一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，属于干细胞培养【技术领域】。以MSCSFM为基础培养基，在该基础培养基中添加细胞外基质和细胞因子，将骨髓细胞悬液离心后，在上述培养基中，37℃情况下，以1x（乘号）104/cm2细胞密度进行恒温接种培养。本发明采用无血清方式进行细胞培养，具有安全性、可靠性高等优点。
【专利说明】一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，属于干细胞培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，随着干细胞的研究不断深入，其在疾病治疗应用价值也被不断发现和证实。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类来源于发育早期的中胚层和外胚层的成体干细胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。MSCs可来源于骨髓、脂肪、脐带血、真皮、胎盘等组织；此外与其他干细胞相比，MSCs容易提取分离、增殖以及基因导入，所以其在细胞移植治疗和基因治疗中有很大的优势。同时MSCs具有多向分化的潜能，能够诱导分化为许多不同的组织，归巢特性，以及免疫调节作用，对于组织修复和免疫疾病等的治疗有很大的作用。已有不少文献证实了 MSCs对肝脏疾病积极的治疗作用。
[0003]然而，MSCs的细胞治疗应用依然存在一些问题:
(1)MSCs的血清培养存在潜在的安全风险。血清成分不明确，其中可能含有动物携带的已知的或未知的病原体，在临床应用中具有潜在的危险；
(2)需更多动物实验研究证实MSCs移植治疗的有效性和安全性。虽有一些MSCs移植治疗的临床案例，但数量少，且缺少对照。
[0004](3)利用人MSCs作为研究对象，存在取材不便及安全伦理道德的问题。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术中血清培养所存在的安全性、有效性等方面的因素，本发明提供一种无血清方式的骨髓间充质干细胞培养方法。
[0006]一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，以MSC SFM为基础培养基，在该基础培养基中添加细胞外基质和细胞因子，将骨髓细胞悬液离心后，在上述培养基中，37°C情况下，以1‘ IO4 /cm2细胞密度进行恒温接种培养。
[0007]进一步的，作为优选:
所述的细胞外基质包括Cell start和Fibronectin,细胞因子为10Pg/L bFGF。
[0008]所述的MSC SFM 为 99%MSC SFM +l%Supplement+双抗。
[0009]所述的细胞外基质Cell start使用前先以1:1000的浓度稀释于α -MEM,置37°C培养箱沉淀，实验前吸去上清液，晾干备用。
[0010]其中，MSC SFM为商品化的试剂，公司:invitrogen，目录号:A10675_01 ;产品全称:StemPro? MSC SFM XenoFree。
[0011]Cell start:公司:invitrogen,目录号:A10142 ;产品全称:CELLstartTMCTS?substrate ο
[0012]bFGF:碱性成纤维生长因子。[0013]a -MEM: 一种基础培养基。
[0014]Fibronectin:纤维连接蛋白。
[0015]本发明以StemPro? MSC SFM作为基础培养基，这种无血清培养的细胞个体及集落形态与有血清培养的具有很大的相似性，但也存在差异，其原理、有益效果以及与有血清培养的差异主要如下:
1.有血清和无血清培养的MSCs单个细胞均呈典型的梭性，集落呈菊花状或漩涡状，与典型的MSCs细胞形态和集落特性相符合。血清培养的MSCs贴壁时细胞形态狭长，铺展较开，在增殖过程中由于细胞数量及紧密度的增加使得个体细胞形态逐渐收缩变短小，集落中各细胞连接紧密；无血清培养的MSCs在贴壁时细胞形态短小，铺展程度不高，而在增殖过程中逐渐铺展开，随着细胞数量的增加，细胞形态逐渐变得狭长，在集落中细胞与细胞间连接不紧密。这些差异性可能是由于培养基的不同造成的，但并不影响MSCs的基本生物学特性。
[0016]2.无血清培养培养体系保持了 MSCs的干性特征:具有典型的MSCs细胞和集落形态，表型特征，及具有脂肪，成骨，软骨的分化潜能。采用脂肪、成骨、软骨分化培养液对无血清体外扩增的MSCs进行分化培养，并取分化后细胞RNA进行各分化标志基因(Ppar、RUNX2、S0X9)及干性标志基因(⑶29、⑶44)的荧光定量分析，结果显示，无血清体外培养的MSCs也具有向脂肪、成骨、软骨分化的能力，在分化的过程中，各分化标志基因的表达能力逐渐增强，干性标志基因的表达能力逐渐减弱。
[0017]3.基于上述两点，无血清培养方式解决了常规有血清培养所存在的安全性、有效性的问题，采用本发明无血清培养方式，取材更方便，也更符合人性化和伦理道德对细胞培养的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为不同培养条件下骨髓间充质干细胞的形态(100倍下，A-C:有血清培养，分别培养第1、6、12天；D-F:无血清培养，分别为培养第1、6、12天)；
