一种基因组dna提取方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因组DNA提取方法及试剂盒，该试剂盒包含研磨器、溶液A（裂解液）、溶液B（DNA结合液）、溶液C（DNA洗涤液）、溶液D（DNA洗脱液）和纯化柱。该发明的试剂盒，成本低廉，试剂成分简单，操作流程少，不仅适用于微生物基因组的提取而且还适用于动物组织和植物组织的基因组的提取。同时提取基因组的过程耗时短（30min以内），提取的基因组质量高，基因组条带大小约为23kb，基因组的量可稳定保持在1μg-30μg的范围内；提取的过程不会用到有毒的试剂苯酚、氯仿，能很好的满足SouthernBlot，PCR，RFLP，DNA文库构建等各种分子生物学实验。
【专利说明】—种基因组DNA提取方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及基因组DNA提取试剂盒及提取方法。【背景技术】
[0002]自PCR扩增技术发明以来，生物分子学的研究突飞猛进。对基因的研究己经遍及医疗健康、农业生产、环境保护及生物各学科领域。基因组DNA的提取是分子生物学研究的前提，在上述各领域中广泛应用。提取基因组DNA常用的方法是用物理方法破壁，例如液氮研磨和高温加热；或者是酶解，例如溶菌酶酶解；或者非离子表面活性剂处理例如，CTAB法(Walker WH等，1991)氯化苄法和SDS法(林福呈和王洪凯，2010)，细胞破壁和破膜后利用有机溶剂使用苯酚、氯仿、异戊醇的混合溶液使蛋白质变性达到与DNA分离的目的。虽然这些方法能够提取出高质量的基因组DNA，但是提取过程中的这些有机溶剂对人体皮肤、呼吸道粘膜、眼睛等有较大的伤害，而且提取的基因组常有有机溶剂残留，使得后面的实验结果不稳定；后来又出现了利用DNA吸附材料来达到蛋白质与DNA分离的目的，同时也开发了很多试剂盒来提取不同材料的基因组，虽然提取的基因组质量很高但成本较高、通用性不强。但是不论是使用苯酚、氯仿等有机溶剂抽提还是使用DNA提取试剂盒来提取基因组，样品的预处理始终是一个繁琐和耗时的过程。革兰氏阳性细菌和酵母菌细胞壁非常坚实，常见的提取基因组方法中都会加入溶菌酶消化细胞壁。对于人类和动物组织，需要加入蛋白酶K过夜处理使组织更分散。对于植物组织和丝状真菌菌丝或者是真菌孢子，需要使用液氮研磨破壁。
【发明内容】
[0003]为了克 服上述问题，本发明提供了一种快速基因组DNA提取试剂盒及其制备方法，该方法可以针对绝大多数生物样品，操作简单、经济、无毒无污染，高质高效。
[0004]一种基因组DNA提取试剂盒，包括溶液A (裂解液)、溶液B (DNA结合液)、溶液C(DNA洗涤液)和溶液D (DNA洗脱液)；
[0005]溶液A(裂解液):10mM-50mM Tris-HCl pH8.0,10mM-50mM EDTA, 1%-10% (w/v)SDS,2M-4M NaCl，0.5%-2% (v/v)的 β -巯基乙醇；
[0006]溶液B (DNA结合液):2.5-6M的盐酸胍或者异硫氰酸胍，20%_40% (v/v)异丙醇或者是无水乙醇，5mM-20mM EDTA, pH4.5-6.5 ；
[0007]溶液C (DNA 洗涤液):70%-80% (v/v)的无水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ；
[0008]溶液D (DNA洗脱液):5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液将pH调到
7.0-8.5 ο
[0009]还包括研磨器:该研磨器可以为电动组织研磨器或者小型的手提电钻其转速800-12000rpm,配有长度为40-80mm,直径3_7mm的锥形研磨件。
[0010]上述试剂盒的优选配方
[0011]溶液A:50mM Tris_HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β _ 巯基乙醇，ρΗ8.0 ；[0012]溶液B:4M的盐酸胍、20%异丙醇、IOmM EDTA, pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；
[0013]溶液C:70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液
[0014]溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液将pH调到8.0。研磨器:转速8000rpm、配有长度为70mm,直径5mm的锥形研磨件。
