一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法
【专利摘要】本发明涉及一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法，本发明通过在培养基中添加配方糖蜜、配方蚯蚓粉等物质优化其培养基配方，并配套优化发酵工艺，提供一种使伊维菌素发酵单位稳定的培养基和培养方法，其平均发酵单位在6000ug/ml以上，同国内常规发酵水平相比，提高了20%以上；其发酵周期平均缩短了10h以上，有效地解决常规发酵工艺成本高的问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现伊维菌素稳定、高效的生产。
【专利说明】一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法
【技术领域】[0001]本发明属于生物发酵【技术领域】，特别是涉及一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基和发酵方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界上的农药生产大国之一，同时也是农药出口大国之一。我国农药工业发展十分迅速，农药产量几乎翻了一番，农药品种也几乎成倍增长。随着农药创制工作的不断深化，研发水平的不断提高，一些新的农药品种和生物农药己开始向国外出口。阿维菌素类生物农药的发现揭开了抗蠕虫药研究的新纪元，作为广谱杀虫剂和杀蜗剂在医药、农业、畜牧业领域具有广泛的用途。阿维菌素、伊维菌素是阿佛曼链霉菌发酵产生的半合成大环内酯类抗寄生虫药，其商品化的阿维菌素类兽用生物农药有灭虫丁阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素以及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐等。伊维菌素生物农药由于其优异的驭虫活性和较高的安全性，被视为最为优良，而且应用最广泛的兽用驱虫药，是近20年来抗寄生虫药物研究中最为杰出的研究成果，也是目前最有前途的新型、广谱、高效、抗虫、无交叉抗性的生物杀虫剂。
[0003]目前，国内外报道的伊维菌素生产工艺主要有二个方面:一种是采用阿维菌素的均相催化选择性加氢而制得的，所用的催化剂体系为烃溶性的威尔金森催化剂，涉及的有机溶媒主要是甲苯或苯等，这种方式存在合成收率低，生产成本高，重金属和环境污染等问题；另一种是使用伊维菌素的基因工程菌，采用二级发酵或三级发酵模式生产伊维菌素，这种方式存在主要问题:
1)采用常规的培养基配方，其发酵单位不稳定，其发酵水平在3000~5000ug/ml范围内波动，导致其发酵水平差异较大。
[0004]2)发酵培养周期长，一般在180~200h，导致能耗较高。
[0005]3)综合以上原因，导致伊维菌素发酵成本较高。
【发明内容】
[0006]本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，缩短发酵周期，同时最大限度的降低发酵生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现伊维菌素稳定、高效地生产的阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基。
[0007]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产伊维菌素的发酵方法。
[0008]为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为:植物油10~20ml/L、配方糖蜜20~30g/L、配方Φ丘蝴粉20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、轻质碳酸|丐4~8g/L、硫酸铵
2~6g/L ；
所述二级种子培养基的组成为:植物油15~20ml/L、配方糖蜜25~30g/L、配方蚯蚓粉25~30g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氢钾0.4~lg/L、轻质碳酸|丐6~10g/L、硫酸铵4~8g/L、氯化钠4~6g/L、氯化钾6~10g/L ；
所述发酵培养基的组成为:植物油20~30ml/L、配方糖蜜30~40g/L、配方蚯蚓粉30~40g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氢钾0.6~0.9g/L、轻质碳酸|丐6~10g/L、硫酸铵5~10g/L、氯化钠4~6g/L、硫酸锰0.002~0.004g/L、钥酸铵0.2~0.4g/L、氯化钴0.1~0.2g/L、硫酸镁6~9g/L、氯化铁0.2~0.6g/L、聚乙二胺0.05~0.lg/L。
[0009]所述配方糖蜜的组成按重量配比计为:生物素含量为0.07~0.09%、泛酸含量为0.02~0.05%、核黄素含量为0.04~0.07%、蔗糖转化酶0.01~0.02%，其余为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
[0010]所述配方蚯蚓粉的组成按重量配比计为:蚯蚓粉、鱼粉和骨粉=6: 3: 1。
[0011]所述植物油为豆油或玉米油或菜籽油。
