由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组合物、其获得方法及其用途

由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的组合物、其获得方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及芽孢杆菌属的菌株。本发明还涉及由芽孢杆菌属的菌株产生的生物表面活性剂及其用途。本发明还涉及包含所述生物表面活性剂的组合物以及用于产生所述生物表面活性剂的方法。本发明还涉及用于获得生物表面活性剂的方法以及用于实施所述方法的设备。特别地，本发明可用在用于植物卫产生业的生物农药或生物表面活性剂的产生中，还可用在食品、化妆品、制药和石油工业领域。
【专利说明】由枯草芽孢杆菌新菌株产生的生物表面活性剂、包含它的 组合物、其获得方法及其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及芽孢杆菌属（Bacillus sp.)的菌株。
[0002] 本发明还涉及由芽孢杆菌属的菌株产生的生物表面活性剂及其用途。本发明还涉 及包含这些生物表面活性剂的组合物以及用于产生这些生物表面活性剂的方法。
[0003] 本发明还涉及用于获得生物表面活性剂的方法以及用于实施该方法的设备。
[0004] 特别地，本发明可应用在用于植物健康产业的生物农药或生物表面活性剂的生产 中，还可应用在食品、化妆品、化学、制药和石油工业以及环境保护领域。
[0005] 在下文的描述中，（[])之中的参考文献是指在实施例结尾处给出的参考文献的列 表。 现有技术
[0006] 常规农业生产体系根据市场预期并且以消费者可接受的成本使用农药类型的植 物健康产品以确保在数量和质量方面的充足生产。尽管使用这些产品给农业体系带来了益 处，但是其可对人的健康以及环境造成负面影响。地下水和地表水质量的下降以及农业环 境中生物多样性的下降是最常列举的后果。
[0007] 已知生物表面活性剂特别是细菌来源的生物表面活性剂具有许多令人感兴 趣的性能，特别是能够应用在植物健康领域的表面活性、抗病毒、抗细菌和抗真菌特 性。这些生物表面活性剂可以单独使用或者以若干种表面活性剂的混合物使用。已 表明，当生物表面活性剂以混合物的形式使用时具有协同效应（Ongena and Jacques, 2008Bacillus lipopeptides ：versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends Microbiol.16,115-125[1] ；CZ20011620[2] ；DE102005050123[3]) 〇
[0008] 与化学来源的农药相比，这些生物表面活性剂具有更好的可生物降解性、更低的 毒性和更大的物理化学抗性。另外，化妆品市场特别集中于组合了抗微生物活性和物理化 学性质的生物来源分子，例如乳化剂。
[0009] 生物表面活性剂也用于辅助回收包含于沉积物中的油，其中生物表面活性剂的注 入降低油的黏度并大幅提高所回收的油的比例。其还用于抵抗烃对水的污染，并且比化学 表面活性剂有效得多。而且，这些生物表面活性剂对所处理水的生态系统没有毒性。
[0010] 因此，在过去几年特别在食品、化妆品、化学、制药和石油工业以及环境保护中对 生物表面活性剂的需求提高。已经研究和使用了许多生产方法并且这些生产方法已经成为 出版物或专利申请（FR2578552[4])的主题。
[0011] 但是，目前可用的生物表面活性剂并不非常有效并且具有有限的生物和/或化学 特性。
[0012] 因此，确实需要提供作为替代的生物表面活性剂，其优选地具有与现有技术的生 物表面活性剂相比改进的特性。
[0013] 此外，目前确实需要具有可用于获得生物表面剂的有效方法。
[0014] 已经特别对用于产生由芽孢杆菌属产生的生物表面活性剂的方法进行了研究。但 是，这些方法由于以气泡形式添加氧而导致形成泡沫。第一种方法是使用机械搅拌的通气 反应器并连续提取由生物表面活性剂造成的并且包含所述生物表面活性剂的泡沫。该方 法很费力并且在使用上并不十分开放，特别是对于大规模使用而言（Guez et al.，2007. Setting up and modelling of overflowing fed-batch cultures of Bacillus subtilis for the production and continuous removal of lipoeptides. J Biotechnol，131， 67-75( [5] )?
