一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法
【专利摘要】本发明公开一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法。本发明是利用负载膜将所筛选菌株接种到印迹膜上进行诱导培养，所分泌的脂肪酶结合到印迹膜，再利用脂肪酶催化酯类水解的产物可与显色剂显色的原理对分泌型脂肪酶基因工程菌进行高通量筛选。本发明可筛选到具有特殊性能的分泌型脂肪酶基因工程菌，尤其是耐高温、耐甲醇等脂肪酶基因工程菌株。本发明可对大量脂肪酶工程菌突变库进行高通量筛选，在获得筛选高效性的同时，保证了亚克隆库的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选，适用范围广，操作简单便捷，结果准确。
【专利说明】一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹 高通量筛选方法。
【背景技术】：
[0002] 脂肪酶是重要的工业酶制剂之一，可以催化脂解、酯交换、酯合成等反应，广泛应 用于食品行业，造纸行业，皮革行业，饲料行业，医药催化合成，油脂奶酪加工及生物柴油生 产等行业。然而，脂肪酶本身是一种蛋白质，必须在一定的条件下才能发挥其催化作用，一 旦外界条件诸如温度、pH及有机溶剂浓度等改变的情况下就容易失活。为了获得酶活力更 高、性能更加稳定的脂肪酶，目前研宄人员通常采用分子进化、定点突变等方法对脂肪酶进 行改造，而这些方法都涉及脂肪酶突变文库的构建及高通量筛选等步骤。一种高效的高通 量筛选方法是保证突变文库顺利进行筛选的关键因素。
[0003] 目前通常的脂肪酶高通量筛选方法是指示剂显色法及水解圈法。这些方法涉及粗 酶大量发酵及酶活力测定等步骤，工作量大，耗费时间长。已有改进方法是对硝基苯酚显色 法，通过将对硝基苯酚酯直接铺在突变库菌株的表面，再根据颜色反应筛选脂肪酶活力高 的菌株。该方法虽在筛选效率上有所提高，但是这些方法在保证亚克隆库的完整性及特殊 条件下的筛选（如高甲醇浓度、高pH等）存在着一定的局限性。因此，迫切需要获得一种 新型脂肪酶基因工程菌株的高通量筛选方法，既要保证筛选的高效性，又要保证亚克隆库 的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是提供一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法。该 方法能够筛选具有特殊性能的如耐高温、耐甲醇及产酶活力高的分泌型脂肪酶基因工程 菌。
[0005] 本发明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，包括 以下步骤：
[0006] (1)、将分泌型脂肪酶基因工程菌接种到基础培养基上进行培养，所述的分泌型脂 肪酶基因工程菌含有能够表达脂肪酶的表达载体，该表达载体上含有正常的或者经过突变 的脂肪酶基因表达盒；
[0007] (2)、将负载膜平置于步骤（1)中的接种有分泌型脂肪酶基因工程菌的基础培养 基上，使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落转移到负载膜上；
[0008] (3)、将印迹膜放置在诱导培养基上，再将步骤⑵中转移了菌落的负载膜的含菌 落面正面朝向上置于印迹膜上，并根据被筛选工程菌菌株的最佳生长温度进行诱导培养， 直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的脂肪酶基因充分表达；
[0009] (4)、将步骤（3)中的印迹膜取出，用缓冲液充分清洗，洗膜结束后将印迹膜取出， 将其浸在显色溶液中，静置一段时间直至颜色显现，将印迹膜取出，再用缓冲液充分清洗；
[0010] (5)、观测印迹膜的显色情况，所显颜色越深说明其菌株所产脂肪酶活力越高，根 据印迹膜上颜色较深点的相应位置确定在已保存的基础培养基上表达该脂肪酶的相应位 置。
[0011] 所述的分泌型脂肪酶基因工程菌，优选为酵母或细菌。
[0012] 所述的酵母，优选为毕赤酵母。
[0013] 所述的毕赤酵母，优选为毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33。
[0014] 所述的能够表达脂肪酶的表达载体，优选为酵母表达载体，所述的酵母表达载体 为能将蛋白分泌到胞外的表达载体。
[0015] 所述的酵母表达载体，优选为酵母表达载体pPIC9K或酵母表达载体pPICZaA。
[0016] 所述的基础培养基为相应菌株的最适生长培养基，优选为MD固定培养基或YH)固 体培养基。
[0017] 所述的负载膜为能在菌落转移中起负载作用并能够支撑菌株生长的薄膜，优选为 醋酸纤维素膜或滤纸膜，负载膜的大小与培养皿相适应。
[0018] 所述的印迹膜为具有一定通透性、菌株能够透过其吸取下层营养物质且能够高效 吸附分泌蛋白的薄膜，优选为硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜，所述的印迹膜，其孔径大小 优选为〇. 22?0. 45 ym，印迹膜的大小与培养皿相适应。
[0019] 所述的诱导培养基为分泌型脂肪酶基因工程菌表达脂肪酶的培养基，优选为添加 了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培养基。
[0020] 配制好液体的基础培养基及诱导培养基后分别倒入培养皿中形成固体培养基，所 述的培养皿为方形或圆形，优选为圆形，直径大小为5?15_，优选为9_。
[0021] 步骤（3)中所述的诱导培养，诱导时间优选为12?48h。