[0012]一种利用上述培养基的发酵方法，其特征在于其工艺步骤为:将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液接入一级种子培养基进行一级种子培养，至菌体浓度20~25%、pH值6~7、培养时间20~22h时移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30~35%、pH值6~7、培养时间22~25h时移入发酵培养基中进行发酵培养，至化学效价≥6000ug/ml、菌体浓度55~65%、pH值5~7、培养时间150~170h时终止发酵。
[0013]所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在接种培养前首先进行灭菌处理，其中
灭菌后一级种子培养基的质量要求:氨基氮40~50mg/100ml、溶磷30~40ug/ml、总糖 40 ~50g/ 100ml、pH6 ~7 ；
灭菌后二级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷35~45ug/ml、总糖 45 ~55g/100ml、pH6 ~7 ；
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮55~65mg/100ml、溶磷40~50ug/ml、总糖50 ~60g/100ml、pH:5 ~7。
[0014]所述一级种子培养条件为:
罐压 0.01 ~0.05MPa ；
罐温27~29°C ;
空气流量:0~5h，空气流量控制在20~30m3/h ；6h~移种:50~80m3/h ；
揽祥转速60~80r/min ；pH6~7。
[0015]所述二级种子培养条件为:
罐压 0.01 ~0.05MPa ；
罐温27~29°C ;
空气流量100~300mVh ；
揽祥转速80~100r/min ；pH值6~7。
[0016]所述发酵培养条件为:
a pH控制:发酵培养初始pH:6~7，发酵过程中pH5~7 ;b变温培养控制:
0~60h:培养温度27~29°C ;61~140h:25 ~27。。；
141h~放罐:26~27。。；c搅拌和溶氧控制:
0~60h:搅拌转速控制在100~120r/min，溶氧浓度不得低于60% ；
61~140h:搅拌转速控制在130~140r/min，溶氧浓度控制在20~40% ；
141h~放罐:搅拌转速控制在80~100r/min，溶氧浓度控制在30%以上；d罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
[0017]在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖和补酸或碱，其中a补油控制:采用流加法补豆油或玉米油，
发酵前60h不用进行补油，
61h~140h:脂肪含量低于5%,补入油；脂肪含量超过3%,则停止补油，
141h至发酵结束:脂肪含量低于2%，补入油；脂肪含量超过2%，则停止补油；b补水:
发酵前60h不用进行补水，
61h~发酵结束:当发酵液菌体浓度> 60%，补入已灭菌的饮用水，控制菌体浓度50~
60% ；
c补酸或碱:
`发酵前60h，pH不进行控制，
发酵61h至99h: pH < 5时，用5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至6~7 ;pH > 6时，选择20~30%的硫酸铵溶液调节pH至6~7，
发酵100h至发酵结束:pH < 5时，用5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至5~6，pH
>6时，用20~30%的硫酸铵溶液调节pH至5~6 ;
d补入氮源:在发酵周期分别在60h、90h和120h时补入氮源，其补入量为发酵液体积的0.5~1%，所述氮源为10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液；e补入麦芽糖:
发酵前60h，还原糖含量不进行控制，
发酵61h至120h:还原糖含量< 3%时，补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在
3~4%,
发酵121h至发酵结束:还原糖含量< 0.5%时，补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在0.5~1%。
[0018]本发明的技术效果:
本发明通过优化伊维菌素的培养基配方及发酵工艺，提供一种使伊维菌素发酵单位稳定的培养基和培养方法，其平均发酵单位在6000ug/ml以上，同国内常规发酵水平相比，提高了 20%以上；其发酵周期平均缩短了 10h以上，有效地解决常规发酵工艺成本高的问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现伊维菌素稳定、高效的生产。
【具体实施方式】
[0019]下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
[0020]实施例中使用的菌种阿佛曼链霉菌的摇瓶效价一般为2000~4000ug/ml。
[0021]下列实施例中配方糖蜜的组成按重量配比计为:生物素含量为0.07~0.09%、泛酸含量为0.02~0.05%、核黄素含量为0.04~0.07%、蔗糖转化酶0.01~0.02%,其余为甘
蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
[0022]配方蚯蚓粉按照蚯蚓粉、鱼粉和骨粉=6: 3: 1的重量配比配制。
[0023]本发明中一级种子培养接种量0.1~0.2%，二级种子培养和发酵培养接种量保持在10~15%。
[0024]实施例1
配置lm3 —级种子培养基:豆油10L、配方糖蜜20kg、配方蚯蚓粉20kg、蛋白胨10kg、轻质碳酸韩4kg、硫酸铵2kg。
[0025]配置10m3 二级种子培养基:豆油150L、配方糖蜜250kg、配方蚯蚓粉250kg、蛋白胨200kg、磷酸二氢钾4kg、轻质碳酸韩60kg、硫酸铵40kg、氯化钠40kg、氯化钾60kg。[0026]配置100m3发酵培养基:豆油2000L、配方糖蜜3000kg、配方蚯蚓粉3000kg、蛋白胨2500kg、磷酸二氢钾60kg、轻质碳酸韩600kg、硫酸铵500kg、氯化钠400kg、硫酸猛0.2kg、钥酸铵20kg、氯化钴10kg、硫酸镁600kg、氯化铁20kg、聚乙二胺5kg。
[0027]—级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液1L接入一级种子罐进行培养。灭菌后一级种子培养基的质量:氨基氮41.5mg/100ml、溶磷30.6ug/ml、总糖41g/100ml、pH6.8。一级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量:0~5h，采用气流搅拌代替机械搅拌，空气流量控制在20m3/h ；6h~移种:50m3/h ;搅拌转速60r/min ；pH6~7 ；培养时间20h。一级种子培养结束，其菌体浓度20.3% ；pH值6.8 ;无其它杂菌污染。
[0028]二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。灭菌后二级种子培养基的质量要求:氨基氮51mg/100ml、溶磷36.3ug/ml、总糖46.lg/100ml、pH6.9 ; 二级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量100m3/h ;搅拌转速80r/min ;pH值6~7 ;培养时间:22h。二级种子培养结束，其菌体浓度30.5% ；pH值6.7 ;无其它杂菌污染。
[0029]发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮56.7mg/100ml、溶磷41.8ug/ml、总糖50.9g/100ml、pH:6.7。酵培养条件为:发酵培养初始ρΗ6.7，变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C ； 61~140h:25~27°C ；141h~放罐:26~27V。搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在100r/min ；0~60h:溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在130r/min,溶氧浓度控制在20~40% ；141h~放罐:搅拌转速控制在80r/min，溶氧浓度控制在30%以上；发酵周期150h ;发酵过程中pH控制在5~7 ;要求无其它杂菌；罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束，化学效价6147ug/ml、菌体浓度55.7%、pH 值 6.2。
[0030]实施例2
配置lm3 —级种子培养基:玉米油12L、配方糖蜜23kg、配方蚯蚓粉22kg、蛋白胨11kg、轻质碳酸韩5kg、硫酸铵3kg。[0031]配置10m3 二级种子培养基:玉米油160L、配方糖蜜260kg、配方Φ丘蝴粉260kg、蛋白胨210kg、磷酸二氢钾5kg、轻质碳酸韩70kg、硫酸铵50kg、氯化钠42kg、氯化钾70kg。
[0032]配置100m3发酵培养基:玉米油2200L、配方糖蜜3200kg、配方蚯蚓粉3300kg、蛋白胨2600kg、磷酸二氢钾65kg、轻质碳酸韩700kg、硫酸铵600kg、氯化钠450kg、硫酸猛0.25kg、钥酸铵25kg、氯化钴12kg、硫酸镁700kg、氯化铁30kg、聚乙二胺6kg。
[0033]一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液1.2接入一级种子罐进行培养。灭菌后一级种子培养基的质量:氨基氮42.8mg/100ml、溶磷33.7ug/ml、总糖43.7g/100ml、pH6.6。一级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量:0~5h，采用气流搅拌代替机械搅拌，空气流量控制在22m3/h ；6h~移种:65m3/h ;搅拌转速65r/min ；PH6~7 ;培养时间20.5h。一级种子培养结束，其菌体浓度21.2% ;pH值6.8 ;无其它杂菌污染。
[0034]二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。灭菌后二级种子培养基的质量要求:氨基氮
