一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，特别公开了一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用。该环状芽孢杆菌，其特征在于：所述环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）HG12菌株是从中国白酒厂酿造酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得的，其具有生长繁殖速度快，可在阿魏酸的诱导下产生阿魏酸脱羧酶以及产阿魏酸脱羧酶性能稳定、酶活力高的特点。本发明可以实现阿魏酸脱羧酶生产的连续化、规模化，便于其工业化生产，并且酶的生产工艺简便、生产周期短、成本低。
【专利说明】一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用
[0001](一)【技术领域】
本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用。[0002](二)【背景技术】
阿魏酸脱羧酶(Ferulic acid decarboxyase, FAD)是催化阿魏酸发生脱羧反应产生
4-乙烯基愈创木酚的酶。4-乙烯基愈创木酚是一种能产生特殊香味或丁香类香味的挥发性酚类物质，它能提高食品的感官品质，对酒类、酱油、干酪、饮料等食品的自然香气有很大影响，因此，阿魏酸脱羧酶用于食品行业具有很好的发展前景。
[0003]研究表明，阿魏酸脱羧酶存在于许多真菌、酵母和部分细菌中，如短小杆菌{Bacillus 應Υ7?5.)、植物乳杆菌(Xactobacillus應)、枯草芽抱杆菌{Bacillussub i)、酿酒酵母(Saccharomycescere visiae )等，但上述微生物产生的阿魏酸脱羧酶在氨基酸序列、肽链结构、物化性质和催化特性上都有所不同，并且所产阿魏酸脱羧酶的酶活力也不高。因此有研究人员采用基因工程技术对阿魏酸脱羧酶产生菌进行育种研究，构建了阿魏酸脱羧酶基因工程菌，如顾雯(云南大学博士论文，2011)在进行细菌Enterobacter sp.Px6_4阿魏酸脱羧酶的基因克隆、表达、晶体结构解析和催化机制研究时，将该酶的编码基因序列克隆并在大肠杆菌中进行诱导表达，然后通过亲和层析等方法获得了纯化的阿魏酸脱羧酶；如中国专利文献CN 101397568 A (申请号200810233517.X)公开了一种细菌阿魏酸脱羧酶基因及其晶体结构，该发明通过基因克隆的方法获得细菌中分解阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚的关键酶阿魏酸脱羧酶的编码区序列，并通过异源表达技术在大肠杆菌(B.coli BL21)中大量表达了该酶；如专利文件CN 1206045 (申请号98106195.8)公开了通过重组得到具有增强的阿魏酸脱羧酶活性的酵母。但由于目前对微生物产生阿魏酸脱羧酶的生物调控机制了解还不完全，利用基因工程方法构建阿魏酸脱羧酶生产菌株耗费巨大且处于研究阶段，基因工程菌生产阿魏酸脱羧酶还没有达到工业化生产的要求，因此采用传统育种技术选育高产阿魏酸脱羧酶菌株仍然是十分必要的方法。
[0004]利用微生物纯种培养和富集技术，对自然条件下产生阿魏酸脱羧酶的菌株进行分离纯化，可筛选到产阿魏酸脱羧酶的优良菌株，再通过诱变育种技术可获得高产阿魏酸脱羧酶的变异菌株，然后通过对变异菌株进行遗传稳定性试验而获得生产用菌株。诱变育种具有极其重要的实践意义，目前发酵工业生产所使用的高产菌株，几乎全部都是通过诱变育种从而明显提高其生产性能的。诱变育种具有简便易行、经济、高效等优点，仍是目前广泛使用的一种微生物育种方法。诱变育种一般以野生菌株为出发菌株，选择合适的诱变剂及剂量进行诱变处理，再筛选出达到目标的变异菌株。诱变育种根据所采用的物理诱变剂和化学诱变剂分为物理诱变育种和化学诱变育种，化学诱变剂有烷化剂、碱基类似物及脱氨剂等，物理诱变剂常用紫外线、X-射线、Y-射线和快中子等。由于用紫外线作诱变剂不需要特殊的设备，只需要普通的灭菌紫外线灯，而且诱变效果显著，因此被广泛应用于工业育种中。
[0005]据报道，在许多微生物的发酵产品中能够检测到4-乙烯基愈创木酚，这是由于微生物产生的阿魏酸脱羧酶的作用，其中酿造酱香型白酒用的高温大曲中4-乙烯基愈创木酚的含量较高，这意味着大曲中含有产生相对较高的阿魏酸脱羧酶活力的微生物。高温大曲是以小麦为原料，经过严格和复杂的生产工艺而制成，它富含各种微生物包括细菌、酵母和真菌。杆菌属sp.)微生物因其能在低水分、高温度的情况下生存而成为大曲微生物菌群体系中的主要微生物，杆菌属UaciBm 5ρ.)微生物产生的淀粉酶、蛋白酶等能使其充分利用环境中的营养物质而生长繁殖并代谢产生白酒风味物质。据我们研究，大曲中大部分阿魏酸脱羧酶产生菌是一类产芽孢的杆菌属，但这些微生物所产的阿魏酸脱羧酶活力较低，因而难以进行工业化生产。