[0015]本发明的主要原理:研磨器在高速条件下产生的剪切力不仅能将丝状真菌的细胞壁破碎，同时研磨杵与离心管壁的摩擦作用而产生较高的温度(500C -700C )，有利于SDS裂解细胞。在研磨器、高温和SDS的相互作用下，丝状真菌的基因组DNA释放出来。在2MNaCl溶液中DNA的溶解度最大。EDTA是金属螯合剂能抑制DNA酶的活性，防止DNA的降解。β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。DNA结合液提供一个高盐低PH值的环境，在这种条件下，DNA可以与硅胶柱可逆结合。洗涤液是70%乙醇可以对硅胶柱脱盐。DNA在pH7.0-8.5的低盐溶液中，具有最大洗脱效率。洗脱液是含有RNA酶的碱性水溶液，能将硅胶柱上DNA洗脱下来。
[0016]本发明的另一方面是使用该试剂盒提取基因组DNA的方法，包括以下步骤:
[0017]1、样品的预处理
[0018](I)取1.5mL的锥底离心管，加入0.1mg-1OOmg组织样品或者IO6-1O9细胞样品；
[0019](2)向(I)中加入 50 μ L-100 μ L 的溶液 A ;
[0020](3)开动研磨器研磨样品30s_5min ；
[0021]2、样品的过柱纯化
[0022](4)向研磨好的菌丝中加入溶液A使样品终体积在150 μ L左右；
[0023](5)漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；
[0024](6)离心机转速 10000g_12000g,离心 5min ；
[0025](7)小心取上清100 μ L至一新的1.5mL离心管中，加入300 μ L-600 μ L的溶液B，上下颠倒混匀；
[0026](8)将(7)的混合液加入纯化柱中，10000g_12000g，离心30s_lmin ；
[0027](9)弃收集管中的液体，向纯化柱中加入300 μ L-600 μ L的溶液B，10000g_12000g,离心 30s_lmin ；
[0028](10)弃收集管中的液体，向纯化柱中加入500 μ L-700 μ L的溶液C，10000g_12000g,离心 30s_lmin ；
[0029](11)重复(10);
[0030](12)弃收集管中的液体，10000g-12000g，离心 2_5min ；
[0031](13)将(12)的纯化柱转移到一新的1.5mL离心管中，加入30-50 μ L的溶液D，37°C 放置 5min ；
[0032](14) 10000g-12000g,离心 l_2min ；
[0033](15) _20°C保存提取的基因组DNA溶液。
[0034]本发明提取 样本的对象可以是培养细胞(动物细胞或人类细胞)或细菌(革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)或酵母菌等单细胞、人类及动物组织或者是植物组织或者是大型真菌组织、血液或骨髓、丝状真菌(米曲霉、黑曲霉等)、真菌孢子(米曲霉孢子、黑曲霉孢子、灵芝孢子等)。但处理的样本不同，裂解处理的步骤有所不同。[0035]a、对于样本为培养细胞(动物细胞或人类细胞)或细菌(革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)或酵母菌等单细胞:所述样品预处理步骤为:取ImL浓度≥ 1.0X 106/mL的细胞，在转速≥5000rpm的离心机中离心5min收集细胞，加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min。
[0036]b、对于样本为人类及动物组织或者是植物组织或者是大型真菌组织,例如,蘑菇、木耳等；所述预处理步骤为:将样本剪碎或者是磨碎，转移到1.5mL的离心管中，样品量控制在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨3_5min。
[0037]C、对于样本为血液或骨髓；所述预处理步骤为:取ImL血液,在转速≥5000rpm的离心机中离心5min收集细胞,加入50 μ L-100 μ L的裂解液,并用研磨器研磨l_2min。
[0038]d、对于样本为丝状真菌，例如米曲霉、黑曲霉等。对于生长在固体培养基上的菌丝可以用牙签或者移液器枪头挑取；对于生长在液体培养基中菌丝可以用转速≥1000Orpm的离心机中离心10min或者是过滤收集菌丝。菌丝量在0.1mg-1OOmg加入50 μ L-100 μ L的裂解液，并用研磨器研磨l_2min。
[0039]e、对于样本为真菌孢子，例如米曲霉孢子、黑曲霉孢子、灵芝孢子等。所述预处理步骤为:可以用转速≥1000Orpm的离心机中离心10min收集孢子或者是使用过滤的方式收集孢子，加入50 μ L-100 μ L的裂解液,并用研磨器研磨3_5min。
[0040]与现有技术相比，具有如下优点:
