一种改造的土曲霉工程菌及其和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种改造的土曲霉工程菌及其和应用。所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入糖化酶表达框得到的重组土曲霉。本发明针对土曲霉菌株实施基因工程改造，从分子水平提高土曲霉表达分泌糖化酶的能力，从而提高土曲霉直接利用淀粉液化液发酵产衣康酸的能力，简化土曲霉发酵产衣康酸的生产工艺。
【专利说明】一种改造的土曲霉工程菌及其和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种改造的土曲霉工程菌及其和应用。
【背景技术】
[0002] 衣康酸是一种重要的化工产品，被美国能源部认为是十二个重要高附加值化学品 之一，主要用于腈纶化纤、树脂、橡胶、涂料、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域。自然 界中有多种丝状真菌能将单糖转换成衣康酸，其中土曲霉作为衣康酸生产菌株被广泛应用 于工业生产。目前，土曲霉发酵产衣康酸所用的碳源主要是葡萄糖，而工业生产中的葡萄糖 主要是淀粉经过两个步骤水解获得，首先淀粉经过α -淀粉酶液化后得到淀粉液化液，然 后再经糖化酶的糖化作用最终获得糖化液，即葡萄糖液(高善礼.新型糖化酶在淀粉制葡 萄糖中的应用.安徽化工，2012,38 (4):24-26.)。黑曲霉水解淀粉的酶系较发达，能直接 通过利用淀粉作为碳源来生长，其高效分泌糖化酶的能力尤为突出，已被工业化应用于生 产糖化酶。因此在有些黑曲霉发酵产柠檬酸的工艺中直接采用淀粉液化液作为原料进行发 酵，省去了添加糖化酶进行糖化的过程。为了简化土曲霉发酵产衣康酸工艺从而降低生产 成本，对菌株进行改良、开发具有更多优良特性的菌株具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种改造的土曲霉工程菌及其和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0005] -种改造的土曲霉工程菌，所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入糖化酶 表达框得到的重组土曲霉。
[0006] 所述糖化酶表达框由丝状真菌启动子、编码糖化酶的核苷酸序列和终止子组成； 其中，启动子为土曲霉自身的柠檬酸合成酶基因的启动子；编码糖化酶的核苷酸序列为黑 曲霉的糖化酶基因；终止子为构巢曲霉的TtrpC终止子。
[0007] 改造的土曲霉工程菌的构建方法，通过基因工程改造构建糖化酶表达框，将其插 入土曲霉中得到含有糖化酶表达框的重组土曲霉。
[0008] 改造的土曲霉工程菌的应用，利用改造的土曲霉工程菌发酵生产衣康酸。
[0009] 采用改造的土曲霉工程菌作为发酵菌株于以淀粉液化液或淀粉糖化液作为碳源 的发酵培养基中发酵生产衣康酸。
[0010] 本发明提供的基因工程改造的土曲霉工程菌株，包含有一个糖化酶表达框 (expression cassette),该表达框由一个丝状真菌启动子、编码糖化酶的核苷酸序列和终 止子组成。所采用的丝状真菌启动子为来源于土曲霉自身的柠檬酸合成酶基因的启动子， 由613个碱基组成。所用编码糖化酶的核苷酸序列是来自于黑曲霉的糖化酶基因，大小为 1923bp如序列所示。所采用的终止子为来源于构巢曲霉的TtrpC终止子。
[0011] 制备这种基因修饰的土曲霉菌株包括以下步骤：
[0012] 1)构建携带有糖化酶基因的表达盒Pcs3-glal-TtrpC的质粒pXH43-glal ;
[0013] 2)利用质粒pXH43-glal转化土曲霉CICC40205,获得含有糖化酶基因表达盒 Pcs3-glal-TtrpC的土曲霉工程菌株。
[0014] 利用上述土曲霉工程菌株发酵生产衣康酸的方法，在该方法中发酵培养基所使用 的碳源可以是未经糖化的淀粉液化液，也可以是淀粉液化液部分糖化后的产物(缩短糖化 时间)。采用该土曲霉作为发酵菌株生产衣康酸，能够省去利用糖化酶水解的糖化工艺或者 缩短糖化时间，并且该土曲霉工程菌株自身分泌表达的黑曲霉糖化酶能水解糖液中残留的 麦芽糖等寡糖，最终能提高残糖的利用率，降低衣康酸的生产成本。
[0015] 本发明所具有的优点：利用本发明构建土曲霉发酵产衣康酸，使在制糖工艺中省 略糖化工艺，或者缩短糖化时间，经过该方法改造的土曲霉工程菌株在发酵过程中能高效 利用淀粉液化液作为原料生产衣康酸。
[0016] 采用本发明提供的土曲霉工程菌株以淀粉液化液为原料直接发酵生产衣康酸，在 摇瓶发酵阶段，终点衣康酸产量为55. 6g/L，而在相同条件下，未经本发明改造的出发菌株 土曲霉CICC40205的终点衣康酸产量为17. lg/L。
[0017] 本发明针对土曲霉菌株实施基因工程改造，从分子水平提高土曲霉表达分泌糖化 酶的能力，从而提高土曲霉直接利用淀粉液化液发酵产衣康酸的能力，简化土曲霉发酵产 衣康酸的生产工艺。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例提供的载体pJL-8质粒图谱。其中hph-casette为潮霉素抗 性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pcs3为土曲 霉柠檬酸合成酶基因启动子。
[0019] 图2为本发明实施例提供的载体pXH43质粒图谱。其中hph-casette为潮霉素抗 性元件；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pcs3为土曲霉柠檬酸合成酶基因启动子。