53.2mg/100ml、溶磷 38.5ug/ml、总糖 47.2g/100ml、ρΗ6.7 ; 二级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量150m3/h ;搅拌转速85r/min ;pH值6~7 ;培养时间:23h。二级种子培养结束，其菌体浓度31.4% ；pH值6.5 ;无其它杂菌污染。
[0035]发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮58.4mg/100ml、溶磷42.9ug/ml、总糖52.8g/100ml、pH:6.6。酵培养条件为:发酵培养初始pH6.6，变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C ； `61~140h:25~27°C ；141h~放罐:26~27V。搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在105r/min ；0~60h:溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在132r/min,溶氧浓度控制在20~40% ；141h~放罐:搅拌转速控制在85r/min，溶氧浓度控制在30%以上；发酵周期155h ;发酵过程中pH控制在5~7 ;要求无其它杂菌；罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束，化学效价637lug/ml、菌体浓度58.8%、pH 值 5.9。
[0036]实施例3
配置lm3 —级种子培养基:豆油15L、配方糖蜜25kg、配方蚯蚓粉25kg、蛋白胨12kg、轻质碳酸韩6kg、硫酸铵4kg。
[0037]配置10m3 二级种子培养基:豆油175L、配方糖蜜270kg、配方蚯蚓粉270kg、蛋白胨225kg、磷酸二氢钾7kg、轻质碳酸韩80kg、硫酸铵60kg、氯化钠50kg、氯化钾80kg。
[0038]配置100m3发酵培养基:豆油2500L、配方糖蜜3500kg、配方蚯蚓粉3500kg、蛋白胨2700kg、磷酸二氢钾75kg、轻质碳酸钙850kg、硫酸铵750kg、氯化钠500kg、硫酸锰0.3kg、钥酸铵30kg、氯化钴15kg、硫酸镁800kg、氯化铁45kg、聚乙二胺7.5kg。
[0039]一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液1.5L接入一级种子罐进行培养。灭菌后一级种子培养基的质量:氨基氮44.8mg/100ml、溶磷35.2ug/ml、总糖45.3g/100ml、pH6.4。一级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量:0~5h，采用气流搅拌代替机械搅拌，空气流量控制在25m3/h ；6h~移种:70m3/h ;搅拌转速70r/min ；PH6~7 ;培养时间21h。一级种子培养结束，其菌体浓度22% ;pH值6.6 ;无其它杂菌污染。
[0040]二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。灭菌后二级种子培养基的质量:氨基氮
54.7mg/100ml、溶磷40.3ug/ml、总糖51g/100ml、ρΗ6.5 ; 二级种子培养条件为:罐压
0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量200m3/h ;搅拌转速90r/min ;pH值6~7 ;培养时间24h。二级种子培养结束，其菌体浓度32.5% ；pH值6.3 ;无其它杂菌污染。 [0041]发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮61.5mg/100ml、溶磷44.9ug/ml、总糖55.lg/100ml、pH:6.4。酵培养条件为:发酵培养初始pH6.4，变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C; 61~140h:25~27°C;141h~放罐:26~27V。搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在110r/min ；0~60h:溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在135r/min,溶氧浓度控制在20~40% ；141h~放罐:搅拌转速控制在90r/min，溶氧浓度控制在30%以上；发酵周期160h ;发酵过程中pH控制在5~7 ;要求无其它杂菌；罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束，化学效价6620ug/ml、菌体浓度60.7%、pH 值 5.6。
[0042]实施例4
配置lm3 —级种子培养基:菜籽油18L、配方糖蜜27kg、配方蚯蚓粉28kg、蛋白胨14kg、轻质碳酸韩7kg、硫酸铵5kg。
[0043]配置10m3 二级种子培养基:菜籽油185L、配方糖蜜285kg、配方蚯蚓粉285kg、蛋白胨235kg、磷酸二氢钾8kg、轻质碳酸韩90kg、硫酸铵70kg、氯化钠55kg、氯化钾90kg。
[0044]配置100m3发酵培养基:菜籽油2700L、配方糖蜜3800kg、配方蚯蚓粉3700kg、蛋白胨2850kg、磷酸二氢钾85kg、轻质碳酸韩900kg、硫酸铵850kg、氯化钠550kg、硫酸猛