[0041]本方法主要是采用机械研磨破碎细胞并结合SDS裂解细胞，不需要用到各种裂解酶，例如溶菌酶、蛋白酶K，后续的基因组柱纯化试剂成分简单，操作流程少；该试剂盒适用范围广，不仅适用于微生物基因组的提取而且还适用于动物组织和植物组织的基因组的提取，同时能够快速得到纯度高和质量高的基因组DNA，整个过程控制在30分钟以内，得到的DNA片段约为23Kb，基因组的量可稳定保持在I μ g-30 μ g范围内，不会用到有毒的试剂苯酹、氯仿，能很好的满足后续的实验，可用于Southern,PCR,RFLP,DNA酶切,DNA文库构建等各种分子生物学实验。并且，本方法操作简单、花费低廉，更重要的是清洁无毒，对使用者和环境均无害。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为使用该试剂盒提取米曲霉RIB40基因组的电泳图。
[0043]图2为使用该试剂盒提取产孢黑曲霉CBS513.88基因组的电泳图。
[0044]图3为使用该试剂盒提取无孢黑曲霉SH-2基因组的电泳图。
[0045]图4为使用该试剂盒提取米曲霉RIB40分生孢子基因组的电泳图。
[0046]图5为使用该试剂盒提取食用真菌黑木耳基因组的电泳图。
[0047]图6为使用该试剂盒提取食用真菌香燕基因组的电泳图。
[0048]图7为使用该试剂盒提取食用真菌平菇基因组的电泳图。
[0049]图8为使用该试剂盒提取食用真菌茶树菇基因组的电泳图。
[0050]图9为使用该试剂盒提取酵母GM2.8基因组的电泳图。
[0051]图10为使用该试剂盒提取枯草芽孢杆菌WB800基因组的电泳图。
[0052]图11为使用该试剂盒提取大肠杆菌JMllO基因组的电泳图。
[0053]图12为使用该试剂盒提取培养细胞基因组的电泳图。[0054]图13为使用该试剂盒提取植物组织树叶基因组的电泳图。
[0055]图14为使用该试剂盒提取动物组织猪肉基因组的电泳图。
[0056]图15为使用该试剂盒提取动物组织鱼内脏组织基因组的电泳图。
[0057]附图中的数字M代表使用的Maker是使用的宝生物工程(大连)有限公司的λ -Hind III digest Maker,条带大小自上而下分别为 23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、2027bp、564bp、125bp。数字 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 分别代表对应图中不同样品的基因组。
【具体实施方式】
[0058] 以下用【具体实施方式】对本发明进行具体阐述，下列所有实施例中所述的操作步骤皆为在1.5mL的锥底离心管中操作。以下实例是对本发明的进一步说明，不应当做对本发明的限制。该实例中所用的材料米曲霉RIB40、黑曲霉CBS513.88、黑曲霉SH-2、大肠杆菌JM110、枯草芽孢杆菌WB800、产朊假丝酵母菌GM2.8都为本实验室保存，也可以采用市售产品；人培养细胞为华南理工大学生物科学与工程学院丁孝茹博士惠赠；黑木耳、香菇、平菇、茶树菇、猪肉、鱼内脏组织均购于广州市大学城穗石村菜市场；树叶组织采摘于华南理工大学。
[0059]实施例1
[0060]米曲霉菌丝基因组的提取方法
[0061]1、以下配方制作米曲霉菌丝基因组提取试剂盒:
[0062]研磨器:转速8000rpm、配有长度为70mm,直径5mm的锥形研磨件；
[0063]溶液A:50mM Tris_HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的巯基乙醇，pH8.0 ；
[0064]溶液B:4M的盐酸胍、20%异丙醇、IOmM EDTA, pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；
[0065]溶液C:70%的无水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液；
[0066]溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液将pH调到8.0。
[0067]DNA纯化柱:硅胶柱。
[0068]其中，研磨器购自天根生化科技有限公司。
[0069]2、按照以下步骤完成米曲霉基因组的提取:
[0070]a、样品的预处理
[0071](I)取1.5mL的锥底离心管，加入IOmg的米曲霉RIB40菌体；
[0072](2)向(I)的离心管中加入100 μ L的溶液A ;
[0073](3)用研磨器研磨菌体2min ；
[0074]b、样品过柱纯化
[0075](4)向研磨好的菌丝中加入溶液A使终体积在150 μ L左右；
[0076](5)在漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；
[0077](6)离心机转速12000g，离心5min ；
[0078](7)小心取上清100 μ L至一新的1.5mL离心管中，加入300 μ L的溶液B，上下颠倒混匀；
[0079](8)将(7)的混合液加入纯化柱中，12000g，离心Imin ；[0080](9)倒掉收集管中的液体，向纯化柱中加入500 μ L的溶液B，12000g，离心Imin ；
[0081](10)倒掉收集管中的液体，向纯化柱中加入700 μ L的溶液C，12000g，离心Imin ；