[0015] 为了避免该泡沫问题，进行了在无氧条件下工作并使用硝酸盐作为最终电子受 体的尝试(Davis, Lynch and Varley. 1999. The production of surfactin in batch culture by Bacillus subtilis ATCC21332is strongly influenced by the conditions of nitrogen metabolism. Enzyme Microb.Technol. 25,322-329. [6] ；W00226961[7]； EP1320595[8])。生物表面活性剂的产生很大程度上取决于菌株适应或不适应这些无氧条 件的能力。迄今为止尚未开发出能够以工业数量产生生物表面活性剂的有效解决方案。而 且，化学来源农药的使用越来越受到质疑，有必要研究和使用生物来源的分子以代替化学 来源的农药并且开发以工业规模产生这些生物来源分子的方法。
[0016] 因此，确实需要开发克服现有技术的这些缺点、缺陷和障碍的方法和设备，包括用 于以低生产成本大量连续生产生物表面活性剂的方法。


【发明内容】

[0017] 本发明通过提供枯草芽孢杆菌菌株、抗霉枯草菌素（mycosubtiline)、包含这些抗 霉枯草菌素的组合物以及用于获得这些抗霉枯草菌素的方法确切地满足上述需求。
[0018] 本发明还提供了特别是通过消除或限制泡沫的形成来以工业规模产生生物表面 活性剂的方法和设备。
[0019] 因此，本发明的主题是用于获得生物表面活性剂的方法，其包括步骤（a):在包含 有机基质的培养基中培养能够产生生物表面活性剂的微生物，所述微生物的培养在气/液 膜接触器（contacteur membranaire air/liquide)的表面上进行。
[0020] 本发明人实际上最早实施了该方法，并且出乎意料地发现将细胞固定在气/液膜 接触器上特别有利于连续产生生物表面活性剂，同时避免形成泡沫。此外，本发明的方法提 高了生物表面活性剂的产率。另外，在本发明的方法中使用气/液膜接触器使得可以连续 产生生物表面活性剂。
[0021] 在下文中，"生物表面活性剂"意指两性的并且由微生物产生的表面活性分子。其 可以是例如选自包含以下的组的化合物：脂肽、磷脂、糖脂、脂蛋白或脂肪酸酯。例如，脂肽 选自包含以下的组：伊枯草菌素（iturine)、表面活性素（surfactine)、抗霉枯草菌素、丁 香霉素（syringomycine)、芬莽素（fengycine)(或制磷脂菌素（plipastatine))、地衣素 (lichenysine)、芽抱菌霉素（bacillomycin)、kurstakine、托拉氏霉素（tolaasine)、节杆 菌月旨月太（arthrofactine)、沙雷菌月旨月太（serrawettine)、putisolvine 和 massetolide。 ?舞 脂可以选自例如包含磷脂酰胆碱的组。酯可以选自例如包含以下的组：脱水山梨糖醇酯或 鼠李糖酯、肉豆蘧酸单甘油酯（monomyristine)、亚油酸单甘油酯（monolinol6ine)和亚麻 酸单甘油酯（monolinol6nine)。糖脂可以是例如鼠李糖脂。
[0022] "培养微生物"意指所有用于培养微生物和/或使其产生一种或更多种分子的技 术。
[0023] "能够产生生物表面活性剂的微生物"意指无组织分化并且具有合成生物表面活 性剂之能力的任何单细胞或多细胞微生物。其可以是例如细菌、酵母、霉菌或藻类。
[0024] 例如，细菌可属于选自包含以下的组的属：芽孢杆菌属（Bacillus)、假单胞 菌属（Pseudomonas)、红球菌属（Rhodococcus)、不动杆菌属（Acinetobacter)、沙雷 菌属（Serratia)、伯克菌属（Burkholderia)、分枝杆菌属（Mycobacterium)、诺卡菌 属（Nocardia)、黄杆菌属（Flavobacterium)、棒状杆菌属（Coryn ebacterium)、梭菌 属（Clostridium)、硫杆菌属（Thiobacillus)、节细菌属（Arthrobacter)、食烧菌属 (Alcanivorax)和类芽孢杆菌属（Paenibacillus)。例如，酵母可属于选自包含以下的组的 属：念珠菌属（Candida)、二形性酵母属（Pseudozyma)、黑粉菌属（Ustilago)、裂孢黑粉菌 属（Schizonella)、克氏担抱酵母属（Kurtzmanomyces)、球拟酵母属（Torulopsis)、红酵母 属（Rhodotorula)和拟威克酵母属（Wickerhamiella)。优选地，能够产生生物表面活性剂 的微生物属于芽孢杆菌属。