[0020] 图3为本发明实施例提供的载体pXH43_glal质粒图谱。其中hph-casette为潮 霉素抗性元件；glal为黑曲霉糖化酶基因 I JtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pcs3 为土曲霉柠檬酸合成酶基因启动子。
[0021] 图4为本发明实施例提供的PCR分析基因工程土曲霉菌株中glal基因表达盒的 整合情况图。其中M :DNA maker ;1 :重组菌株Gl-1;2 :重组菌株Gl-2;3 :重组菌株Gl-3;4 : 重组菌株Gl-4;5 :重组菌株Gl-5;6 :重组菌株Gl-6;7 :重组菌株G1-7 ;8 :重组菌株G1-8 ; 9:出发菌株CICC40205 (阴性对照）。
[0022] 图5为本发明实施例提供的构建的重组土曲霉菌株摇瓶中利用淀粉液化液发酵 产衣康酸能力的比较图，其中，CICC40205为出发菌株，其余菌株为过表达黑曲霉糖化酶基 因 glal的土曲霉工程菌株。
[0023] 图6为本发明实施例提供的HPLC分析菌株发酵液中衣康酸的纯度效果图。其中， a :出发菌株CICC40205的发酵液；b:重组菌株G1-5的发酵液。
【具体实施方式】
[0024] 在本发明的实施方案中，丝状真菌启动子定义为一种在丝状真菌中能结合RNA聚 合酶并指导聚合酶到达编码生物物质的核酸序列的正确的下游转录起始位点从而开始转 录的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化与编码区适当DNA链互补的信息RNA的装配。启 动子还可以理解为包括用于转录mRNA后用于翻译5'非编码区（介于启动子和转录起始位 点之间)，cis-作用转录调控元件，如增强子和能与转录因子相互作用的其他核酸序列。
[0025] 载体（vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状 DNA分子。
[0026] 此处所述的淀粉液化液意指淀粉经淀粉酶水解处理之后得到的产物。工业生产中 一般采用淀粉酶-糖化酶双酶法来将淀粉转化成葡萄糖。即先用淀粉酶水解处理淀粉得 到淀粉液化液(主要为葡萄糖、麦芽糖、极限糊精等)，再加入糖化酶进一步水解得到糖化液 (主要成分是葡萄糖)。
[0027] 此处使用的糖化酶（Glucoamylase，EC 3. 2. L 3.)或gla意指自然发生的糖化 酶（例如，叙述在〃Boel E·，Hansen M.T·，Hjort I·，Hoegh I·，Fiil N.P·，Two different types of intervening sequences in theglucoamylase gene from Aspergillus niger. EMBO J. 3:1581-1585(1984)"
[0028] Boel E.,Hjort I. ,Svensson B.,Norris F.,Norris K.E.,FiilN. P.^Glucoamylases Gland G2from Aspergillus niger are synthesizedfrom two different but closely related mRNAs. ^EMBO J. 3:1097-1102 (1984)
[0029] Sorimachi K. , Jacks A. J. , Ie Gal-Coeffet M.-F. , Williamson G. , Archer D.B.,WiIliamson M.P."Solution structure of the granularstarch binding domain of glucoamylase from Aspergillus niger bynuclear magnetic resonance spectroscopy. "J. Mol. Biol. 259:970-987(1996)与其功能等同物（functional equivalent)。
[0030] 本发明中提供为示范的为黑曲霉糖化酶。其他糖化酶的例子列在下表I中：
[0031] 表1.示范的糖化酶的GenBank登录号
[0032]
【权利要求】
1. 一种改造的土曲霉工程菌，其特征在于：所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中 插入糖化酶表达框得到的重组土曲霉。
2. 按权利要求1所述的改造的土曲霉工程菌，其特征在于：所述糖化酶表达框由丝状 真菌启动子、编码糖化酶的核苷酸序列和终止子组成；其中，启动子为土曲霉自身的柠檬酸 合成酶基因的启动子；编码糖化酶的核苷酸序列为黑曲霉的糖化酶基因；终止子为构巢曲 霉的TtrpC终止子。
3. -种权利要求1所述的改造的土曲霉工程菌的构建方法，其特征在于：通过基因工 程改造构建糖化酶表达框，将其插入土曲霉中得到含有糖化酶表达框的重组土曲霉。
4. 一种权利要求1所述的改造的土曲霉工程菌的应用，其特征在于：利用改造的土曲 霉工程菌发酵生产衣康酸。
5. 按权利要求4所述的改造的土曲霉工程菌的应用，其特征在于：采用改造的土曲霉 工程菌作为发酵菌株于以淀粉液化液或淀粉糖化液作为碳源的发酵培养基中发酵生产衣 康酸。
【文档编号】C12N1/15GK104419650SQ201310391924
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】李建军, 黄雪年, 吕雪峰, 李悦明, 张希铭, 李霞 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 青岛科海生物有限公司