一种罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法
【专利摘要】本发明公开了一种罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，将分离保存的野生菌株在血平板划线培养，挑单菌落于TSB培养基25℃振荡培养；步骤1：培养6h后接种于新TSB培养基25℃振荡培养，6h传一代传至20代；步骤2：取第20代培养物接种于新LTSB培养基35℃振荡培养，6h传一代传至40代；取第41代重复操作步骤1至60代；取第61代重复操作步骤2至80代；按照上述方法持续传代，在传代过程中对菌株的毒力进行测定，传代直至确定菌株毒力弱化。本发明具有简单快速的特点，应用该方法对罗非鱼源无乳链球菌野生菌株毒力弱化获得的弱毒株毒力弱、不易返毒，该方法为罗非鱼链球菌病弱毒疫苗的开发具有重要意义和应用价值。
【专利说明】—种罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种链球菌的毒力弱化方法，具体涉及罗非鱼源无乳链球菌的毒力弱化方法。
【背景技术】
[0002]链球菌广泛存在于自然界、人及动物，引起各种化脓性炎症、猩红热、丹毒、新生儿败血症、脑膜炎、产褥热以及链球菌变态反应性疾病等。水产养殖动物也可感染链球菌发生链球菌病，造成大规模死亡，每年给世界水产养殖业造成巨额经济损失。我国是水产养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成的直接经济损失约10亿美元。罗非鱼是重要的热带和亚热带水产养殖动物，也是链球菌感染的主要对象之一。我国是罗非鱼养殖第一大国，年产量占世界总产量50%以上。2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病的感染，并在个别养殖场造成了 30%~50%的高死亡率。2009~2013连续5年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大。按我国罗非鱼年均产量计算，估计每年链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达4亿美元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。
`[0003]疫苗免疫是预防和控制罗非鱼等鱼类链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一。自1995年以色列学者Eldar A报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病(5: difficile)开始，美国(Klesius 等，1999 ；Pridgeon 等，2011)、中国(Sun 等,2010)、日本(Dumrongphol等，2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌病灭活疫苗的研究，并在试验室取得很好的免疫效果。但由于灭活疫苗免疫途径不便和免疫保护期较短等问题，研制的罗非鱼链球菌病灭活疫苗一直未能在生产上推广使用。弱毒疫苗具有免疫剂量低、免疫效果好、保护期长等特点，弱毒疫苗的开发对罗非鱼链球菌病的免疫防控具有重要作用。美国Pridgeon等通过抗生素筛选方法分别获得了海豚链球菌和无乳链球菌的弱毒菌株，并证明了弱毒疫苗安全可行。弱毒株的获取是弱毒疫苗开发的关键，传代培养是进行菌株毒力弱化的重要方法，但利用温差传代快速培养法对罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化获得罗非鱼源无乳链球菌弱毒株的方法还未见报道。
【发明内容】
[0004]针对罗非鱼无乳链球菌病疫苗开发及应用存在的困难，本发明主要解决的问题是提供一种罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，获得罗非鱼源无乳链球菌弱毒株，用于罗非鱼链球菌病弱毒疫苗开发。
[0005]本发明技术内容为罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，包括:(一)罗非鱼源无乳链球菌的温差传代快速培养；(二)罗非鱼源无乳链球菌弱毒株毒力测定；(三)罗非鱼源无乳链球菌弱毒株返毒安全性测定；(四)罗非鱼源无乳链球菌弱毒株生长状态测定；(五)罗非鱼源无乳链球菌弱毒株的PCR和生化鉴定。
