小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途，旨在提供一种同一质粒的不同启动子下多个基因的表达和准确切割表达，并成功包装出的病毒样颗粒；其技术要点是：将小核糖核酸病毒科P1/P1op基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的两个启动下，获得重组穿梭载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒，感染宿主细胞，获得病毒样颗粒。
【专利说明】小核糖核酸病毒科重组载体和病毒样颗粒及制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种病毒重组载体，还公开了包括该病毒重组载体的病毒样颗粒及病毒样颗粒及制备方法和用途，具体地说，是同一质粒下的不同启动子高效表达小核糖核酸病毒科病毒的病毒重组载体和病毒样颗粒。
【背景技术】
[0002]小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)家族包含了 17个属,大部分具有较强的致病性。其中肠病毒属(Enterovirus),代表种:小儿麻痹症病毒(poliovirus脊髓灰质炎病毒)，手足口病毒71型(Enterovirus71,EV71);鼻病毒属(Rhinovirus)，代表种:人类鼻病毒A(Human rhinovirus A);肝病毒属(Hepatovirus),代表种:肝炎A型病毒(Hepatitis Avirus, HAV);副肠内细胞病变人类孤儿病毒属(Parechovirus副肠孤病毒属)，代表种:人类副肠内细胞病变人类孤儿病毒(Human parechovirus人副肠孤病毒)，能够造成严重的人类疾病。另外心病毒属(Cardiovirus),代表种:脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus);我鸟口疮病毒属(Aphthovirus),代表种:口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)等能够引起猪牛等脊柱动物疾病。该科病毒对人类健康和生命财产造成极大的伤害，因此急需有效地防治手段。目前大部分病毒还没有疫苗和特效的治疗药物，或者疫苗需要提高其安全性和有效性。
[0003]该科病毒基因组非常相似，为单股正链RNA，长约7.2~8.4kb，两端为保守的非编码区，在肠道病毒中同源性非常高，中间为连续开放读码框架。此外，5’端共价结合约23氨基酸的蛋白质Vpg (genome-linked protein), 3’端带有约50个核苷酸的poly A尾。读码框架区分为3个区域:P1、P2和P3。P2和P3区域编码7个非结构蛋白。其中3⑶/3C为蛋白酶，负责其他蛋白的剪切功能；其他蛋白包括依赖RNA的RNA聚合酶3D，具有NTP酶活性和复合体定位细胞膜的2C，两种蛋白`酶(2B、3AB)，以及RNA5 ‘端共价多肽3B (VPg)等。Pl区编码4个病毒结构蛋白VPl~VP4。VPl、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，中和抗原和型特异性抗原位点主要集中在VPl蛋白，同时也是分型的主要依据；VP4位于衣壳内部，与病毒基因组脱壳有关。VP1、VP2和VP3蛋白形成的五聚体的顶端在病毒表面形成的峡谷样结构是受体分子结合的位点。
[0004]该类病毒粒子的装配分为4个步骤:(I)以肠道病毒为例，当外壳蛋白Pl形成后，通过个3⑶/3C蛋白进一步切割成三个紧密聚合的蛋白质(VPO、VP3、VPl)组成未成熟的原聚体(5S)。初期由于Pl和蛋白酶浓度较低，该裂解速度较慢；(2)随着蛋白酶浓度增加，未成熟的原聚体浓度增加，从而形成五聚体(14S); (3)然后12个五聚体形成空壳的(80S)病毒样颗粒(virus like particle, VLP); (4)接着正股VPg-RNA进入病毒样颗粒形成病毒前体(150S)，进而引发VPO裂解形成VP4和VP2，形成具有感染性的成熟病毒粒子。80S的病毒样颗粒不包含病毒的基因组，只是一个五聚体的仓库，不具有自主复制的能力和传染性。同时具有大部分的病毒颗粒的结构特征，因此是目前发展该类病毒疫苗的首选目标。[0005]研究表明在该类病毒中，单独的3C蛋白能够切割Pl蛋白，可以不需要3D蛋白的参与。其中FMDV的3C蛋白不但能够单独切割自身Pl蛋白，并且能够切割polio等病毒，并且其切割效率较高。而polio病毒的3C蛋白不能完全切割Pl蛋白，需要3D蛋白的参与。而EV71病毒3C蛋白切割效率的研究仍属空白。
[0006]目前研究已经有多种方法表达该类病毒VLP蛋白，用于疫苗研究。其中分别利用不同载体表达VP1、VPO和VP3的方法，转染后不能很好的得到病毒样颗粒。另外利用不同的启动子分别表达3CD和Pl基因，利用表达后的3CD蛋白剪切Pl基因后形成单体蛋白，然后形成VLP。目前报道一般利用3⑶进行切割，但是3⑶蛋白基因组较大(1600bp)加重了载体负载，同时影响了切割效率。目前利用杆状病毒系统和酵母系统的不同启动子分别表达3CD和P1，能够得到EV71、FMDV等病毒的病毒样颗粒。