[0082](11)重复(10);
[0083](12)倒掉收集管中的液体，12000g，离心3min ；
[0084](13)将(12)的纯化柱加入一新的1.5mL离心管中，加入30μL的溶液0，37°〇放置 5min ；
[0085](14) 12000g,离心 2min ；
[0086](15) _20°C保存提取的基因组DNA溶液。
[0087]C、使用该方法提取的基因组可以从IOmg菌体中提取约1.5 μ g，提取的基因组如图1所示。
[0088]实施例2
[0089]产孢黑曲霉CBS513.88菌丝基因组的提取
[0090]基因组提取方法同实施例1中的步骤，使用该方法提取的基因组可以从IOmg菌体中提取约1.5 μ g，提取的基因组如图2所示。
[0091]实施例3
[0092]无孢黑曲霉SH-2菌丝基因组的提取
[0093]基因组提取过程中步骤方法同实施例1中的步骤，使用该方法提取的基因组可以从IOmg菌体中提取约2 μ g,提取的基因组如图3所不。
[0094]实施例4
[0095]米曲霉分生孢子基因组的提取
[0096]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨孢子5min，使用该方法提取的基因组可以从IXlO8量的孢子中提取约1.5 μ g，提取的基因组如图4所示。
[0097]实施例5
[0098]食用真菌黑木耳基因组的提取
[0099]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨菌体5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的黑木耳中提取约2 μ g，提取的基因组如图5所
/Jn ο
[0100]实施例6
[0101]食用真菌香菇基因组的提取
[0102]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨菌体5min,使用该方法提取的基因组可以IOmg的香菇中提取约2 μ g，提取的基因组如图6所示。
[0103]实施例7
[0104]食用真菌平菇基因组的提取
[0105]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨菌体5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的平菇中提取约2 μ g，提取的基因组如图7所示。
[0106]实施例8
[0107]食用真菌茶树菇基因组的提取
[0108]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨菌体5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的茶树菇中提取约2 μ g，提取的基因组如图8所示。[0109]实施例9
[0110]产朊假丝酵母菌GM2.8基因组的提取
[0111]基因组提取同实施例1所述的方法，使用该方法提取的基因组可以从I X IO9量的酵母细胞中提取约3 μ g，提取的基因组如图9所示。
[0112]实施例10
[0113]革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌WB800基因组的提取
[0114]基因组提取同实施例1所述的方法，使用该方法提取的基因组可以从I X IO9量的枯草细胞中提取约5yg，提取的基因组如图10所示。
[0115]实施例11
[0116]革兰氏阴性细菌大肠杆菌杆菌JMllO基因组的提取
[0117]基因组提取同实施例1所述的方法，使用该方法提取的基因组可以从I X IO9量的大肠细胞中提取约5 μ g，提取的基因组如图11所示。
[0118]实施例12
[0119]人培养细胞基因组的提取
[0120]基因组提取同实施例1所述的方法，使用该方法提取的基因组可以从I X IO9量的人细胞中提取约6 μ g，提取的基因组如图12所示。
[0121]实施例13
[0122]植物组织植物叶片基因组的提取
[0123]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨植物叶片5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的植物叶片中提取约2 μ g，提取的基因组如图13所示。
[0124]实施例14
[0125]动物组织猪肉基因组的提取
[0126]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨猪肉5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的猪肉中提取约1.5 μ g，提取的基因组如图14所
/Jn ο
[0127]实施例15
[0128]动物组织鱼内脏组织基因组的提取