[0022] 所述的缓冲液为具有合适pH值、乳化剂等能够使目的脂肪酶稳定的缓冲液，优选 为添加了 〇? 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100 的 pH8. 0 磷酸缓冲液。
[0023] 所述的显色溶液为一种能够被脂肪酶水解的酯类和一种能够与该酯类显色的显 色剂组合，优选为：fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕榈酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
[0024] 优选，在步骤（3)和（4)之间还包括步骤：将印迹膜置于高温下及高浓度的有机溶 液中进行处理，从而在之后的步骤中获得该温度下及该浓度的有机溶液下酶活稳定的脂肪 酶及其菌株。
[0025] 所述的将印迹膜置于高温下，优选温度为不低于55°C，所述的高浓度的有机溶液， 优选为55 %的甲醇水溶液。
[0026] 本发明中涉及到印迹膜的显色，显色原理为：脂肪酶与能被其水解的酯类发生作 用，生成能与显色剂进行显色的物质，通过颜色作为初步筛选的依据。
[0027] 本发明的优点在于：
[0028] (1)、可高通量地筛选分泌型脂肪酶的基因工程菌，更优选的，能够高通量筛选到 具备特殊性能脂肪酶基因工程菌；
[0029](2)、方便快捷，节约成本，结果灵敏准确；
[0030](3)、本发明的方法不涉及对菌株进行直接添加化学物质，不会影响菌株的生长及 活性，保证亚克隆库的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选；
[0031] (4)、本发明操作步骤简单，材料价格低廉容易获得；
[0032] (5)、本发明适用范围广泛，适用于细菌、酵母、真菌等。
【专利附图】
【附图说明】：
[0033] 图1是本发明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法的示意图，其 中（1)为在基础培养基上放置负载膜（左侧，浅蓝色表示），在诱导培养基上放置印迹膜 (右侧，黄色表示）；（2)将负载膜180°翻转使菌落面正面朝上并转移到印迹膜上，并进行 诱导培养，菌株产生的脂肪酶印迹到印迹膜上；（3)培养结束后将带有脂肪酶的印迹膜转 移到另一个器皿中；（4)在膜上分别添加缓冲液、甲醇及显色溶液处理；(4)染色结果，颜 色深的为阳性克隆；
[0034] 图2是对不同产酶能力大小的分泌型脂肪酶基因工程菌的筛选结果，其中，1?6 为不同产脂肪酶活力的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌，9K为将pPIC9K质粒转化到毕 赤酵母GS115的基因工程菌，作为阴性对照；
[0035] 图3是对脂肪酶突变文库进行高通量筛选的结果，箭头所示A1?A5菌株为所挑 选的产脂肪酶能力较大的基因工程菌菌株；
[0036] 图4是在脂肪酶基因工程菌突变文库中对耐高温脂肪酶基因工程菌菌株进行高 通量筛选的结果，箭头所示B1及B2菌株为所挑选的耐高温脂肪酶基因工程菌菌株；
[0037] 图5是在脂肪酶基因工程菌突变文库中对耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株进行高 通量筛选的结果，箭头所示C1?C6菌株为所挑选的耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株。
【具体实施方式】：
[0038] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0039] MD固体培养基、YPD固体培养基、BMMY固体培养基、磷酸缓冲液的配制方法为现有 技术。
[0040] 质粒pPIC9K、毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33均购自LifeTechnologies公司。
[0041] 滤纸膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜及PVDF膜均购自上海生物工程股 份有限公司。
[0042] 其他没有详细说明的技术步骤均为本领域人员所熟知的方法。
[0043] 实施例1 :不同产酶活力的脂肪酶基因工程菌的筛选
[0044] 将米黑根毛霉脂肪酶基因rml与pPIC9K质粒同时用EcoR I及Not I双酶切，用 T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，将转化后细胞涂布于含有l〇〇ug/mL 氨苄青霉素的LB平板中，37°C倒置培养12?16h后从平板上挑取2?5个单菌落，接种 于LB液体培养基中，37°C、250r/min振摇过夜。用质粒试剂盒进行质粒DNA的小量提取， 用EcoRI及Not I双酶切鉴定，获得连接成功的pPIC9K-rml质粒。将pPIC9K-rml质粒用 Sal I进行线性化并电转化至宿主菌毕赤酵母GS115上，涂布于MD平板上，28°C培养2-3d 后获得产酶能力大小不同的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株。