[0006]目前由于野生型微生物产生的阿魏酸脱羧酶的活力比较低，阿魏酸脱羧酶基因工程菌也处于研究阶段，阿魏酸脱羧酶的生产还没有形成工业化规模，因此通过诱变育种技术获得高活性阿魏酸脱羧酶产生菌株以及实现阿魏酸脱羧酶的规模化生产是十分必要的。
[0007](三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用。
[0008]本发明是通过如下技术方案实现的:
一种环状芽孢杆菌，其特征在于:所述环状芽孢杆菌UaciBm circulans)m\2菌株是从中国白酒厂酿造酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得的，该菌株已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCCN0.8044。
[0009]上述环状芽孢杆菌菌株的微生物学特征为:菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为(0.6-1.0) MfliX (1.8-3.8) Mm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55°C下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。
[0010]本发明所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，包括如下步骤:
(1)从试管斜面上选取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在35-40°C、120-160r/min条件下，培养12_16h，制得活化后的液体种子；
(2)将液体种子按体积分数为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-14h，加入阿魏酸，继续发酵36-48h，制得含有阿魏酸脱羧酶的发酵液；
(3)将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，用超滤膜将滤出液过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品。
[0011]其优选的技术特征为:
步骤(I)中，液体种子培养基的组分为:葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L, NaCl 5.0g/L, pH 7.0,蒸馏水定容。
[0012]步骤(2)中，液体发酵培养基的组分为:葡萄糖80_120g/L，蛋白胨30.0g/L，牛肉膏20.0g/L,磷酸氢二钾20.0g/L,阿魏酸0.5-1.0g/L, pH 7.0,蒸馏水定容。[0013]步骤(2)中，液体种子的发酵条件为37-40°C、160-200r/min，阿魏酸的用量为
5.0-10.0g/L。
[0014]步骤(3)中，微孔滤膜的工作压力为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径为0.2-0.4Mm。
[0015]步骤(3)中，超滤膜的工作压力为0.2-0.5MPa，其截留分子量为10000_12000Dal。
[0016]本发明选育的环状芽孢杆菌菌株具有生长繁殖速度快，可在阿魏酸的诱导下产生阿魏酸脱羧酶以及产阿魏酸脱羧酶性能稳定的特点。
[0017]本发明选育的环状芽孢杆菌(MaciIIus drculans) HG12菌株产阿魏酸脱酸酶活力高，其发酵液中酶活力可达202.6U/mL，采用其生产的阿魏酸脱羧酶制剂可以生产食品行业的风味物质4-乙烯基愈创木酚。
[0018]本发明可以实现阿魏酸脱羧酶生产的连续化、规模化，便于其工业化生产，并且酶的生产工艺简便、生产周期短、成本低。
[0019](四)【专利附图】
【附图说明】
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0020]图1为本发明环状芽孢杆菌circulans) HG12菌株在液体种子培养基中的生长曲线图；
图2为本发明环状芽孢杆菌circuIans) HG12菌株的发酵液中阿魏酸脱酸酶活力与传代次数的关系图。
[0021](五)【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。[0022]实施例中所述环状芽孢杆菌QBacillus circulans) HG12菌株，已于2013年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC N0.8044。