0.35kg、钥酸铵35kg、氯化钴18kg、硫酸镁850kg、氯化铁55kg、聚乙二胺8.5kg。
[0045]一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液1.8L接入一级种子罐进行培养。灭菌后一级种子培养基的质量:氨基氮47.3mg/100ml、溶磷38.lug/ml、总糖47.8g/100ml、pH6.2。一级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量:0~5h，采用气流搅拌代替机械搅拌，空气流量控制在28m3/h ；6h~移种:75m3/h ;搅拌转速75r/min ；PH6~7 ;培养时间21.5h。一级种子培养结束，其菌体浓度23.4% ;pH值6.4 ;无其它杂菌污染。
[0046]二级种子培养:先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。灭菌后二级种子培养基的质量:氨基氮
57.6mg/100ml、溶磷 42.lug/ml、总糖 52.7g/100ml、pH6.4 ; 二级种子培养条件为:罐压
0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量250m3/h ;搅拌转速95r/min ;pH值6~7 ;培养时间24.5h。二级种子培养结束，其菌体浓度33.6% ；pH值6.2 ;无其它杂菌污染。
[0047]发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮62.9mg/100ml、溶磷47.lug/ml、总糖57.2g/100ml、pH:6.3。酵培养条件为:发酵培养初始pH6.3，变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C; 61~140h:25~27°C;141h~放罐:26~27V。搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在115r/min ；0~60h:溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在138r/min,溶氧浓度控制在20~40% ；141h~放罐:搅拌转速控制在95r/min，溶氧浓度控制在30%以上；发酵周期165h ;发酵过程中pH控制在5~7 ;无其它杂菌；罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束，化学效价6503ug/ml、菌体浓度62.4%、pH 值 5.4。
[0048]实施例5
配置lm3 —级种子培养基:菜籽油20L、配方糖蜜30kg、配方蚯蚓粉30kg、蛋白胨15kg、轻质碳酸韩8kg、硫酸铵6kg。
[0049]配置10m3 二级种子培养基:菜籽油200L、配方糖蜜300kg、配方蚯蚓粉300kg、蛋白胨250kg、磷酸二氢钾10kg、轻质碳酸|丐100kg、硫酸铵80kg、氯化钠60kg、氯化钾100kg。
[0050]配置100m3发酵培养基:菜籽油3000L、配方糖蜜4000kg、配方蚯蚓粉4000kg、蛋白胨3000kg、磷酸二氢钾90kg、轻质碳酸韩1000kg、硫酸铵1000kg、氯化钠600kg、硫酸猛
0.4kg、钥酸铵40kg、氯化钴20kg、硫酸镁900kg、氯化铁60kg、聚乙二胺10kg。
[0051]一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液2L接入一级种子罐进行培养。灭菌后一级种子培养基的质量:氨基氮49.2mg/100ml、溶磷39.3ug/ml、总糖49.2g/100ml、pH6.1。一级种子培养条件为:罐压0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C;空气流量:0~5h，采用气流搅拌代替机械搅拌，空气流量控制在30m3/h ；6h~移种:80m3/h ;搅拌转速80r/min ；pH6~7 ;培养时间22h。一级种子培养结束，其菌体浓度25% ;pH值6.2 ;无其它杂菌污染。
[0052]二级种子培养:先将`二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。灭菌后二级种子培养基的质量:氨基氮
58.9mg/100ml、溶磷 44.7ug/ml、总糖 54.6g/100ml、ρΗ6.1 ; 二级种子培养条件为:罐压
0.01~0.05MPa ;罐温27~29°C ;空气流量300m3/h ;搅拌转速100r/min ;pH值6~7 ;培养时间25h。二级种子培养结束，其菌体浓度35% ；pH值6 ;无其它杂菌污染。
