特异性抑制人SIRT1 基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，该表达载体是根据人SIRT1?的mRNA全序列，应用RNAstructure4.4软件对靶mRNA的序列进行评估得到4条靶核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列，将shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点、连结至慢病毒siRNA载体pFIV-H1/U6-copGFP中。所述的多克隆位点包括BbsI酶切位点，正义及反义链的5’端分别添加了AAAG?及AAAA，与BbsI酶切后形成的粘性末端互补；本发明提供的人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRT1基因的表达，可用于科学研究及制备治疗人SIRT1基因表达异常相关疾病的药物。
【专利说明】特异性抑制人SIRT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]沉默信息调节因子I (silent information regulator I, SIRT1)是 NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶,属于Sirtuin家族,可在哺乳动物中表达主要表达于细胞核,最初定义为NAD依赖的去乙酰化酶家族，可使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化；是一类进化上高度保守的蛋白质，参与细胞内多种生物学事件的发生，由于SIRTl的作用依赖于NAD+，其作用与机体对氧化和代谢反应有关。研究发现SIRTl在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、有机体的能量代谢、线粒体功能保护、抵抗氧化应激和延长细胞寿命方面起着重要作用。因此SIRTl作为不同疾病治疗的靶点，逐渐被人们重视。
[0003]但，现有技术中尚无转染效率高，且可长效稳定表达特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA表达载体。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用，本发明的SIRTl shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRTl基因的表达等优点，可作为有力工具应用于制备，治疗人SIRTl基因表达异常相关疾病的药物。
·[0005]本发明的技术方案是:特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；多克隆位点包括Bbs I酶切位点，在正义及反义链的5’端分别添加了 AAAG及AAAA，与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-copGFP 表达载体。
[0006]所述的shRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对祀mRNA的序列进行评估得到4条革巴核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。
[0007]所述的第一条靶序列Nol:5’ -GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，
所述的正义链序列 No2 为:5’ -aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’，
所述的反义链序列 No3 为:5’ -aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。
[0008]所述的第二条靶序列No4: 5’- GCTGATGAACCGCTTGCTATC _3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，所述的正义链序列为 No5:5’ -aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，
所述的反义链序列为 N06: 5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。
[0009]所述的第三条靶序列No7: 5’- GCTTGATGGTAATCAGTATCT _3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，
所述的正义链序列 No8 为:5’ -aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，
所述的反义链序列 No9 为:5’ -aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。
[0010]所述的第四条靶序列NolO’: 5’- GGAGATGATCAAGAGGCAATT _3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列，
所述的正义链序列 Noll 为:5’ -aaagGGAGATGATCAAGAGGCAATT -3’，
所述的反义链序列 Nol2 为:5’ -aaaaAATTGCCTCTTGATCATCTCC -3’。
[0011]所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常相关疾病药物中的应用。
[0012]所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常，瘢痕疾病药物中的应用。
[0013]shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定:分别合成正义链盒和反义链，退火后连结至慢病毒siRNA载体pFIV-Hl/U6_copGFP (System Biosciences)中，将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定 结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定;
shRNA慢病毒表达载体的抽提:将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体。
[0014]病毒包装:将shRNA慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物共转染293 T细胞，转染后24 h使用含I %FBS的DMEM对细胞进行换液处理，转染48 h后收集细胞上清，
4000 Xg离心5 min，然后使用0.45 μ m的PVDF膜过滤上清液，冰浴保存，测定病毒滴度。
[0015]本发明的优点:
鉴于由人免疫缺陷病毒(HIV)改构而来的慢病毒载体潜在的生物安全性问题，本发明选择由猫免疫缺陷病毒(FIV)改构而来的慢病毒载体pFIV-Hl/U6-COpGFP (SystemBiosciences)构建shRNA慢病毒表达载体。本发明通过提供的shRNA寡核苷酸序列插入慢病毒的多克隆位点中，靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列，正义及反义链的5’端分别添加了 AAAG及AAAA，与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，最终构建的SIRTl shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，可持续、稳定、特异地抑制人SIRTl基因的表达等优点，可作为有利工具应用于制备，治疗人SIRTl基因表达异常相关疾病的药物。
[0016]下面结合附图和实施例对发明进一步说明，但不作为对本发明的限定。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为不同shRNA寡核苷酸链序列对人增生性瘢痕成纤维细胞SIRTl基因表达的影响；图2为不同shRNA寡核苷酸链序列对人增生性瘢痕成纤维细胞SIRTl基因蛋白表达的影响；
图3为本发明的载体图谱。
【具体实施方式】
[0018]本发明的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；多克隆位点包括Bbs I酶切位点，在正义及反义链的5’端分别添加了 AAAG 及AAAA，与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-copGFP表达载体。
[0019]所述的ShRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对IEmRNA的序列进行评估得到4条祀核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。
[0020]shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定:分别合成正义链和反义链，退火后，连结至慢病毒siRNA载体pFIV-Hl/U6_copGFP (System Biosciences)中，将连接产物转化到感受态大肠杆菌中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定;
shRNA慢病毒表达载体的抽提:将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体。
[0021]病毒包装:将shRNA慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞，转染后24 h使用含1%FBS的DMEM对细胞 进行换液处理，转染48 h后收集细胞上清，4000 X g离心5 min,然后使用0.45 μ m的PVDF膜过滤上清液，冰浴保存，测定病毒滴度。
[0022]实施例1:人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列的设计
在GenBank查找到SIRTl的mRNA全序列(ΝΜ_012238.4 | )经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA的序列进行评估得到4条靶核苷酸序列，见表1，
表1.SIRTl基因的4条特异性siRNA靶核苷酸序列
【权利要求】
1.特异性抑制人SIRTl基因表达的ShRNA慢病毒表达载体，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位点；在人SIRTl基因的shRNA靶序列正义及反义链的5’端分别添加了 AAAG及AAAA，与多克隆位点Bbs I酶切后形成的粘性末端互补；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位点中连结至pFIV-Hl/U6-COpGFP表达载体。
2.根据权利要求1所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的shRNA寡核苷酸序列是根据人SIRTl的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对祀mRNA的序列进行评估得到4条革巴核苷酸序列，分别在这4条靶核苷酸序列两端引入相应的接头后得到相对对应的shRNA寡核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第一条靶序列Nol: 5’ -GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列， 所述的正义链序列 No2 为:5’ -aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’， 所述的反义链序列 No3 为:5’ -aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。
4.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第二条靶序列No4: 5’- GCTGATGAACCGCTTGCTATC -3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列， 所述的正义链序列为 No5:5’ -aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’， 所述的反义链序列为 No6: 5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。
5.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第三条靶序列No7: 5’- GCTTGATGGTAATCAGTATCT -3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列， 所述的正义链序列 No8 为:5’ -aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’， 所述的反义链序列 No9 为:5’ -aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。
6.根据权利要求2所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征是:所述的第四条靶序列NolO’: 5’- GGAGATGATCAAGAGGCAATT -3’，两端引入相应的接头后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正义链和反义链序列， 所述的正义链序列 Noll 为:5’ -aaagGGAGATGATCAAGAGGCAATT -3’， 所述的反义链序列 Nol2 为:5’ -aaaaAATTGCCTCTTGATCATCTCC -3’。
7.根据权利要求1-6中任一项中所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常相关疾病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的特异性抑制人SIRTl基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗SIRTl基因表达异常，瘢痕疾病药物中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103589753SQ201310550544
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】白晓智, 胡大海, 陶克, 韩军涛, 朱雄翔, 董茂龙, 苏琳琳, 石继红, 汤朝武 申请人:中国人民解放军第四军医大学