[0023]本发明中阿魏酸脱羧酶的活力测定步骤如下:
取9.71g阿魏酸溶于50°C、IOOOmL的去离子水中，制得浓度为50mmol/L的阿魏酸溶液；取阿魏酸脱羧酶样品溶于去离子水中，再用磷酸氢二钠(0.2mol/L)-柠檬酸(0.1mol/L)缓冲液(pH5.2)将酶溶液稀释至酶活力单位为0.1-0.2U/mL，制得阿魏酸脱羧酶样品溶液；取10.0mL阿魏酸溶液加入到90.0mL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.2)中，振荡摇匀，将溶液稀释10倍，制得底物溶液。
[0024]取2.0mL的底物溶液加热到40°C，再加入1.0mL阿魏酸脱羧酶样品溶液，迅速混匀后,在40°C下反应30min，然后立即在沸水浴中维持IOmin终止反应,离心收集上清液,室温下冷却，制得待测溶液。采用高效液相色谱仪(购自上海天普分析仪器有限公司)测定待测溶液中反应生成的4-乙烯基愈创木酚的含量。
[0025]阿魏酸脱羧酶的酶活力单位定义为:在测定条件下，每分钟水解阿魏酸产生IMmol的4-乙烯基愈创木酹所需的酶量为1U。
[0026]原料来源:阿魏酸购自上海谱振生物科技有限公司。
[0027]实施例1
环状芽孢杆菌UaciBm circulans) m\2菌株具有典型的环状芽孢杆菌特征:菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为(0.6-1.0) MfflX (1.8-3.8) Mm，产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55°C下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。
[0028]实施例2
环状芽孢杆菌(AaciJrJrW1S circw/afls) HG12菌株的分离筛选,步骤如下:
(I)本发明涉及的菌株来源于生产酱香型白酒“贵州安酒”的高温大曲。称取粉碎均匀的高温大曲粉IOg于20mL无菌生理盐水中，在37°C、150r/min下振荡24h，制得菌悬液；将菌悬液置入80°C水浴中，加热20min ;然后取适量上述菌悬液无菌操作接入肉汤培养基中，37°C、150r/min下培养18h，得培养液；将上述培养液再经过80°C、20min处理后，冷却，以10倍稀释法适当稀释后，在营养琼脂培养基平板上涂布，37°C培养48h。挑取生长较好、性状不同的菌落接种于肉汤琼脂斜面培养基中，作为筛选用菌株。
[0029](2)将上述菌株接种于初筛培养基平板上，37°C培养48h。从初筛培养基上选择显示白色透明圈的菌落接种于复筛培养基中，在37°C、150r/min下培养48h进行复筛，得到一株产阿魏酸脱羧酶活力最高的菌株H1，经检测其发酵液中阿魏酸脱羧酶活力为23.2U/mL。将菌株Hl保藏在营养琼脂斜面培养基上，并作为诱变出发菌株。
[0030](3)将菌株Hl接种于液体种子培养基中，37°C培养24h，制得菌体细胞悬浮液。取IOmL细胞悬浮液倒入无菌平皿中，放在紫外诱变箱内距15W紫外灯30cm处，紫外线照射200s。取ImL上述菌液于无菌试管中，30°C避光培养24h，得培养液。将培养液分别稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍，得菌体稀释液，然后将菌体稀释液涂布于初筛培养基平板上，37°C避光培养24h。从初筛培养基平板上挑选产生白色透明圈的菌落接种于复筛培养基中，在37°C、150r/min下避光培养48h进行复筛，测定培养液中阿魏酸脱羧酶的酶活，获得一株酶活最高的菌株，命名为HG12，其发酵液中的酶活力达到107.3U/mL,比出发菌株Hl的酶活力提高了 3.63倍。将菌株HG12保藏在营养琼脂斜面培养基上，备用。
[0031](4)用接种环从菌株试管斜面上挑取I环HG12菌株接种于液体种子培养基中，37°C下、培养22h,每2h取样用752型分光光度计(购自上海光学仪器一厂)测定菌株培养液在600nm处的吸光度值，以培养时间(T)为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标，制得菌体细胞生长曲线(结果如图1所示)，由生长曲线可知选育的HG12菌株具有生长繁殖速度快的特点。
[0032]所述步骤(I)中的肉汤琼脂斜面培养基组分如下(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂 20.0, pH 7.0。
[0033]所述步骤(I)、(2)、(3)中的营养琼脂培养基组分如下(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏
3.0, NaCl 5.0,琼脂 20.0, pH 7.0。
[0034]所述步骤(2)、(3)中的初筛培养基组分如下(g/L) =K2HPO4 6.0，KH2PO4 4.0,MgSO4.7H20 0.20，(NH4)2SO4 2.0, NaCl 0.10，阿魏酸 20.0，琼脂 20.0, pH 7.2。
[0035]所述步骤(2)、(3)中的复筛培养基组分如下(g/L):葡萄糖20.0，蛋白胨10.0,阿魏酸 5.0, K2HPO4 6.0, KH2PO4 4.0, MgSO4.7H20 0.20，(NH4)2SO4 2.0, NaCl 0.10，pH 7.2，蒸
馏水定容。[0036]所述步骤(3)、(4)中的液体种子培养基组分如下(g/L):葡萄糖5.0，蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0, pH 7.0，蒸馏水定容。
[0037]实施例3
环状芽孢杆菌{Bacillus circw7a/750HG12菌株产阿魏酸脱羧酶的稳定性实验,步骤如
下:
将选育的环状芽孢杆菌HGl2菌株依次转接到斜面培养基上，共传代5次，在37°C下、培养24h，制得不同代数的试管斜面；再分别从不同代数的试管斜面上挑取菌株各I环接种到液体种子培养基中，在37°C、150r/min条件下，培养16h，制得活化后的液体种子；将制得的液体种子按5% (v/v)的接种量分别接种于液体发酵培养基中,在40°C、200r/min条件下，培养48h。测定不同代数菌株的发酵液中的阿魏酸脱羧酶活力(结果如图2所示)，以菌株Hl为对照，选育的环状芽孢杆菌HG12菌株具有比较稳定的产生阿魏酸脱羧酶的性能。
[0038]所述的液体种子培养基组分如下(g/L):葡萄糖5.0，蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH 7.0，蒸馏水定容。
[0039]所述的发酵培养基组分如下(g/L):葡萄糖20.0，蛋白胨10.0,阿魏酸5.0, K2HPO4
6.0, KH2PO4 4.0, MgSO4.7H20 0.20，(NH4)2SO4 2.0, NaCl 0.10，pH 7.0，蒸馏水定容。
[0040]实施例4
一种利用环状芽孢杆菌circulans) HG12菌株发酵生产阿魏酸脱羧酶的方法，步骤如下:
(I)用接种环从菌株试管斜面上挑取I环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到IOmL的液体种子培养基中，在37°C、150r/min条件下，培养14h，制得活化后的液体种子。
[0041](2)将步骤(I)制得的液体种子按照5% (v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中，在40°C、160r/min条件下，发酵12h，加入2.0g的阿魏酸，在40°C、200r/min条件下，继续发酵48h，制得含有阿魏酸脱羧酶的发酵液。
[0042](3)将步骤(2)制得的含有阿魏酸脱羧酶的发酵液在0.1MPa压力下用孔径为
0.2Mm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液，在0.5MPa压力下采用截留分子量为IOOOODal的超滤膜将滤出液过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品2.68g。
[0043]经检测发酵液中的阿魏酸脱羧酶活力为202.6U/mL。
[0044]所述步骤(I)中的液体种子培养基组分如下(g/L):葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，NaCl 5.0, pH 7.0,蒸馏水定容。
[0045]所述步骤(2)中的液体发酵培养基组分如下(g/L):葡萄糖120，蛋白胨30.0，牛肉膏20.0，磷酸氢二钾20.0,阿魏酸1.0，pH 7.0，蒸馏水定容。
[0046]实施例5
一种利用环状芽孢杆菌circulans) HG12菌株发酵生产阿魏酸脱羧酶的方法，步骤如下:
(1)同实施例4的步骤(I)
(2)将步骤(I)制得的液体种子按3%(v/v)的接种量接种到200mL的液体发酵培养基中,在37°C、160r/min条件下,发酵14h,加入2.0g的阿魏酸,在37°C、200r/min条件下,继续发酵36h，制得含有阿魏酸脱羧酶的发酵液。[0047](3)将步骤(2)制得的含有阿魏酸脱羧酶的发酵液在0.05MPa压力下用孔径为0.4Mm的微孔滤膜过滤除菌，收集滤出液，在0.2MPa压力下采用截留分子量为12000Dal的超滤膜将滤出液过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品2.42g。