【发明内容】
[0007]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种同一质粒的不同启动子下多个基因的表达和准确切割表达，并成功包装出的病毒样颗粒。
[0008]为此，本发明首先提供的一种小核糖核酸病毒科重组载体，该重组载体是将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的两个启动下，所述的Pl基因和3C基因均为小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因,所述的Plop基因为小核糖核酸病毒科的Pl基因的优化基因。
[0009]上述的小核糖核酸病毒科重组载体，将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Ppt5lh启动子和P1Ci启动子下。
[0010]上述的小核糖核酸病毒科重组载体，将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Ppt5lh启动子和Pallv启动子下。
[0011]本发明的另外一个技术方案，是提供该小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，该病毒样颗粒包括小核糖核酸病毒科的重组载体，该重组载体是将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的两个启动下，所述的Pl基因和3C基因均为小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因，所述的Plop基因为小核糖核酸病毒科的Pl基因的优化基因。
[0012]进一步的，上述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，将Pl/Plop基因和3C基因分别分别插入同一杆状病毒载体质粒的Ppolh启动子和Ρ1(ι/ΡΜν启动子下，转化DHlOa感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。
[0013]进一步的，上述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9细胞株。
[0014]为制备该病毒样颗粒，本发明还有一个技术方案是提供该病毒样颗粒的制备方法:该方法依次包括下述步骤:
[0015]I)引物设计
[0016]对pFast-dual质粒的Ppolh启动子和P10/Pemv启动子分析，设计Pl/Plop和3C基因引物；
[0017]2)穿梭载体构建
[0018]以pFast-dual为载体，采用PCR扩增Pl和3C基因，回收片段，采用限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切后，利用回收片段进行T4连接酶连接，并进行转化DHlOa感受态，得到阳性菌落后，提取质粒得到重组的各个穿梭载体；
[0019]3)重组杆状病毒载体构建
[0020]将上述构建好的穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，选白色阳性菌落，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，经过扩大培养阳性克隆后，提取重组杆粒；
[0021]4)重组杆状病毒的包装
[0022]将包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因的重组杆粒转染昆虫细胞Sf9后，得到包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因重组杆状病毒；
[0023]5)重组病毒样颗粒表达
[0024]培养权利上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，在昆虫细胞中表达构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因，得到构建病毒样颗粒所需的蛋白，所述的构建病毒样颗粒所需蛋白进行自行组装，得到病毒样颗粒，形成的病毒样颗粒分泌到细胞培养上清中；
[0025]6)重组病毒样纯化
[0026]步骤5)中的上清经过初步离心去除大的细胞碎片后，采用切向流浓缩包进行浓缩后，经过分子筛和离子交换 两步得到纯化的VLP免疫样品。
[0027]本发明的最后一个技术方案是该小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒作为人或者动物抗小核糖核酸病毒疫苗的用途。
[0028]与现有技术相比本发明具有如下优点:
