用于检测建兰花叶病毒的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测建兰花叶病毒的引物、试剂盒及检测方法，引物包括：正向外引物F3：5'-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3'；反向外引物B3：5'-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3'；正向内引物FIP：5'-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3'；反向内引物BIP：5'-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3'；试剂盒及检测方法包含上述引物，利用该引物及检测方法检测建兰花叶病毒快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高。
【专利说明】用于检测建兰花叶病毒的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测建兰花叶病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]兰花是享誉全球的花卉，深受全世界人民的喜爱，我国每年都有数以亿计的兰花苗进出境，然而由于兰花非常容易携带病毒，特别是最容易携带的剑兰花叶病毒Cymbidiummosaic virus (CymMV)和齿兰环斑病毒 Odontoglossum ringspot virus (ORSV),且脱毒目前还非常困难，严重制约了我国兰花产业可持续的健康发展和国外的技术壁垒的制约，因此，唯有切实加强进出境植物病毒的检疫，不断研究和开发新的检测方法，不断提高对进出境兰花种苗携带的病毒进行高精准的检测能力，及早将病毒植株淘汰出去，方能从根本上保证无毒苗的大量生产，才能进一步促进我国兰花产业的发展。
[0003]植物病毒病的诊断和病原鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的基础，也是植物病毒分类学研究的一个重要内容，植物病毒检测的基本内容包括病毒的生物学特性、形态学特征、理化特性、基因组结构、抗原特性等几个方面，涉及到生物学测定、血清学测定、生理生化测定、电镜技术、分子生物学技术等多种手段。目前，我国出入境植物检疫所采用的检测技术的主要手段主要是:口岸现场检疫、生长季隔离检疫、指示植物检验、血清学检验、分子生物学检验。这些手段存在的主要问题为:1:检测周期长，不符合国务院提出的“加快通关速度”的精神；2:容易出现假阳性反应；3:检测方法繁琐复杂，不利于基层单位实际应用；4:主要检测试剂或产品来源于国外公司，不仅购买价格高，而且定购时间长，这些都不能适应我国经济快速发展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。
[0004]目前对病毒的主要技术检测方法是酶联免疫吸附(ELISA)检测和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。ELI SA可以定性、定量测定样品中的病毒，是实现目前鉴定病毒的最好手段之一。但是，血清学反应的必须具备高效的抗血清，另外血清学检测对一些病毒含量低和含有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结果，并且存在检测时间长的问题，不能满足目前口岸快速检测的要求；RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物学新技术之一，利用RT-PCR技术对病毒的检测相比ELISA检测具有灵敏度高的特点，可检测的最低病毒含量达到fg水平。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新的技术，例如实时荧光RT-PCR技术，基因芯片技术等，使其应用范围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高，但是这些分子生物学技术存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。
[0005]纳米生物技术是运用纳米技术的理论与方法，在传统生物学和现代分子生物技术的基础上，开展生物学研究。纳米磁珠在生物样品的分离分析中有着重要应用价值:(I)高效富集:纳米磁珠比表面积大，显著增加反应界面能够高效富集生物样品；(2)可操纵性:纳米磁珠具有超顺磁效应，外加磁场能够快速对其进行移动和分离；(3)标记性质:生物分子标记方法简单、可靠；(4)人体安全:对人体无毒、可生物代谢、可生物降解、生物相容性好。总之，磁性生物分离兼具磁性载体的超顺磁性和亲和配基的生物特异性特点，集磁性分离的快速简便和亲和分离的高选择性双重优势于一体，在核酸的分离纯化，RNA、DNA分子的富集，蛋白的纯化，病毒、细胞的分离等方面有应用。
[0006]关于纳米磁珠(magnetic nano particles,MNP)的合成，国外在80年代末开始超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究，基于纳米磁珠的生物分离材料国外已经有市场化产品，最近纳米磁珠在动物病毒检测得到应用，抗体标记的纳米磁珠从液相中捕获目标病毒，可以高灵敏度地检测动物病毒。
[0007]而环介导核酸等温扩增即Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)技术是最近几年才发展起来的病毒检测新方法，为快速基因检测提供了一种新的技术途径，已具有成功应用的现实性，在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有文献报道。它不需要昂贵的检测设备，只需要一台温箱即可，而且其检测灵敏度比普通PCR检测方法还要高，而且检测时间不超过一小时，结果直接目测即可，特别适合口岸一线检测。
[0008]环媒等温核酸扩增反应利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶使得链置换DNA合成在不停地自我循环，LAMP扩增分两个阶段。
[0009]第I阶段为起始结构形成:任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成 单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。
[0010]第2阶段是反应扩增循环:以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的BI区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换.形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。
[0011]环媒等温核酸扩增反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在等温(60°C-65°C )条件下，30min-60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到IO9水平。该方法的一大特色是，可以通过反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。由于环媒等温核酸扩增的扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以对于微生物的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。此外，环媒等温核酸扩增的核酸扩增过程是在等温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，使检测成本大大降低，而PCR则需要昂贵的PCR仪进行一定温度程序的核酸扩增，因而，环媒等温核酸扩增比PCR对仪器设备要求低、检测成本也较低，更具推广性，可望作为常规检测工具。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测建兰花叶病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测建兰花叶病毒快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高。
[0013]为了达到上述目的，本发明采用以下方案:
[0014]一种用于检测建兰花叶病毒的引物，其特征在于:
[0015]正向外引物F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ；
[0016]反向外引物B3:5’-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ；
[0017]正向内引物FIP和反向内引物BIP ;
[0018]其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列:
[0019]5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0020]其中Flc:5，-AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3，；