[0048]经检测发酵液中的阿魏酸脱羧酶活力为184.2U/mL。
[0049]所述步骤(2)中的液体发酵培养基组分如下(g/L):葡萄糖80，蛋白胨30.0，牛肉膏20.0，磷酸氢二钾20.0,阿魏酸0.5，pH 7.0，蒸馏水定容。
[0050]实施例6
如实施例4所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans) HG12菌株发酵生产阿魏酸脱羧酶的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，阿魏酸的加入量为1.0g。
[0051]制得阿魏酸脱羧酶产品2.54g。
[0052]经检测发酵液中的阿魏酸脱羧酶活力为193.7U/mL。
[0053]实施例7
如实施例5所述的利用环状芽孢杆菌{Bacillus circulans) HG12菌株发酵生产阿魏酸脱羧酶的方法，不同之处在于:
步骤(2)中，阿魏酸的加入量为1.0g。
[0054]制得阿魏酸脱羧酶产品2.41g。
[0055]经检测发酵液中的阿魏酸脱羧酶活力为178.3U/mL。
【权利要求】
1.一种环状芽孢杆菌，其特征在于:所述环状芽孢杆菌菌株是从中国白酒厂酿造酱香型白酒用的高温大曲中分离，并经过紫外线诱变筛选获得的，其菌种保藏编号为CGMCC N0.8044。
2.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌，其特征为，所述环状芽孢杆菌OfeciJAz1S 菌株的微生物学特征为:菌落呈乳白色、有褶皱、无光泽、表面不光滑；菌体呈杆状、直或接近直、单个或成链状，细胞大小约为(0.6-1.0) MmX (1.8-3.8) Mm,产芽孢、孢囊膨大、芽孢椭圆形、芽孢中生到端生；革兰氏阳性、兼性厌氧、有机化能异养菌，利用葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，V-P反应阴性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，可水解酪蛋白、明胶和淀粉，不利用柠檬酸盐、丙酸盐，在培养温度为55°C下生长；可发酵小麦麸皮、小麦、大麦、高粱的一种或几种组合制成的液体培养基和固态培养基，产生明显的酱香香气。
3.根据权利要求1所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征为，包括如下步骤:(I)从试管斜面上选取1-2环环状芽孢杆菌HG12菌株接种到液体种子培养基中，在35-40°C、120-160r/min条件下，培养12_16h，制得活化后的液体种子；(2)将液体种子按体积分数为3-5%的接种量接种到液体发酵培养基中，发酵10-14h，加入阿魏酸，继续发酵36-48h，制得含有阿魏酸脱羧酶的发酵液；(3)将发酵液用微孔滤膜过滤，收集滤出液，用超滤膜将滤出液过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得阿魏酸脱羧酶产品。
4.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征在于:步骤(I)中，液体种子培养基的组分为，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L,NaCl 5.0g/L, pH 7.0,蒸懼水定容。
5.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征在于:步骤(2)中，液体发酵培养基 的组分为，葡萄糖80-120g/L，蛋白胨30.0g/L，牛肉膏20.0g/L,磷酸氢二钾20.0g/L,阿魏酸0.5-1.0g/L, pH 7.0,蒸馏水定容。
6.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征在于:步骤(2)中，液体种子的发酵条件为37-40°C、160-200r/min，阿魏酸的用量为5.0-10.0g/L0
7.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征在于:步骤(3)中，微孔滤膜的工作压力为0.05-0.1MPa，微孔滤膜的孔径为0.2-0.4Mm。
8.根据权利要求3所述的环状芽孢杆菌在制备阿魏酸脱羧酶中的应用，其特征在于:步骤(3)中，超滤膜的工作压力为0.2-0.5MPa，其截留分子量为10000_12000Dal。
【文档编号】C12N9/88GK103451133SQ201310383629
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】董永胜 申请人:齐鲁工业大学