[0025] 当所述能够产生生物表面活性剂的微生物属于芽孢杆菌属时，其可以选自例 如包含以下的组：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、腊样芽胞杆菌（Bacillus cereus)、短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus)和莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis)。其可以是例如选自包含枯草芽孢杆 菌之组的菌株的情况，例如于2011年3月10日在巴斯德研究所（法国巴黎）的国家微生 物培养物保藏中心（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，CNCM)以 编号CNCM 1-4451提交的枯草芽孢杆菌。也称为枯草芽孢杆菌BBG125,以及枯草芽孢杆菌 ATCC21332、枯草芽孢杆菌BBG21、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌BBG100、枯草芽孢 杆菌ATCC9943、枯草芽孢杆菌S499、枯草芽孢杆菌BBG116、枯草芽孢杆菌BBG131、地衣芽孢 杆菌BAS50、来自地衣芽孢杆菌ATCC14580和苏云金芽孢杆菌BBG300的菌株。
[0026] 优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物选自 包含以下的组：枯草芽孢杆菌BBG125、枯草芽孢杆菌BBG100和枯草芽孢杆菌BBG1116,优选 地选自包含以下的组：枯草芽孢杆菌BBG125和枯草芽孢杆菌BBG100。
[0027] 优选地，就产生表面活性素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物是枯草 芽孢杆菌BBG131。
[0028] 优选地，就产生芬荠素而言，所述能够产生生物表面活性剂的微生物选自包含以 下的组：枯草芽孢杆菌ATCC21332和枯草芽孢杆菌BBG21。
[0029] 还优选地，根据本发明，所述能够产生生物表面活性剂的微生物是枯草芽孢杆菌 BBG125。
[0030] 当所述能够产生生物表面活性剂的微生物属于假单胞菌属时，其可以选自例如 包含以下的组：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、菊苣假单胞菌（Pseudomonas cichorii)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)、突光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri)、丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae)和托氏假单胞菌（Pseudomonas tolaasii)。
[0031] 在下文中，"有机基质"意指任何可以培养微生物和/或使其产生一种或更多种分 子的物质或物质的混合物。例如，有机基质可选自包含以下的组：淀粉、葡萄糖、谷氨酸、蔗 糖、木糖、甘油、有机酸、氨基酸以及这些有机基质的混合物。例如，有机基质可以是具有如 下组成的Landy培养基：葡萄糖，20g/升；谷氨酸，5g/升；酵母提取物，lg/升；K 2HP04, lg/ 升；MgS04,0. 5g/ 升；KC1，0. 5g/ 升；CuS04,1. 6mg/ 升；Fe2(S04)3,1. 2mg/ 升；MnS04,0. 4mg/ 升（Landy et al.1948. Bacillomycin ；an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic fungi. Proc.Soc. Exp. Biol. Med. 67, 539-541) [9]。有机基质还可 以是例如改良Landy培养基，例如补充有2. 3g/升硫酸铵和/或2g/升浓度的谷氨酸的 Landy 培养基（Guez et al, 2008. Respiration activity monitoring system (RAMOS), an efficient tool to study the influence of the oxygen transfer rate on the synthesis of lipopeptide by Bacillus subtilis. J. Biotechnol. 134,121-126[10])〇