[0029]1、在现有技术中，通常采用EV71的3⑶基因切割EV71病毒的Pl序列，但是该存在一定问题，3CD蛋白基因组较大(1600bp)加重了载体负载，同时影响了切割效率，本发明通过实验证明，与3⑶相比，3C基因能够切割EV71病毒的VPO切割为VP2和VP4，与EV71全病毒相似，并形成该类病毒的VLP，同时具有较高的免疫原性。
[0030]2、本发明制备病毒样颗粒能够诱导高水平的抗体免疫反应和保护效果，同时具有操作简单、表达量高、切割效率高、免疫原性好、不带有外源序列等优点，因此本发明在疫苗开发领域具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1EV71VLP3C/3CD和Pl/Plop在同一质粒不同启动子下的表达构建示意图；
[0032]图2重组杆状病毒质粒PCR鉴定图；
[0033]图3第一代重组杆状病毒PCR鉴定图；
[0034]图4重组杆状病毒表达上清和细胞VPl蛋白Western Blot分析图；
[0035]图5重组EV71VLP表达载体表达分析图；
[0036]图6不同表达方式的重组杆状病毒表达EV71VLP量时序分析图；
[0037]图7EV71病毒样颗粒的负染电镜图；
[0038]图8不同重组病毒表达的EV71病毒样颗粒诱导EV71特异性IgG抗体分析图；
[0039]图9不同重组病毒表达的EV71病毒样颗粒诱导EV71中和抗体分析图；
[0040]图10不同重组病毒表达EV71VLP免疫保护研究分析图。
【具体实施方式】[0041]下面结合【具体实施方式】，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
[0042]本发明提供的技术方案所使用的材料:
[0043]材料
[0044]I主要材料
[0045]病毒:EV71_B6(疫苗株)，EV71-C2 (攻击株)；
[0046]细胞:昆虫细胞Sf9。
[0047]1.2主要试剂
[0048]病毒RNA抽提试剂盒(上海生工)；cDNA反转录试剂盒(Fermentas, Thermo)；
[0049]PremerStar DNA聚合酶(大连宝生物)；
[0050]Bac重组杆状质粒提取试剂盒(Omiga生物)；
[0051]EV71抗原ELISA检查试剂盒(北京京天成)；
[0052]各种DNA 消化酶，Xho1、Kpn1、RsrI1、Sma1、Xba1、SpeI, T4 连接酶购自 Fermentas ；
[0053]卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal、IPTG (北京鼎国)；
·[0054]LB 培养基(Sigma);
[0055]Grace，s 培养基、FBS (Gibco)；
[0056]Cellfectinll 脂质体(Sigma)；
[0057]EV71单克隆抗体5C3 (本公司制备)；
[0058]HRP 羊抗鼠二抗(Invrtrogen)。
[0059]实施例1
[0060]本发明公开的一种表达小核糖核酸病毒科重组载体，将小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因分别置于PFastBac Dual质粒的Pptjlh启动子和Pltl启动子下，获得重组载体Bac_P103C_PhP I。
[0061]实施例2
[0062]本发明公开的另一种表达小核糖核酸病毒科重组载体，将小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因分别置于PFastBac Dual质粒的Pptjlh启动子和Pemv启动子下，获得重组载体Bac-Pc3C-PhPl0
[0063]实施例3
[0064]本发明公开的一种表达小核糖核酸病毒科重组载体，将小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因优化后的Plop基因分别置于PFastBac Dual质粒的Pptjlh启动子和Pltl启动子下，获得重组载体Bac-P1(l3C-PhPl0p。
[0065]实施例4
[0066]本发明公开的另一种表达小核糖核酸病毒科重组载体，将小核糖核酸病毒科的3C基因和Pl基因优化后的Plop基因分别置于PFastBac Dual质粒的Pptjlh启动子和Pemv启动子下，获得重组载体Bac-Pe3C-PhPlop。
[0067]实施例5
[0068]本发明提供的一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科Pl基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Ppolh启动子和Pltl启动子下，转化DHlOa感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。
[0069]实施例6
[0070]本发明提供的一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，将小核糖核酸病毒科Pl基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Pptjlh启动子Pcmv启动子下，转化DHlOa感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。