[0053]发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮64.3mg/100ml、溶磷49.5ug/ml、总糖60g/100ml、pH:6.1。酵培养条件为:发酵培养初始pH6.1，变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C; 61~140h:25~27°C ;141h~放罐:26~27°C。搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在120r/min ；0~60h:溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在140r/min,溶氧浓度控制在20~40% ;141h~放罐:搅拌转速控制在100r/min，溶氧浓度控制在30%以上；发酵周期170h ;发酵过程中pH控制在5~7 ;无其它杂菌；罐压控制在0.04~0.06MPa。发酵培养结束，化学效价6428ug/ml、菌体浓度64.2%、pH值
5.1。
[0054]上述实施例1-5的发酵过程中根据情况进行补料，补料控制按照下述方式实现:a补油控制:采用流加法补豆油或玉米油。
[0055]发酵前60h不用进行补油。
[0056]61h~140h:如果脂肪含量低于5%，补入油；如果脂肪含量超过3%，则停止补油。
[0057]141h至发酵结束:如果脂肪含量低于2%，补入油；如果脂肪含量超过2%，则停止补油。[0058]b 补水:
发酵前60h不用进行补水。
[0059]61h~发酵结束:当发酵液菌体浓度> 60%，补入已灭菌的饮用水，控制菌体浓度50 ~60%。
[0060]c补酸或碱:
发酵前60h，pH不进行控制。
[0061]发酵61h至99h:如果pH < 5,选择5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至6~7。如果pH > 6，选择20~30%的硫酸铵溶液调节pH至6~7。
[0062]发酵100h至发酵结束:如果pH < 5,选择5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至5~
6。如果pH > 6，选择20~30%的硫酸铵溶液调节pH至5~6。
[0063]d补入氮源:在发酵周期分别在60h、90h和120h时补入氮源，其补入量为发酵液体积的0.5~1%，所述氮源为10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液。
[0064]e补入麦芽糖:
发酵前60h，还原糖含量不进行控制。
[0065]发酵61h至120h:如果还原糖含量< 3%，则补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在3~4%。
[0066]发酵121h至发酵结束:如果还原糖含量< 0.5%，则补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在0.5~1%。
[0067]对比实施例
配置一级种子培养基组lm3,淀粉18kg、葡萄糖25kg、黄豆饼粉25kg、酵母粉23kg、蛋白胨12kg、轻质碳酸韩6kg、硫酸铵4kg。
[0068]配置二级种子培养基10m3:淀粉200kg、葡萄糖280kg、黄豆饼粉250kg、酵母粉230kg、蛋白胨120kg、磷酸二氢钾5kg、轻质碳酸韩50kg、硫酸铵50kg、氯化钠45kg、氯化钾70kg。
[0069]配置发酵培养基100m3:淀粉2300kg、葡萄糖2000kg、黄豆饼粉2100kg、酵母粉1800kg、蛋白胨1500kg、磷酸二氢钾70kg、轻质碳酸|丐700kg、硫酸铵600kg、氯化钠450kg、氯化钴15kg、硫酸镁700kg。
[0070]一级种子培养条件:温度27~29°C、培养时间30h。
[0071]二级种子培养:温度27~29°C、罐压控制在0.03~0.05MPa、空气进气量控制在10~20m3、搅拌转速控制在80~100r/min、培养时间30小时。
[0072]发酵条件:温度27~29°C、罐压控制在0.04~0.06MPa、空气进气量控制在100~500m3、搅拌转速控制在100~150r/min、溶氧大于3ppm、发酵时间180h。发酵过程中进行补料，其化学效价为4876ug/ml。
【权利要求】
1.一种阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述一级种子培养基的组成为:植物油10~20ml/L、配方糖蜜20~30g/L、配方Φ丘蝴粉20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、轻质碳酸|丐4~8g/L、硫酸铵2~6g/L ；所述二级种子培养基的组成为:植物油15~20ml/L、配方糖蜜25~30g/L、配方蚯蚓粉25~30g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氢钾0.4~lg/L、轻质碳酸|丐6~10g/L、硫酸铵4~8g/L、氯化钠4~6g/L、氯化钾6~10g/L ；所述发酵培养基的组成为:植物油20~30ml/L、配方糖蜜30~40g/L、配方蚯蚓粉30~40g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氢钾0.6~0.9g/L、轻质碳酸|丐6~10g/L、硫酸铵5~10g/L、氯化钠4~6g/L、硫酸锰0.002~0.004g/L、钥酸铵0.2~0.4g/L、氯化钴0.1~0.2g/L、硫酸镁6~9g/L、氯化铁0.2~0.6g/L、聚乙二胺0.05~0.lg/L。