[0032] 在下文中，"气/液接触器"意指用于使用含氧的气体向液体介质供氧的设备。气 /液接触器特别地包括气/液膜接触器。其可以是例如包含气/液膜接触器的反应器的情 况。通过对气/液接触器举例，可提到以下接触器：根据由以CFP开始的参考文献定义的模 型，来自GE Healthcare的"中空纤维盒"，以及根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来 自Spectrum Labs的"中空纤维模块"。
[0033] 气/液膜接触器还将液相与气相分离：气相在膜的一侧循环，而液相在另一侧 流动(Remize and Cabassud2003, A novel bubble-free oxidation reactor ：the G/ L membrane contactor. Recent progress in method engineering. Integration of membranes in the methods2. Lavoisier Tec and Doc. [11]),这两相不混合。
[0034] "气/液膜接触器"意指允许氧气在培养基中扩散的多孔膜。
[0035] 例如，气/液膜接触器可以是由中空纤维制成的膜或平坦的膜。
[0036] 气/液膜接触器可以例如具有大小为0. 01 μ m至2 μ m(例如0. 01 μ m至1 μ m，例 如 0· 1 μ m 至 0· 65 μ m)的孔。
[0037] 气/液膜接触器的表面积可以例如具有0. lm2至20m2的表面积。气/液膜接触器 的表面积优选地大于lm2。
[0038] 气/液膜接触器可以是例如疏水膜，确保这两相的较好分离。例如，气/液膜接触 器可以由选自包含以下聚合物的组的材料制成：聚醚砜、聚丙烯、聚砜、再生纤维素和纤维 素酯。
[0039] 气/液膜接触器可以是例如平坦的、圆柱形的、圆锥形的或者任何优化微生物的 培养以及与氧气的交换的几何形状。
[0040] 通过对气/液膜接触器举例，可特别提到以下膜：
[0041] -来自 GE-Healthcare Europe GmbH(德国慕尼黑）的（CFP-6-D-45);
[0042] -根据由以CFP开始的参考文献定义的模型，来自GE Healthcare的中空纤维过滤 模块（中空纤维盒）；
[0043] -根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来自Spectrum Labs的中空纤维过滤 模块（中空纤维模块）。
[0044] 根据本发明，可以使能够产生生物表面活性剂的微生物完全地或部分地主动固定 在气/液膜接触器的表面上。换言之，存在于气/液接触器中的微生物大部分固定在该接 触器的膜的表面上，其余部分在其释放后悬浮在培养基中。
[0045] 因此，本发明的方法可包括步骤（a):在包含有机基质的培养基中培养能够产生 生物表面活性剂的微生物，微生物培养在气/液膜接触器的表面上。换言之，本发明的方法 有利地可以无需培养皿或发酵罐。本发明的方法有利地可以以高度令人满意的量连续产生 抗霉枯草菌素。有利地，连续实施本发明的方法。可任选地添加培养皿或发酵罐，但并非必 需。添加培养皿或发酵罐相当不明智，因为其会降低产率。因此，有利地，在不包含培养皿 或发酵罐的设备中实施本发明的方法。换言之，本发明的方法可以仅在气/液膜接触器的 表面上实施能够产生生物表面活性剂的微生物的培养。
[0046] 能够产生生物表面活性剂的微生物所必需的氧通过扩散经过固定所述微生物的 气/液膜接触器的孔来传递。换言之，根据本发明，不是通过位于反应器中的鼓泡系统也不 是通过位于微生物培养反应器外部的供氧系统来向微生物培养基供氧。