[0071]实施例7
[0072]本发明提供的一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，将Pl基因优化后的Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Pptjlh启动子和Pltl启动子下，转化DHlOa感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。
[0073]实施例8
[0074]本发明提供的一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，将Pl基因优化后的Plop基因和3C基因 分别插入同一杆状病毒载体质粒的Pptjlh启动子Pcmv启动子下，转化DHlOa感受态，提取阳性质粒得到各个重组穿梭载体，再将各个穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，筛选阳性重组杆状病毒载体，转染至宿主细胞，自主包装成病毒样颗粒。
[0075]其中:基因Plop的优化方法为:
[0076]参照昆虫细胞密码子表，利用序列优化软件对Pl序列进行昆虫细胞密码子偏爱性优化。优化后结果如下:
[0077]
【权利要求】
1.一种小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的两个启动下，所述的Pl基因和3C基因均为小核糖核酸病毒科的Pl基因和3C基因，所述的Plop基因为小核糖核酸病毒科的Pl基因的优化基因。
2.根据权利要求1所述的小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的PpaLh启动子和P1O启动子下。
3.根据权利要求1所述的小核糖核酸病毒科重组载体，其特征在于，将Pl/Plop基因和3C基因分别插入同一杆状病毒载体质粒的Pptjlh启动子和P.启动子下。
4.一种小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，包括权利要求1至3任一所述的小核糖核酸病毒科重组载体。
5.根据权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，将Pl/Plop基因和3C基因分别分别插入同一杆状病毒载体质粒的Pptjlh启动子和Ρ1(1/Ρ_启动子下，获得重组穿梭载体，转染至宿主细胞，获得重组杆状病毒，感染宿主细胞，获得病毒样颗粒。
6.根据权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒，其特征在于，所述的宿主细胞为昆虫细胞Sf9细胞株。
7.制备权利要求4所述的病毒样颗粒的方法:其特征在于，依次包括下述步骤: 1)引物设计 对pFast-dual质粒的Pptjlh启动子和Pltl启动子分析，设计3C和Pl/Plop基因引物； 2)穿梭载体构建· 以pFast-dual为载体，采用PCR扩增3C和Pl/Plop基因，回收片段，采用限制性内切酶对片段和pFastBac-dual载体进行酶切后，利用回收片段进行T4连接酶连接，并转化DHlOa感受态，得到阳性菌落后，提取质粒得到重组的各个穿梭载体； 3)重组杆状病毒载体构建 将上述构建好的穿梭载体转化大肠杆菌DHlObac，选白色阳性菌落，进行PCR鉴定，得到阳性克隆，经过扩大培养阳性克隆后，提取重组杆粒； 4)重组杆状病毒的包装 将包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因的重组杆粒转染昆虫细胞Sf9后，得到包含构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因重组杆状病毒； 5)重组病毒样颗粒表达 培养权利上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，在昆虫细胞中表达构建病毒样颗粒所需的蛋白编码基因，得到构建病毒样颗粒所需的蛋白，所述的构建病毒样颗粒所需蛋白进行自行组装，得到病毒样颗粒，形成的病毒样颗粒分泌到细胞培养上清中； 6)重组病毒样纯化 步骤5)中的上清经过初步离心去除大的细胞碎片后，采用切向流浓缩包进行浓缩后，经过分子筛和离子交换两步得到纯化的VLP免疫样品。
8.权利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒样颗粒作为人或者动物抗小核糖核酸病毒疫苗的药物用途。
【文档编号】C12N15/66GK103710384SQ201310698584
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】王弋, 彭涛, 许昱华, 马书智, 安鸿, 尹海滨 申请人:广东华南联合疫苗开发院有限公司