关键手段之一。蛋白质异源表达的宿主很多，有原核微生物，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等；也有真核微生物，如毕赤酵母和里氏木霉等。原核生物具有代时短，生长快的优点；但是去缺乏胞内翻译后修饰系统。因此，原核生物的异源表达蛋白往往没有活性，或者说表达水平很低(张小霞等，2004，国外医学卫生学分册)。而真核微生物具有翻译后修饰系统，同时往往又具有分泌表达和高密度发酵的优势；因此，越来越多的真核微生物被开发来应用于生产エ业酶和食品酶等。无论是学术研究还是规模化工业生产，毕赤酵母(Pichia pastoris)是最常用的真核表达系统之一(Porro等,2005, Mol.Biotechnol.)。但是，毕赤酵母的蛋白质表达水平非常低，多数工程菌胞外分泌的目的蛋白含量约为 8g/L (Niebaur 等，2005, Protein expression technologies)。有很多因素影响蛋白质表达水平，如启动子，拷贝数，信号肽、密码偏爱性，翻译修饰和发酵エ艺等(Payne等2008, Appl.Environ.Microbiol.)。但是,研究发现毕赤酵母胞内的很多促进蛋白质折叠，囊泡运输和跨膜运输的因子能显著提高蛋白质的表达水平。只有正确折叠的蛋白质才能运输到胞外。如果外源蛋白翻译后不能正确折叠，贝U会引起蛋白非正确反应，简称UPR反应(unfolded protein response,简称UPR)。UPR会抑制转录和反应；同时促进错误折叠蛋白质的降解，从而影响蛋白质表达水平(Alimjan,2010，Appl Microbiol BiotechnoD0 UPR反应能调控胞内很多与蛋白表达相关因子的表达，如分子伴侶，折叠酶、囊泡运输相关的激酶和转录因子HaclP等(Mouna,2010,Microbial Cell Factories ),其中 HaclP 能促进蛋白质表达(Saloheimo, 2003，Mol.Microbiol)。HaclP的表达是受到UPR严格调控的。Hacl_mRNA是组成型表达的，但是其内部含有I个内含子；只有内含子被剪切后，Hacl-mRNA才能正确表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种含翻译调控因子Hacl的表达载体，并通过将该表达载体导入产外源植酸酶的毕赤酵母工程菌，构建得到新的工程菌。所述工程菌中外源植酸酶的表达水平得到了显著提高，具有广泛的应用前景。本发明一方面提供一种用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体。上述翻译调控因子Hacl基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。上述翻译调控因子Hacl基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:3。
上述表达载体为毕赤酵母表达质粒pGAPZ。
本发明还提供一种提高植酸酶在毕赤酵母工程菌中表达的方法，是将上述的表达载体转入表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中，形成新的重组工程菌。上述的重组工程菌为毕赤酵母SDLH-1 (Pichia pastoris SDLH-1),已于2012年12月5日保藏于位于武汉珞珈山武汉大学的“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCN0:M 2012503。本发明还提供了上述毕赤酵母工程菌SDLH-1的应用，用于高效表达外源植酸酶。本发明构建了一个表达翻译调控因子Hacl基因的表达载体，同时将该载体导入产植酸酶的毕赤酵母工程菌，得到新的工程菌。该工程菌表达植酸酶的水平得到显著提高，表达量提高17%以上。
图1:本发明构建的用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体的质粒遗传图谱。
具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1: Hacl基因的克隆1.1总DNA的提取将毕赤酵母过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min,弃上清；加入 400ii I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS) ; 95°C加热5min，然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u I IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm离心lOmin，取上清;加入2倍体积的无水こ醇，-20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%こ醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20°C保存。1.2基因克隆采用融合PCR方法克隆基因，相应的Taq酶购自TaKaRa公司。在GenBank上查询获得了毕赤酵母的Hacl核酸序列SEQ ID NO:1。本实验设计了 3条PCR引物，分别命名为F-Hacl-EcoRl，R-Hacl-Notl和R-Hacl-N (引物具体序列见表I)，来扩展去内含子的Hacl成熟型mRNA的DNA序列。表I引物具体序列
权利要求
1.一种重组表达载体，所述的载体为用于表达翻译调控因子Hacl基因的真核表达载体。
2.按权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述的翻译调控因子Hacl基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.按权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于所述的翻译调控因子Hacl基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
4.按权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述的真核表达载体为毕赤酵母表达质粒pGAPZ。
5.一种提高植酸酶在毕赤酵母工程菌中表达的方法，是将权利要求1所述的重组表达载体转入表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中，来构建新的重组工程菌。
6.一种工程菌，是用权利要求5所述的方法构建的。
7.按权利要 求6所述的工程菌，其保藏编号为CCTCCNO:M 2012503。
全文摘要
本发明为一种促进植酸酶在毕赤酵母中表达的载体，属于微生物工程技术领域，具体涉及一种含有翻译调控因子Hac1的载体。在表达植酸酶的毕赤酵母工程菌中导入上述载体后，工程菌的植酸酶表达水平得到显著提高。毕赤酵母表达工程菌具有胞外分泌和和翻译后修饰的优点，因此，超水平表达毕赤酵母工程菌可应用于工业化生产，节省发酵成本。
文档编号C12R1/84GK103088052SQ20121055002
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者黄亦钧, 程斯达, 康丽华, 王华明, 许丽红, 刘艳萍, 吴秀秀 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司