[0047] 可以将气/液膜接触器的氧气流调节为使得可以向能够产生生物表面活性剂的 微生物供氧的任何流量。本领域技术人员能够根据需要添加的氧气来确定气/液膜接触 器的氧气流量。本发明人发现，每体积液体0.2体积至2体积/分钟（vvm)空气的通气流 量对于向培养基和微生物供氧而言特别有效。因此，气/液接触器的空气流量可以为例如 0· 5vvm至2vvm。优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，气/液接触器的通气流量为0· 25vvm。 优选地，就产生表面活性素而言，气/液接触器的通气流量为lvvm。优选地，就产生芬荠素 而言，气/液接触器的通气流量为〇· 5vvm。
[0048] 根据本发明的方法，可以在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤（a)。例 如，可以在两个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤（a)，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或甚 至更多个气/液膜。本领域技术人员能够根据待产生的生物表面活性剂的量来确定气/液 膜接触器的数目。
[0049] 本发明的一个目的是提高固定在气/液膜接触器的表面上的微生物的量。这可以 通过提高气/液膜接触器的表面积和/或气/液膜接触器的数目来完成。
[0050] 当在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤（a)时，气/液膜接触器可以例 如串联或平行设置。优选地，当在多个气/液膜接触器的表面上进行培养步骤（a)时，气/ 液膜接触器平行设置。
[0051] 本发明方法还可包括从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的 步骤。该分离步骤可以通过本领域技术人员已知的任何能够分离包含在液体培养基中的物 质的方法来进行。
[0052] 例如，从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的步骤可包括一个 或更多个选自包含以下的组的步骤：微滤、超滤、纳滤和离心。
[0053] 例如，从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表面活性剂的步骤包括以下步 骤：
[0054] (b)对步骤（a)所得培养基进行微滤，以从培养基中分离微生物，和/或
[0055] (c)对在步骤（a)或（b)中获得的培养基进行超滤，以从步骤（a)或（b)所得培养 基中分离生物表面活性剂。
[0056] 优选地，分离步骤包括步骤（b)和（c)中的每一个。
[0057] 微滤步骤（b)和超滤步骤（c)使得能够从在步骤（a)和/或（b)中获得的培养基 中连续提取生物表面活性剂。
[0058] 因此，将气/液膜接触器与微滤（b)和超滤（c)步骤组合使得能够由能够产生生 物表面活性剂的微生物连续产生和提取生物表面活性剂。
[0059] 微滤步骤（b)可以利用任何能够从包含微生物的培养基中分离微生物的微滤装 置进行。例如，所述微滤装置可以是微滤膜。例如，所述微滤装置可以是有机微滤膜或无机 微滤膜，例如，中空纤维膜。
[0060] 微滤步骤（b)可以例如利用由中空纤维制成的孔径为0. 1微米至0.45微米（μπι) 的膜进行。优选地，在步骤（b)中使用的中空纤维膜的孔径为0.2μπι。
[0061] 通过对可用于进行微滤步骤（b)的膜举例，可列举以下膜：
[0062] -中空聚砜或聚醚砜纤维，孔径为0· 2 μ m，参考CFP-2-E-4X2MA(GE_Healthcare Europe GmbH,德国慕尼黑）；
[0063] -中空聚砜或聚醚砜纤维，孔径为0. 45 μ m，参考CFP-4-E-4X2MA，或中空聚砜或聚 醚砜纤维，孔径为 0· 65 μ m，参考 CFP-2-E-6X2MA(GE-Healthcare Europe GmbH，德国慕尼 里）. j、、、 / ?
[0064] -根据由以CFP开始的参考文献定义的模型，来自GE-Healthcare的中空纤维微滤 或超滤模块（中空纤维盒）；
[0065] -根据由以KM开始的参考文献定义的模型，来自Spectrum Labs (Rancho Dominguez，CA，USA)的中空纤维过滤模块（中空纤维模块）；
