三种拟青霉对何首乌的微生物转化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法。该方法主要包括：（1）三种拟青霉的制备；（2）三种拟青霉固体发酵培养基的制备；（3）三种拟青霉固体发酵培养；（4）三种拟青霉固体发酵培养物后处理。本发明所提出的利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法，培养物同时含有药用多糖、甘露醇、3ˊ-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚，其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高了20%。本发明操作简便，效果良好，可进行大规模推广应用。
【专利说明】三种拟青霉对何首乌的微生物转化
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物【技术领域】，具体是利用三种拟青霉对中药何首乌进行微生物转 化的方法。
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【背景技术】
[0003] 蝶拟青霉 cicat/ae(Mique1 ? )Samson、蛹草拟青霉 Liang、蝙幅蛾拟青霉Chen&Dai是三种重要的药用真 菌，其主要发酵产物是多糖、甘露醇、3 < -脱氧腺苷和腺苷等，具有免疫调节、治疗肾衰、抗 肿瘤、抗炎症、调节内分泌、抗心律失常、延缓衰老、耐缺氧等方面的作用。
[0004] 何首乌是一味传统的中药，为寥科植物何首乌Thunb.的 块根，性味苦、甘、涩、微温，为补益类中药，入肝、心和肾经。《本草纲目》记载何首乌"养血 益肝，固精益肾，健筋骨，乌须发，为滋补良药，不寒不燥，功在地黄、天门冬诸药之上"。何首 乌含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、磷脂类、糖类、多种氨基酸、多种维生素及微量元素等，具有 抗衰老、增强免疫、降血脂、抗心肌缺血、改善脑缺血、神经保护、抗骨质疏松等作用。
[0005] 临床应用有生首乌和制首乌之别。生首乌因含有结合型蒽醌而具有轻度泻下作 用，制首乌是生首乌炮制而成，在此过程中，结合型蒽醌可转变为游离型(彭晓波，中国现代 药物应用，2008,2 (19) :117)。所以，生首乌有小毒，而制首乌毒性甚微。杜晨晖等人利用 毛霉和米根霉对何首乌进行微生物发酵，其目的主要是降低何首乌的毒性(杜晨晖等，天然 产物研发与开发，2008, 20 :540-544)。本发明选用的材料是制首乌，应用三种药用真菌进行 发酵，使培养物兼具微生物和中药的功效成分，提高治疗和保健的功效，是颇具发展潜力的 研发领域。该发明主要是利用蝙蝠蛾拟青霉Chen&Dai、蛹草拟青 ^PaecilomycesmilitarisLiang和[ll单拟青霉cicat/ae(Miquel. )Samson 对何首乌进行生物转化，一次发酵可同时获得药用多糖、甘露醇、3 < -脱氧腺苷、腺苷、二苯 乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚，其中何首乌中主要成分二苯乙烯苷含量提高20%。
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【发明内容】
[0007] 本发明提供一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌，同时获得拟青霉和何首乌活性 成分，且提高何首乌主要成分二苯乙烯苷含量的方法。
[0008] 该方法的操作步骤如下： (1)生产菌株为蝶拟青霉cicat/ae(Mique1 ? )Samson;蛹草拟青霉PaecilomycesmilitarisLiangPaecilomyceshepialiChen&Dai〇
[0009] (2)菌种制备：将步骤（1)所述菌株蝶拟青霉cicat/ae(Miquel.) Samson;蛹草拟青霉 Liang;蝙幅蛾拟青霉 Aepia/iChen&Dai分别接种到PPDA斜面培养基，于20?25°C恒温培养疒10d，用无菌水洗 下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5X107个/毫升。
[0010](3)固体发酵培养基制备：固体培养基配方为何首乌粉3(T40g(制首乌粉碎获 得）；蔗糖2g;蛋白胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮1(T20g，混匀，装入1000ml三角瓶中，力口 入去离子水，使最终培养基的水料比为1.2 :1，121°C高压灭菌30min。
[0011](4)固体发酵培养：将步骤（2)中制备好的菌种分别按2. 5ml/瓶的量接入步骤 (3)三角瓶固体培养基中，于1(T25 °C，静置培养2(T30天。
[0012] (5)固体发酵物后处理：将步骤（4)中培养好的固体发酵物取出，55 °C恒温干 燥至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；HPLC法测定 3?脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量。
[0013] 本发明关键点在于：使用三种拟青霉对植物药材何首乌进行微生物转化，一次发 酵过程同时获得药用真菌药效成分和何首乌药效成分，且明显提高何首乌中二苯乙烯苷含 量。
[0014]
【具体实施方式】
[0015] 以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。
[0016] 实施例1 :不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响 (1)菌种制备：将蝶拟青霉cicat/ae(Miquel.)Samson;蛹草拟青霉PaecilomycesmilitarisLiang;蝙幅蛾拟青霉Chen&Dai接种 到PDA斜面培养基，于23°C恒温培养10d，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到 5X107个/毫升。
[0017] (2)固体共发酵培养基的制备：固体培养基的配方为何首乌40g;蔗糖2g;蛋白 胨1g;洋芋粉5g;粗麸皮10g，装入1000ml三角瓶中，水料比为1.2 :1，121°C灭菌30min。
[0018] (3)固体共发酵培养：将制备好的菌种分别按2ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基 中，于10°C和30 °C，静置培养25天，（注：空白对照未接菌，其余条件相同）。
[0019] (4)固体发酵物后处理：将步骤（3)中培养好的固体发酵物取出，55 °C恒温干燥 至恒重，然后粉碎至80目粉末，采用紫外检测法测定多糖、甘露醇含量；采用紫外检测法测 定多糖、甘露醇含量；HPLC法测定：r-脱氧腺苷、腺苷、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚 的含量，其结果见表1。
[0020] 表1不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响
【权利要求】
1. 一种利用三种拟青霉发酵转化何首乌的方法，其特征在于该方法包括： (1) 菌种制备：将蝶拟青霉cicat/ae (Miquel.) Samson;蛹草拟青霉 Paecilomyces mi li tar is Liang Paeci lomyces hepiali Chen & Dai 三种 菌株，分别接种到PDA斜面培养基，于2(T25°C恒温培养7~10d，用无菌水洗下孢子，稀释调 整使孢子终浓度达到5 X 107个/毫升； (2) 固体发酵培养基的制备：固体培养基的配方为：何首乌3(T40 g ;蔗糖2 g ;蛋白胨 1 g;洋芋粉5 g;粗麸皮1(T20 g，装入1000 ml三角瓶中，水料质量比为1.2:1，121 °C灭 菌 60 min ; (3) 固体发酵培养：将制备好的三种拟青霉分别按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养 基中，于1(T30 °C，静置培养1(T30 d。
【文档编号】C12P19/44GK104342465SQ201310344589
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】虞泓, 贾学渊, 葛锋, 陈自宏, 曾文波 申请人:云南云百草实验室有限公司