[0021]F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0022]所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列:
[0023]5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
[0024]其中Blc:5，-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3，；
[0025]B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
[0026]一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有:
[0027]
反应液缓冲液0.6mL
引物250 μ L
荧光染料50 μ L
酶溶液50 μ L
阳性对照50 P L
[0028]所述的引物包括:
[0029]正向外引物F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ；
[0030]反向外引物B3:5’-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ；
[0031]正向内引物FIP和反向内引物BIP ;
[0032]其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列:
[0033]5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0034]其中Flc:5，-AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3，；
[0035]F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0036]所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列:
[0037]5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；[0038]其中Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
[0039]B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
[0040]如上所述的一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于所述的反应液缓冲液2X由以下组分组成:
[0041]
【权利要求】
1.一种用于检测建兰花叶病毒的引物，其特征在于包括: 正向外引物 F3:5’ -CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 B3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向内引物FIP和反向内引物BIP ； 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
2.一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有:反应液缓冲液0.6mL引物250 μL荧光染料50 μL酶溶液50 μ L阳性对照50 μ L去离子水1000 μ L 所述的引物包括: 正向外引物 F3:5’ -CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 Β3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向内引物FIP和反向内引物BIP ； 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向内引物BIP包括含Blc和Β2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
Β2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
3.根据权利要求2所述的一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于所述的反应液缓冲液2Χ由以下组分组成:
4.根据权利要求2或3所述的一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。
5.根据权利要求4所述的一种检测建兰花叶病毒的试剂盒，其特征在于所述的荧光染料含有钙黄绿素。
6.一种建兰花叶病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤: A、采用纳米磁珠提取待测样品的RNA； B、在冰上，按比例取反应液缓冲液、引物、荧光染料、酶溶液、阳性对照、去离子水放入灭菌管中配制预混液； C、将适量待测样品的RNA加入步骤B中的灭菌管中； D、将步骤C中的试管放置在恒温器中，在63°C下保持恒温I小时，然后在80°C下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应； E、使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观查，如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性； 其中所述的引物包括: 正向外引物 F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 B3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向内引物FIP和反向内引物BIP ； 其中所述正向内引物FIP包含Flc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向内引物BIP包括含Blc和B2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
7.根据权利要求6所述的一种建兰花叶病毒的检测方法，其特征在于步骤A中采用纳米磁珠提取待测样品RNA的具体步骤: a、制样:取0.1g的带毒组织加入ImL抽提缓冲液进行研磨； b、清洗纳米磁珠:取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH20反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH20 ； C、结合:加入100 μ L的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附； d、清洗:在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次； e、裂解:加入50μ L ddH20到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95°C，IOmin ； f取样:用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为待测样品RNA。
8.根据权利要求 7所述的一种建兰花叶病毒的检测方法，其特征在于所述的免疫纳米磁珠通过以下工艺制作: ①纳米磁珠的制备
分别取 5.2g FeCl3.6Η20、2.7g FeSO4.7Η20、0.85mL12.1moL/L 的浓盐酸溶解于 200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；在80°C下搅拌，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次,并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液；取25mLFe304磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min ;滴加0.4mL APTES，室温下搅拌7h ；反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次,最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液； ②免疫磁珠的制备 取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分离器弃上清液；加入5%(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液；用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h ;磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存备用，得到免疫磁珠。
9.根据权利要求7所述的一种建兰花叶病毒的检测方法，其特征在于所述紫外线照射装置的波长为 240-260nm，350-370nm。
10.根据权利要求7所述的一种建兰花叶病毒的检测方法，其特征在于所述的反应液缓冲液2X由以下组分组成:
【文档编号】C12Q1/68GK103451316SQ201310344666
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】陈定虎, 陈祖华, 王宏, 曹小茂, 杨雷亮, 彭志民, 刘恭源, 王勇, 朱春红 申请人:陈定虎