[0066] -根据由以SPC20开始的参考文献定义的模型，来自Sartorius Stedim(法国欧巴 涅）的Sartocon微滤盒。
[0067] 超滤步骤（c)可以利用任何能够从包含生物表面活性剂的培养基中分离生物表 面活性剂并浓缩生物表面活性剂的过滤装置进行。例如，超滤装置可以是超滤膜，例如由再 生纤维素制成的超滤膜。
[0068] 例如，可以用截留阈值（seuil de coupure)为5千道尔顿至50千道尔顿（kDa)、 例如5kDa至30kDa、例如5kDa至20kDa的膜进行超滤步骤（c)。在步骤（c)中使用的膜的 截留阈值优选地为10kDa。
[0069] 通过对可用于进行超滤步骤（c)的膜举例，可列举以下膜：
[0070] -由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜，参考 3051443901E-SW(Sartorius，德国哥廷根）；
[0071] -由再生纤维素制成的截留阈值为10kDa的超滤膜，参考P2C010C01(Millipore Headquarters,290Concord Road, Billerica, MA, USA) 〇
[0072] 优选地将在步骤（a)、（b)和（c)中使用的膜在121°C下灭菌20分钟。
[0073] 本发明的方法与用于由分泌生物表面活性剂的微生物生物降解有机物质的已知 方法的区别在于，可以在从微生物中除去来自培养基的有机物质残余物和所产生的生物表 面活性剂之后再循环或不再循环全部微生物。这使得可以在生物反应器中获得高浓度的微 生物。
[0074] 本发明的方法与用于由分泌生物表面活性剂的微生物生物降解有机物质的已知 方法的区别还在于，约95%的所产生生物表面活性剂保留在培养基中，而不会形成泡沫。约 5%的生物表面活性剂吸附在膜接触器的气/液界面上，但可通过例如洗涤该膜来解吸附。
[0075] 可通过本领域技术人员已知的任何方法来洗涤气/液膜接触器以回收产生并吸 附在膜接触器的气/液界面处的生物表面活性剂。例如，可以用一种或更多种选自包含以 下的组的洗涤溶液进行气/液膜接触器的洗涤：蒸馏水、NaOH溶液、NaOCl溶液、碳酸氢钠 溶液或碳酸氢钾溶液、或者碳酸钠溶液或碳酸钾溶液。可以将洗漆溶液调节为能够提高回 收的生物表面活性剂之量的任意pH。例如，将洗涤溶液调节为pH = 10。
[0076] 可以将洗涤溶液调节为能够提高回收的生物表面活性剂的量的任意温度。例如， 可以将洗涤溶液调节为20°C至50°C的温度。
[0077] 根据本发明，可通过本领域技术人员已知的任何加热装置来调节培养基的温度。 例如，加热装置可以是热交换器。例如，热交换器可以选自包含U形管式热交换器、具有横 向管束的热交换器、具有纵向管束的热交换器、螺旋式热交换器、板式热交换器、Bouhy柱或 块式热交换器的组。加热装置优选为管式热交换器。
[0078] 因此，本发明的方法可以在使能够产生生物表面活性剂的微生物可以产生生物表 面活性剂的任意温度下实施。例如，可以在〇°C至70°C、有利地在20°C至37°C的温度下实 施该方法。优选地，就产生抗霉枯草菌素而言，可以在22°C的温度下实施该方法。就产生芬 荠素而言，可以优选地在30°C的温度下实施该方法。优选地，就产生表面活性素而言，可以 在37°C的温度下实施该方法。
[0079] 此外，本发明的方法可以在使能够产生生物表面活性剂的微生物可以产生生物表 面活性剂的任意pH下实施。可以借助于向培养基中受控添加碱溶液或酸溶液来调节pH。
[0080] 碱溶液可以例如选自包含碳酸钠、碳酸钾和氨水的组。
[0081] 酸溶液可以例如选自包含磷酸、硫酸和硝酸的组。
[0082] 例如，可以将pH调节为使能够产生生物表面活性剂的微生物能够存活的任意值。 例如，可以将pH调节为pH6至pH8之间的值，优选pH7的值。本领域技术人员能够确定用 于将pH调节为所需值的碱溶液和酸溶液的量。
[0083] 本发明的方法可有利地连续实施，即可以不中断地实施气/液膜接触器的供应和 由微生物产生的生物表面活性剂的提取。本发明的方法可以以能够从能够产生生物表面活 性剂的微生物中提取生物表面活性剂的任意小时速率进行。本领域技术人员可容易地调整 实施该方法的速率，即向气/液膜接触器添加的培养基的流量。本发明人发现，以〇. 051Γ1至 〇. 51Γ1的稀释速率进行该连续方法对于微生物产生生物表面活性剂特别有效。所述稀释速 率定义为供应速率或提取速率除以培养基体积。因此，可以例如以对应于稀释度为〇. 051Γ1 至0. 51Γ1的循环小时速率、有利地以0. 11Γ1的小时速率进行本发明的方法。