[0006](一)罗非鱼无乳链球菌的温差传代快速培养
采用温差传代快速培养法。首先将分离保存的野生毒株在血平板划线培养，挑单菌落于胰豆蛋白胨液体培养基TSB培养；步骤1:培养6 h后接种于新TSB培养基25 °C振荡培养，6 h传一代传至20代；步骤2:取第20代培养物接种于低营养胰豆蛋白胨液体培养基LTSB 35 °C振荡培养，6 h传一代传至40代；取第41代重复操作步骤I直至传代至60代；取第61代重复操作步骤2直至传代至80代；按照上述方法持续进行传代，在传代过程中对菌株的毒力进行测定，传代直至确定菌株毒力弱化。
[0007](二)罗非鱼源无乳链球菌弱力弱化株毒力测定
使用毒力弱化后的罗非鱼源无乳链球菌菌株分别对试验罗非鱼进行腹腔注射感染和拌料投喂口服感染，均不能造成罗非鱼感染发病或死亡。
[0008](三)罗非鱼源无乳链球菌弱毒株返毒安全性测定
使用弱毒株培养菌液感染罗非鱼后将肝脏组织在研钵中匀浆，加PBS稀释后再腹腔注射试验罗非鱼进行攻毒感染，如此将弱毒株在罗非鱼体内连续传代，均不能造成罗非鱼发病或死亡，表明弱毒株在罗非鱼体内不易返毒，应用该弱毒株开发疫苗具有较高安全性。
[0009](四)罗非鱼无乳链球菌弱毒株的生长观察
分别将罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化前的原始野生菌株和弱毒株划线血平板培养，观察弱毒株的生长状态。采用革兰氏染色方法对野生强毒株和弱毒株进行染色，使用显微镜比较观察原始野生菌株和弱毒菌株的显微形态。
[0010](五)罗非鱼无乳链球菌弱毒株的PCR和生化鉴定
采用罗非鱼链球菌PCR鉴定方法和API 20 Str印生化条和VITEK 2全自动微生物分析仪对罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化前的原始野生菌株和弱毒菌株进行鉴定。
[0011]本发明与现有技术对比其特点在于:
1、本发明采用温差传代快速培养对罗非鱼源无乳链球菌毒力进行弱化，通过毒力测定、生长特性观察、PCR和生化鉴定，证实温差传代快速培养可对罗非鱼源无乳链球菌毒力进行弱化。
[0012]2、通过本发明技术，每天对罗非鱼源无乳链球菌菌株传4代，可较快的对罗非鱼无乳链球菌强菌株毒力进行致弱，获得用于弱毒疫苗研发的弱毒株。
[0013]本发明在一般的实验室即可操作进行，细菌培养6 h传一代，具有简单快速的特点，应用该方法对罗非鱼源无乳链球菌野生菌株毒力弱化获得的弱毒株具有毒力弱、不易返毒等特点，该方法为罗非鱼链球菌病弱毒疫苗的开发具有重要意义和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化前原始野生强毒株和致弱菌株培养和革兰氏染色比较。
[0015]图2:1 - 8泳道分别为:海 豚链球菌(ATCC29178)和无乳链球菌(ATCC27956)、海豚链球菌(ATCC29178)、无乳链球菌(ATCC27956)、停乳链球菌(NCTC4335S)、副乳房炎链球菌(MCCCA01039)、格氏乳球菌(MCCCA07812)的标准菌株，原始野生强毒株，致弱株；M表示DL 2000 DNA分子量标准，从上到下分子量分别为2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250bp 和 100 bp ο
[0016]图3:罗非鱼源无乳链球菌原始野生强毒株和致弱菌株生化鉴定结果比较图，图中方框标注为差异生化指标。
【具体实施方式】
[0017]采用本发明建立的毒力弱化方法对罗非鱼源无乳链球菌野生型强毒株HN016进行毒力弱化为例，详细说明罗非鱼源无乳链球菌的毒力弱化方法，具体实施时不受实施例限制。本方法中所使用技术术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员可理解含义。
[0018]实施例1本发明使用的培养基
胰豆蛋白胨液体培养基(TSB):胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L, NaCl 5.0 g/L，葡萄糖 2.5 g/L,蒸懼水 1000 mL,调 pH 7.2-7.4,121。(!'高压灭菌 20 min。
[0019]低营养胰豆蛋白胨液体培养基(LTSB):胰蛋白胨9.0 g/L，大豆蛋白胨2.5 g/L,NaCl 5.0 g/L，葡萄糖 2.5 g/L，蒸馏水 1000 mL，调 pH 7.2-7.4,121 1:高压灭菌 20 min。