图2为不同组别细胞生长曲线图；
图3为不同组别细胞MTT增殖能力分析；
图4为MSCs向脂肪细胞，成骨细胞及软骨细胞分化(A-C:血清培养的MSCs体外分化，D-F:无血清培养的MSCs体外分化)；
图5-1到5-5为有血清与无血清培养MSCs干性标志物与分化标志物检测；
图6为RT-PCR检测无血清培养间充质干性阴性标志物。
【具体实施方式】
[0019]培养基
以bFGF为生长因子,Cell start/fibronectin为细胞外基质,分别建立了以下各培养体系:①无血清基础培养基+bFGF+Cellstart、②无血清基础培养基+Ce 11 start、③无血清基础培养基+bFGF+f ibronectin、④无血清基础培养基+f ibronectin、⑤无血清基础培养基+bFGF、⑥无血清基础培养基。通过相互之间的比较，在添加生长因子bFGF的情况下，以Cell start作为细胞外基质对于MSCs的体外无血清培养最为有利，此培养体系能保证细胞在短时间内呈增长趋势，较长时间内维持细胞的体外存活数量。
[0020]材料与方法 2.1实验动物
新西兰白兔由绍兴文理学院动物实验基地提供，正常饲养管理，观察一周正常后用于实验；实验动物实验程序按本校实验动物伦理规范(2013051201)执行。
[0021]主要试剂和仪器
试剂:D-氨基半乳糖(D-gal，Hanghong,上海)，a-MEM (吉诺，杭州)，PBS (吉诺，杭州)，抗生素(吉诺，杭州)，胎牛血清(Hyclone,美国),StemPro? MSC SFM (Invitrogen,美国),Fibronectin (Invitrogen,美国),Cellstart (Invitrogen,美国)，脂肪细胞分化培养基(Invitrogen,美国),成骨细胞分化培养基(Invitrogen,美国),软骨细胞分化培养基(Invitrogen,美国)，DMSO (Sigma,美国),细胞中性脂质油红O染色试剂盒(Genmed,美国)，细胞碱性磷酸酶活性染色试剂盒(Genmed,美国),动物细胞糖蛋白高碘酸希尔法阿尔新蓝染色试剂盒(Genmed,美国)，Trizol Reagent (Invitrogen,美国),反转录酶试剂盒(艾德莱，北京)，PCR Mix (Invitrogen,美国)，PKH26GL 试剂盒(Sigma,美国)；MTT(Sigma,美国)。
[0022]主要仪器:荧光显微镜(Nikon，日本)，-80°C冰箱(三洋，日本)，ELX-800酶标仪(Bio-rad,美国)，培养箱(三洋，日本)，以及其他常规仪器设备。
[0023]培养器皿:25cm2 (Corning,美国)，75 cm2 (Corning,美国)，4 孔板(NUNC，丹麦)6 孔板(Corning,美国)，12 孔板(Corning,美国),96 孔板(Corning,美国)。
[0024]方法
2.3.1 MSCs体外培养
2.3.1.1 MSCs体外有血清培养
观察正常的新西兰大白兔，耳缘静脉空气栓塞法处死，无菌分离出两腿股骨，用碎骨钳去除骨两端骨骺，用注射器吸取适量PBS反复冲洗骨髓腔至含有肝素钠的无菌离心管中，将得到的骨髓细胞悬液离心后，置37°C、5%C02培养箱中恒温培养，培养基为:a -MEM+10%FBS+双抗；之后每隔3日换一次培养液，待培养瓶中的原代MSCs生长至80%汇合后，用胰酶消化，加入含血清培养液终止胰酶作用，以1: 3进行传代培养。
[0025]体外无血清培养
骨髓细胞悬液离心后，为比较优化无血清培养体系，以MSC SFM作为无血清的基础培养基((99%MSC SFM +l%Supplement+双抗)，组合添加细胞外基质(Cell start和Fibronectin)和细胞因子(lOPg/L bFGF)，共设置了 7种培养条件，分别是:①无血清基础培养基+bFGF+Cellstart (SF_b_C)、②无血清基础培养基+Cell start (SF-C)、③无血清基础培养基+bFGF+fibronectin (SF_b_F)、④无血清基础培养基+fibronectin (SF-F)、⑤无血清基础培养基+bFGF (SF-b)、⑥无血清基础培养基(SF)和⑦10%血清培养液(S)。放置37°C培养箱内孵化备用。细胞外基质实验前Cell start和ECM在细胞培养前以1:1000的浓度稀释于α -MEM,置37°C培养箱沉淀，实验前吸去上清液，晾干备用。其中无血清基础培养基+bFGF+Cell start (SF_b_C)细胞增殖效果最佳，并用于后续实验研究。
[0026]增殖潜能鉴定
1)细胞生长曲线实验:按1.3.1.2上述的7种培养基，设置6个平行组，以f IO4 /cm2细胞密度在四孔板内进行细胞接种培养。从第2天到第7天，每天取I组细胞，胰酶消化完全后用红细胞计数板分别对不同培养组分的细胞数量进行计数，得到7种不同培养条件下的MSCs细胞数量增长曲线。
[0027]) MTT测定:按1.3.1.2的7种培养条件，在96孔板内设置7组细胞，每组5个重复，2d后弃去培养液，用PBS洗2-3遍，每孔加入30mL MTT溶液(5mg.mL—1)，继续培养4h，吸净培养液，每孔加入IOOmL DMS0，振荡lOmin，在酶标仪492nm波长下测得各孔的吸光度。