[0129]基因组提取方法同实施例1，只是将实施例1中步骤(3)改为用研磨器研磨鱼内脏5min，使用该方法提取的基因组可以IOmg的鱼内脏中提取约2yg，提取的基因组如图15所
/Jn ο
【权利要求】
1.一种基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括溶液A、溶液B、溶液C、溶液D和纯化柱； 溶液 A:10mM-50mM Tris-HCl,10mM-50mM EDTA,1%-10%w/v SDS，2M_4M NaCl,0.5%-2%v/v β -巯基乙醇，ρΗ7.5-8.5 ； 溶液B:2.5-6M的盐酸胍或异硫氰酸胍，20%-50%v/v异丙醇或是无水乙醇，5mM-20mMEDTA, ρΗ4.5-6.5 ； 溶液 C:70%-80%v/v 的无水乙醇，ρΗ4.5-6.5 ； 溶液D:5-50 μ g/mL的RNA酶水溶液，用IM NaOH溶液调pH至7.0-8.5。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括研磨器，该研磨器可以为电动组织研磨器或者小型的手提电钻其转速800-12000rpm，配有长度为40_80mm，直径3_7mm的锥形研磨杵。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述研磨器的转速1500-8000rpm、并配有长度70mm,直径5mm的锥形研磨件。
4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于， 溶液 A:50mM Tris-HCl、50mM EDTA、3%SDS、2M NaCl,1% 的 β -巯基乙醇，ρΗ8.0 ； 溶液B:4Μ的盐酸胍、20%异丙醇、IOmM EDTA, ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸钠缓冲液； 溶液C:70%的无水乙醇、ρΗ5.0的0.2Μ的乙酸-乙酸钠缓冲液； 溶液D:20 μ g/mL的RNA酶水溶液，用lmol/L NaOH溶液将pH调到8.0。
5.一种基因组DNA提取方法，其特征在于，利用权利要求1~4任意一项所述的试剂盒进行提取，具体包含以下步骤: (1)取L5mL的锥底离心管，加入0.1mg-1OOmg组织样本或者IO6-1O9细胞样本与50 μ L-100 μ L的溶液A混合；开动研磨器研磨样本30s-5min，向研磨好的样本中加入溶液A使样品终体积为150 μ L ; (2)漩涡振荡器震荡30s，使菌体尽量分散；离心转速10000g-12000g，时间5min；取上清100 μ L至一离心管中，加入300 μ L-600 μ L的溶液B，上下颠倒混匀；再将混合液加入纯化柱中，10000g-12000g，离心30s-lmin ;弃收集管中的液体，向纯化柱中加入300 μ L-600 μ L 的溶液 B, 10000g_12000g，离心 30s_lmin ； (3)弃收集管中的液体，向纯化柱中加入500yL-700yL的溶液C，10000g-12000g，离心30s-lmin ;弃收集管中的液体，向纯化柱中加入500 μ L-700 μ L的溶液C，10000g-12000g，离心 30s-lmin ;弃收集管中的液体，10000g_12000g，离心 2_5min ； (4)将纯化柱转移到另一离心管中，加入30-50μ L的溶液D，37 V放置5min ；10000g-12000g，离心l-2min ;即得到提取的基因组DNA溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞样本为哺乳动物细胞、细菌、酵母菌、血液或骨髓；所述细胞样品还经如下预处理:将细胞样品在转速> 5000rpm的离心机中离心5min收集细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组织样本为动植物组织或者大型真菌组织；该组织样本还经剪碎或者磨碎的预处理。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组织样本为丝状真菌，对于生长在固体培养基上的菌丝用牙签或者移液器枪头挑取；对于生长在液体培养基中菌丝用转速≥ 1000Orpm的离心机中离心10min或者是过滤收集菌丝。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组织样本为真菌孢子悬液，用转速≥ 1000Orpm的离心机中离心10mi n收集孢子或者是使用过滤的方式收集孢子。
【文档编号】C12N15/10GK103911366SQ201410103466
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】潘力, 周斌, 王斌, 何攀, 吕扬勇, 廖瑜玲, 李秀鹏 申请人:华南理工大学