[0020]实施例2罗非鱼源无乳链球菌野生强毒株HN016的温差传代快速培养
罗非鱼源无乳链球菌野生毒株分离:使用细菌接种环对大规模发病养殖场发病罗非鱼脑、肝、肾、脾或鳍部进行细菌血平板划接种分离，28°C培养24 h。挑取单菌落于TSB液体培养基扩大培养24 h,镜检无污染后,进行毒力测定及PCR诊断。确定为无乳链球菌后将菌液和甘油按4:1比例(V/V)充分混匀，_80°C冷冻保存。
`[0021]将_80°C保存的野生强毒株HN016 (LD50=7.08X IO3 CFU/尾)在血平板划线培养，挑单菌落于装有20 mL TSB培养基的50 mL培养管25 °C振荡培养。步骤1:培养6 h后取
0.25 mL接种于一个新的装有20 mL TSB培养基的50 mL培养管25 °C振荡培养，6 h传一代，重复操作步骤I直至传代至20代；步骤2:取第20代培养物0.25 mL接种于一个新的装有20 mL LTSB培养基的50 mL培养管35 °C振荡培养，6 h传一代，重复操作步骤2直至传代至40代；取第41代重复操作步骤I直至传代至60代；取第61代重复操作步骤2直至传代至80代；按照上述方法持续进行传代直至菌株毒力弱化。初代菌株和每传80代菌株均进行毒力检测:高剂量(IO8 CFU/尾)注射感染健康罗非鱼，每组20尾，设三个重复组，注射感染后持续观察记录30天，无罗非鱼发病或死亡，30天后所有罗非鱼细菌分离未检测到无乳链球菌，说明菌株已不能感染罗非鱼发病或死亡即鉴定为罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化株。如表1所示，按上述方法进行传代致弱，初代罗非鱼无乳链球菌具有极强的感染致死率，当传代至720代，毒力显著降低，传代至800代以后高剂量腹腔注射也不能引起罗非鱼感染发病或死亡。
[0022]采用本发明的方法对罗非鱼源无乳链球菌野生强毒株HN016进行温差传代快速培养，可对罗非鱼源无乳链球菌野生强毒株的毒力进行弱化，证明了本发明技术方法的可行。
[0023]表1初代菌株和每传80代菌株毒力检测
组别I初代 |80 |160 |240 |320 丨400 丨480 丨560 丨640 丨720 |800丨820丨840
组 I 死亡率(％)IlOO |90.0 |θ5.0 |85.0 ΙθΟ.0 |85.0 |θ5.0 卜5.0 |50.0 |30.0 |θ |θ |θ
【权利要求】
1.一种罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，其特征在于采用温差传代快速培养法，即首先将分离保存的野生毒株在血平板上划线培养细菌，挑单菌落于胰豆蛋白胨液体培养基TSB培养；步骤1:培养6 h后接种于新TSB培养基25 °C振荡培养，6 h传一代传至20代；步骤2:取第20代培养物接种于低营养胰豆蛋白胨液体培养基LTSB 35 °C振荡培养，6 h传一代传至40代；取第41代重复操作步骤I直至传代至60代；取第61代重复操作步骤2直至传代至80代；按照上述方法持续进行传代，在传代过程中对菌株的毒力进行测定，传代直至确定菌株毒力弱化。
2.根据权利要求1所述的罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，其特征在于:所述的胰豆蛋白胨液体培养基TSB的配方为:胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，NaCl 5.0g/L,葡萄糖 2.5 g/L,蒸懼水 1000 mL,调 pH 7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的罗非鱼源无乳链球菌毒力弱化方法，其特征在于:所述的低营养胰豆蛋白胨液体培养基LTSB的配方为:胰蛋白胨9.0 g/L，大豆蛋白胨2.5 g/L,NaCl 5.0 g/L，葡萄糖 2 .5 g/L，蒸馏水 1000 mL，调 pH 7.2_7.4。
【文档编号】C12N1/36GK103881959SQ201410087094
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】李莉萍, 王瑞, 陈明, 甘西, 梁万文, 黄婷, 朱佳杰, 雷爱莹, 李健, 陈福艳 申请人:广西壮族自治区水产科学研究院