[0028]分化潜能鉴定
传2-3代生长稳定的MSCs，待其长至80%满时，分别在脂肪、成骨、软骨分化培养液体外诱导分化7-10天。之后参照Genmed公司的操作说明书，用细胞中性脂质油红O染色试剂盒、细胞碱性磷酸酶活性染色试剂盒、动物细胞糖蛋白高碘酸希尔法阿尔新蓝染色试剂盒分别对分化的脂肪、成骨、软骨细胞进行鉴定。
[0029]标志物表达水平鉴定
2.3.4.1 RNA的提取与cDNA的合成
按Invitrogen Trizol说明书细胞提取RNA,然后按反转录酶试剂盒逆转录合成cDNA:5 m I RNA 中加入 I ml Random Primer p (dN) 6 (0.2mg.ι?1_1)>5 ml Rnase-free ddH20,70。C 温浴 5min,冰浴 10s,离心后加入下列试剂:4 ml 5, Reaction Buffer、2 ml dNTPMix (IOmmol d I ml Rnase inhibitor (20U ?mF1)>2 ml AMV Reverse Transcriptase(IOU.ι?1_1)>20 ml Total volume,混匀后 37° C 温浴 5min;42° C 温浴 60min;70° C 温浴IOmin终止反应，-79° C保存备用。
[0030]实时定量PCR检测基因表达
采用SYBR? Green法分别检测各样本的基因表达情况。20μ1 PCR反应体系:10 μ?SybrGreen qPCR Master MixU μ? 引物 F (IOuM)、1 μ? 引物 R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ?Template (cDNA)。反应程序:95°C 2 min，95°C 10s，60°C 40s，以 0.5°C.s-1 的速度从65°C到95°C每隔5s记录一次荧光值，最后获得溶解曲线。完成上述步骤后，加样到96孔板，置于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应，采用相对定量法分别分析各组基因标志物的表达水平,其计算公式为:基因标志物相对表达量=2_(繼)’ 100%，其中ACt=Ct
检测干性标志物基因CD29，CD44，Ppar，Runx2与Sox9，以GAPDH为内参基因，引物序列如表1。
[0031] 检测基因表达
对阴性标志物⑶34，⑶166采用RT-PCR检测，以GAPDH为对照将按1.3.4.1反转录得到的cDNA为模板进行Ρα?，20μ1 PCR反应体系:10 μ? 2XPCR MixU μ?弓丨物F (IOuM)Uμ? 引物R (IOuM)、7 μ? ddH20、l μ? Template (cDNA)，预变性95°C 3 min，95°C 40s, 60°C40s, 72°C 408，30个循环，最终721: I min，取5 μ?扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，所用引物如表1。
[0032] 表1荧光定量PCR与RT-PCR引物序列表
【权利要求】
1.一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，以MSC SFM为基础培养基，在该基础培养基中添加细胞外基质和细胞因子，将骨髓细胞悬液离心后，在上述培养基中，37°C情况下，以1’IO4 /cm2细胞密度进行恒温接种培养。
2.如权利要求1所述的一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，其特征在于:所述的细胞外基质包括Cell start和Fibronectin,细胞因子为10Pg/L bFGF。
3.如权利要求1所述的一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，其特征在于:所述的 MSC SFM 为 99%MSC SFM +l%Supplement+双抗。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养方法，其特征在于:所述的细胞外基质Cell start使用前先以1:1000的浓度稀释于α -ΜΕΜ，置37°C培养箱沉淀，实验前吸去上清液，晾干备用。
5.一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养基，其特征在于:该培养基以MSC SFM为基础培养基，在该基础培养基中添加细胞外基质和细胞因子。
6.如权利要求5所述的一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养基，其特征在于:所述的细胞外基质包括Cell start和Fibronectin,细胞因子为10Pg/L bFGF。
7.如权利要求5所述的一种兔骨髓间充质干细胞无血清培养基，其特征在于:所述的MSC SFM 为 99%MSC SFM +l%Supplement+双抗。
【文档编号】C12N5/0775GK103740640SQ201310701008
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】金立方, 倪坚 申请人:绍兴文理学院