2.按照权利要求1所述的阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基，其特征在于所述配方糖蜜的组成按重量配比计为:生物素含量为0.07~0.09%、泛酸含量为0.02~0.05%、核黄素含量为0.04~0.07%、蔗糖转化酶0.01~0.02%，其余为甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
3.按照权利要求1所述的阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基，其特征在于所述配方蚯蚓粉的组成按重量配比计为:蚯蚓粉、鱼粉和骨粉=6: 3: 1。
4.按照权利要求1所述的阿佛曼链霉菌发酵生产伊维菌素的培养基，其特征在于所述植物油为豆油或玉米油或菜籽油。
5.一种利用权利要求1至4任意一项培养基的发酵方法，其特征在于其工艺步骤为:将已经培养好的阿佛曼链霉菌母瓶发酵液接入一级种子培养基进行一级种子培养，至菌体浓度20~25%、pH值6~7、培养时间20~22h时移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30~35%、pH值6~7、培养时间22~25h时移入发酵培养基中进行发酵培养，至化学效价6000ug/ml、菌体浓度55~65%、pH值5~7、培养时间150~170h时终止发酵。
6.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基在接种培养前首先进行灭菌处理，其中灭菌后一级种子培养基的质量要求:氨基氮40~50mg/100ml、溶磷30~40ug/ml、总糖 40 ~50g/ 100ml、pH6 ~7 ；灭菌后二级种子培养基的质量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷35~45ug/ml、总糖 45 ~55g/ 100ml、pH6 ~7 ；灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮55~65mg/100ml、溶磷40~50ug/ml、总糖50 ~60g/100ml、pH:5 ~7。
7.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为:罐压 0.01 ~0.05MPa ；罐温27~29°C ; 空气流量:0~5h，空气流量控制在20~30m3/h ；6h~移种:50~80m3/h ；揽祥转速60~80r/min ；pH6~7。
8.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为:罐压 0.01 ~0.05MPa ；罐温27~29°C ;空气流量100~300mVh ；揽祥转速80~100r/min ；pH值6~7。
9.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为:a pH控制:发酵培养初始pH:6~7，发酵过程中pH5~7 ;b变温培养控制:0~60h:培养温度27~29°C ;61 ~140h:25 ~27。。；141h~放罐:26~27。。；c搅拌和溶氧控制:0~60h:搅拌转速控制在100~120r/min，溶氧浓度不得低于60% ；61~140h:搅拌转速控制在130~140r/min，溶氧浓度控制在20~40% ；141h~放罐:搅拌转速控制在80~100r/min，溶氧浓度控制在30%以上；d罐压:罐压控制在0.04~0.06MPa。
10.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖和补酸或碱，其中a补油控制:采用流加法补豆油或玉米油，发酵前60h不用进行补油，`61h~140h:脂肪含量低于5%,补入油；脂肪含量超过3%,则停止补油，`141h至发酵结束:脂肪含量低于2%，补入油；脂肪含量超过2%，则停止补油；b补水:发酵前60h不用进行补水，`61h~发酵结束:当发酵液菌体浓度> 60%，补入已灭菌的饮用水，控制菌体浓度`50~`60% ；c补酸或碱:发酵前60h，pH不进行控制，发酵61h至99h: pH < 5时，用5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至6~7 ;pH > 6时，选择20~30%的硫酸铵溶液调节pH至6~7，发酵100h至发酵结束:pH < 5时，用5~10%的氢氧化钠溶液调节pH至5~6，pH>6时，用20~30%的硫酸铵溶液调节pH至5~6 ;d补入氮源:在发酵周期分别在60h、90h和120h时补入氮源，其补入量为发酵液体积的0.5~1%，所述氮源为10%的蛋白胨和15%的蚯蚓粉的混合水溶液；e补入麦芽糖:发酵前60h，还原糖含量不进行控制，发酵61h至120h:还原糖含量< 3%时，补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在`3 ~4%,发酵121h至发酵结束:还原糖含量< 0.5%时，补入已灭菌的麦芽糖，使还原糖的含量控制在0.5~1%。
【文档编号】C12R1/465GK103642865SQ201310575463
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】任勇, 王 义, 奇乃 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司