[0084] 本发明的另一主题是用于实施本文描述的方法的设备，所述设备包含气/液膜接 触器。例如，本发明的设备包含至少一个气/液接触器，其包括气/液膜接触器。
[0085] 气/液膜接触器和气/液接触器可以是上文中定义的那些。
[0086] 气/液膜接触器和气/液接触器的数目可以如上文所定义。
[0087] 本发明的设备不包含除膜或多个气/液膜接触器以外的任何通气装置。换言之， 本发明的设备不包含位于反应器中的鼓泡系统。该设备也不包含位于微生物培养反应器外 部的供氧系统。本发明的设备还可包含微滤装置和/或超滤装置。本发明的设备优选地包 含微滤装置和超滤装置。微滤装置和超滤装置可以是例如上文描述的那些。
[0088] 有利地，本发明的设备包含连续实施本发明的方法所必需的装置。换言之，该设备 有利地包含用于引入培养基的装置和用于移出由微生物产生的生物表面活性剂的装置。可 以使用本领域技术人员已知用于获得用于连续实施本发明方法之设备的任意引入装置和 移出装置。
[0089] 本发明的设备还可包含蒸发装置。在下文中，"蒸发装置"意指任何用于浓缩包含 表面活性剂的培养基中的表面活性剂的装置。其可以是例如选自包含Rotavapor VV2000 型真空蒸发器（Heidolph Instruments GmbH&Co,德国施瓦巴赫）和升膜式蒸发器的组的蒸 发装置。本发明的设备还可包含用于调节培养基的温度的加热装置。加热装置可以是例如 上文中描述的那些。加热系统可通过管系统连接至气/液接触器。
[0090] "管系统"意指流体或气体可以在其中循环的任意装置。例如，流体可以是液体或 凝胶。管系统特别可以将根据本发明的设备的多个元件连接在一起。例如，管系统可以是 任意类型的硅树脂型柔性或刚性管道（Cole Parmer, Vernon Hills，IL，USA)或由316S不 镑钢（Swagelok Company，Solon，0H，USA)制成。
[0091] 可以通过一个或更多个泵和/或一个或更多个阀来调节流体或气体在管系统中 的循环。
[0092] 本发明的设备还可包含至少一个泵。
[0093] 在本发明的含义中，"泵"意指用于对本发明设备中的液体例如培养基施加流量 的装置。其可以是例如蠕动泵、凸轮泵或隔膜泵。可提到例如Masterf lex L/S蠕动泵紧 凑驱动模型（Cole Parmer Vernon Hills，IL，USA)、Millipore Corporation(Millipore， Bedford, MA, USA)、Sarto jet pump (Sartor ius, Sartor ius Stedim 法国 SAS, Aubagne)和 Watson_Marlow323 (Watson Marlow, Falmouth，英国康沃尔）。此外，泵可以手动控制或自动 控制。
[0094] 本发明的设备还可包含至少一个阀。
[0095] 在下文中，"阀"意指用于终止或调节本发明设备中的液体（例如培养基）流的装 置。其可以是例如调节阀、"双态"阀或电磁阀。可提到例如由聚偏二氟乙烯（PVDF)、聚丙 烯（PP)、全氟烷氧基（PFA)或不锈钢制成的调节阀。另外，阀可以手动控制或自动控制。 [0096] 本发明人在下文中描述了本发明的设备用于实施本发明方法的用途。
[0097] 本发明的另一主题是由枯草芽孢杆菌ATTC6633菌株获得的枯草芽孢杆菌菌株， 其中编码表面活性素合成酶的操纵子srfA被中断，编码抗霉枯草菌素合成酶的操纵子myc 的启动子被组成型强启动子PMpU替换。
[0098] 优选地，该枯草芽孢杆菌菌株是于2011年3月10日在巴斯德研究所（法国巴黎） 的国家微生物培养物保藏中心（CNCM)以编号CNCM 1-4451提交的枯草芽孢杆菌菌株。该 菌株还称为枯草芽孢杆菌BBG125。
[0099] 本发明的另一主题是用于产生抗霉枯草菌素的方法，其包括培养本发明的枯草芽 孢杆菌菌株的步骤和回收所得抗霉枯草菌素的步骤。
[0100] 枯草芽孢杆菌BBG125菌株可以例如用在任何用于产生生物表面活性素的方法 中，特别是用在上述用于产生C18和C17Gln3抗霉枯草菌素的方法中。例如，用于产生生物 表面活性剂的方法可包括培养枯草芽孢杆菌BBG125菌株的步骤和回收所得生物表面活性 剂的步骤。例如，用于产生生物表面活性剂的方法可以是本发明上文描述的方法。