[0045] 将产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株（见表1)及 已转化了PPIC9K质粒的毕赤酵母GS115工程菌菌株（作为阴性对照），分别接种于含有MD 固体培养基的直径为9mm的培养皿上，30°C培养至长出相应单菌落；将直径为9mm的滤纸 膜平置于MD固体培养基上，用涂布棒轻压使滤纸膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移 到滤纸膜上，将该MD固体培养基平板置于4°C保存；在另一个直径为9mm的培养皿的添加 了 0. 5%甲醇的BMMY固体培养基平板上平置一张同样大小的孔径为0. 2ym的硝酸纤维素 膜，赶出气泡；将转移了菌落的滤纸膜的菌落面正面朝上置于硝酸纤维素膜上，赶出气泡， 在30°C下诱导培养36h;培养结束后将下层的硝酸纤维素膜取出，用含0. 75mg/mLNaCl、 1%TrritonX-100的pH8. 0磷酸缓冲液洗膜5min，重复3次，洗膜结束后将硝酸纤维素膜 取出，将其浸在fastblueRR萘酯水溶液（含萘酯0.4mg/ml，fastblueRR0.2mg/m)中进 行显色，静置一段时间直至显色，再将硝酸纤维素膜取出，同样用含〇.75mg/mLNaCl、l% TrritonX-100的pH8. 0磷酸缓冲洗膜5min;观测硝酸纤维素膜的显色情况，如图2所示， 显紫色的为阳性克隆的产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株 的蛋白印迹，而阴性对照并没有显色，紫色圈大小与菌落的产酶能力相符。
[0046] 表1.产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株
[0047]
【权利要求】
1. 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 将分泌型脂肪酶基因工程菌接种到基础培养基上进行培养，所述的分泌型脂肪酶 基因工程菌含有能够表达脂肪酶的表达载体，该表达载体上含有正常的或者经过突变的脂 肪酶基因表达盒； (2) 、将负载膜平置于步骤（1)中的接种有分泌型脂肪酶基因工程菌的基础培养基上， 使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落转移到负载膜上； (3) 、将印迹膜放置在诱导培养基上，再将步骤（2)中转移了菌落的负载膜的含菌落面 正面朝向上置于印迹膜上，并在一定温度下诱导培养，直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的 脂肪酶基因充分表达； (4) 、将步骤（3)中的印迹膜取出，用缓冲液充分清洗，洗膜结束后将印迹膜取出，将其 浸在显色溶液中，静置一段时间直至颜色显现，将印迹膜取出，再用缓冲液充分清洗； (5) 、观测印迹膜的显色情况，所显颜色越深说明其菌株所产脂肪酶活力越高，根据印 迹膜上颜色较深点的相应位置确定在已保存的基础培养基上表达该脂肪酶的的相应位置。
2. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌为酵母或细菌。
3. 根据权利要求2所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的酵母为毕赤酵母，进一步为毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33。
4. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的能够表达脂肪酶的表达载体为酵母表达载体，进一步为酵母表达载体PPIC9K 或酵母表达载体pPICZaA。
5. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的基础培养基为MD固定培养基或YH)固体培养基；所述的诱导培养基为添加了 0. 5?1 %甲醇的BMMY培养基。
6. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的负载膜为醋酸纤维素膜或滤纸膜，负载膜的大小与培养皿相适应；所述的印迹 膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜，其孔径大小为0. 22?0. 45 ym，印迹膜的大小与培养 皿相适应。
7. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，步骤（3)中所述的诱导培养，诱导时间为12?48h。
8. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征 在于，所述的缓冲液为添加了 〇. 75mg/mL NaCl、l% Trriton X-100的pH8. 0磷酸缓冲液； 所述的显色溶液为fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液，所述的 fastblue RR 萘醋水溶液含萘醋 0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的 fastblue B 萘 基棕榈酸醋水溶液含萘醋〇? 6mg/ml，fastblue B 0? 2mg/ml。
9. 根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特 征在于，完成步骤（3)的诱导培养之后，将印迹膜置于高温下及高浓度的有机溶液中进行 处理，从而在之后的步骤中获得该温度下及该浓度的有机溶液下酶活稳定的脂肪酶及其菌 株。
10.根据权利要求9所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特 征在于，所述的高温为不低于55°C，所述的高浓度的有机溶液为55%的甲醇水溶液。
【文档编号】C12Q1/44GK104450866SQ201410576815
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】吕鹏梅, 何东, 王治元, 袁振宏, 罗文 , 刘姝娜, 李志兵, 杨改秀, 杨玲梅 申请人:中国科学院广州能源研究所