[0101] 由本发明人开发的枯草芽孢杆菌BBG125菌株特别出乎意料。该菌株可以产生抗 霉枯草菌素而不产生表面活性素。而且，其可以产生从未被描述过的抗霉枯草菌素。
[0102] 因此，本发明还涉及以下抗霉枯草菌素：
[0103] -C18抗霉枯草菌素：脂肪酸链包含18个碳原子的抗霉枯草菌素，如下式（I)所 示：
[0104]

【权利要求】
1. 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)菌株，所述菌株由枯草芽孢杆菌ATCC6633菌株 组成，其编码表面活性素的操纵子srfA被中断，并且其编码抗霉枯草菌素的操纵子myc的 启动子被组成型启动子P MpU替换。
2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株，其由2011年3月10日在巴斯德研究所 (法国巴黎）的国家微生物培养物保藏中心（CMCM)以编号CNCM 1-445提交的枯草芽孢杆 菌菌株组成。
3. 用于获得抗霉枯草菌素的方法，其包括培养权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌菌株 的步骤和回收所得抗霉枯草菌素的步骤。
4. 根据权利要求3所述的方法，其包括在包含有机基质的培养基中培养所述枯草芽孢 杆菌菌株的步骤（a)，所述培养在气/液膜接触器的表面上进行。
5. 根据权利要求4所述的方法，其还包括以下步骤： (b) 对步骤（a)所得培养基进行微滤，以从所述培养基中分离微生物，和/或 (c) 对在步骤（a)或（b)中获得的培养基进行超滤，以从步骤（a)或（b)所得培养基中 分离所述生物表面活性剂。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述有机基质选自包含以下的组：淀粉、葡萄 糖、蔗糖、木糖、甘油、有机酸、氨基酸以及这些有机基质的混合物。
7. 根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述气/液膜接触器具有大小为 0· 01 μ m 至 2 μ m 的孑L。
8. 根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中在所述微滤步骤（c)中使用的中空 纤维膜的截留阈值为〇. 1微米至〇. 45微米。
9. 根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中在超滤步骤（d)中使用的膜的截留 阈值为5kDa至20kDa。
10. 抗霉枯草菌素，其脂肪酸链包含18个碳原子（C18抗霉枯草菌素），并且所述抗霉 枯草菌素如下式（I)所示：
11. 抗霉枯草菌素，其脂肪酸链包含17个碳原子，并且其肽环3位处的天冬酰胺被替换 为谷氨酰胺（C17Cln3抗霉枯草菌素），并且所述抗霉枯草菌素如下式（II)所示：
12. 组合物，其包含至少一种根据权利要求10所述的C18抗霉枯草菌素和/或至少一 种根据权利要求11所述的C17Gln3抗霉枯草菌素。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其还包含至少一种选自包含以下的组的抗霉枯草 菌素：异C16抗霉枯草菌素、正C16抗霉枯草菌素、反异C17抗霉枯草菌素、异C17抗霉枯草 菌素及其混合物。
14. 根据权利要求12或13所述的组合物，其包含1 %至60 %的异16抗霉枯草菌素、 1%至20%的C17Gln3抗霉枯草菌素、1%至10%的正C16抗霉枯草菌素、20%至95%的反 异C17抗霉枯草菌素、5%至30%的异C17抗霉枯草菌素和1 %至5%的C18抗霉枯草菌素。
15. 根据权利要求10或11所述的抗霉枯草菌素或者根据权利要求12至14中任一项 所述的组合物，其用作抗真菌剂。
【文档编号】C12P7/64GK104114710SQ201280057896
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年10月3日 优先权日:2011年10月3日
【发明者】弗朗索瓦·库特, 菲利普·雅克, 迪迪埃·勒库蒂里耶, 让-塞巴斯蒂安·格斯, 帕斯卡尔·迪尔斯泰, 瓦莱丽·勒克莱尔, 马克斯·贝谢 申请人:里尔第一大学-科学技术