一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株的制作方法
【专利摘要】一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株（4126-SET5），属于微生物【技术领域】。该菌株分类命名为Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登记入册编号为CGMCC?No.8724，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月15日。本发明公开了重组菌株4126-SET5的基因工程构建方法，包括基因的获得、染色体整合载体的构建，以及菌株在各种环境胁迫条件下，包括在含有较高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇的平板上和在高温条件下的生长情况。与整合空载体的对照菌株相比，重组酿酒菌株4126-SET5可以在5g/L乙酸条件下进行快速发酵，这不仅可以为进一步研究酿酒酵母耐受性机理提供理论支持，还可以作为纤维素乙醇发酵的良好菌株。
【专利说明】一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株(4126-SET5)，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母广泛应用于食品、酿造及生物能源生产等不同领域，良好的细胞活性有利于增加生物量的积累，促进细胞循环使用，提高发酵效率，但酿酒酵母在生长和发酵过程中，尤其是在工业生产条件下，经常受到高浓度乙醇、极端温度(冷冻或高温等)，低pH及高渗透压等环境胁迫因素的影响，这些环境胁迫条件抑制细胞生长及代谢，从而影响了生产效率(Journal of Biotechnology, 2009,144:23_30)。因此，酿酒酵母细胞对环境胁迫因素的反应和耐受性机制一直是国内外学者研究的重点。
[0003]随着经济的快速发展，我国能源短缺问题不断突出。第二代生物乙醇以纤维素原材料，包括农作物秸杆，林业废弃物等发酵生产乙醇。与第一代生物乙醇不同之处在于，纤维素乙醇避免了与人争粮，与粮征地的弊端。在纤维素乙醇生产中，原料预处理过程中产生的弱酸类、醛类和酚类等抑制物对细胞的生长和发酵具有抑制作用(Biotechnologyfor Biofuels，2009，2:1-11)。为减小抑制剂的影响所采取的一些脱毒策略往往造成糖的损失和生产成本的增加，这在实际生产与经济上是不可行的，因而具有高耐受性的菌株的选育成为必要。近年来，通过细胞全局基因表达分析和各种组学数据分析(Antonievan Leeuwenhoek, 2013,103:1281-1295)，以及对单基因敲除的所有突变体的表型组研究(Microbial Cell Factories, 2010,9:79),对酿酒酵母乙酸耐性的分子机制有了更多新的认识，揭示了很多新的与乙酸毒性的适应性反应和乙酸耐性提高相关的基因。本发明得到的重组酿酒酿酒酵母就是以此获得，且本菌株具有较强的乙酸耐受性。
[0004]纤维素预处理的现在多通过物理、化学和生物方法实现，但是通过化学、物理方法的预处理需要消耗太多的能源且处理的过程中产生大量的污染物。生物酶解的过程比较温和，这一过程需要多种酶的参与，通过内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶把纤维素酶解成酵母细胞能够利用的糖类。此过程比较复杂，更重要的是水解产生的糖类对生物酶的活性有明显的抑制作用，因而同步糖化发酵(SSF)是必然的一种趋势，此过程可以减少纤维素乙醇发酵中的能耗，并且降低菌体污染的可能性。然而在较低的温度下，纤维素酶的水解效率会非常低，综合考虑水解和发酵过程(Biotechnology Advances, 2012, 30:1207 - 1218)，耐高温酵母是一种必然的需求。本发明得到的重组酿酒酵母菌株能在较高温度下良好生长，可用于高温发酵。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于构建一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株，能在分别含有高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇和高温等环境胁迫条件下良好生长，并能在较强的环境胁迫条件下，比如高浓度乙酸条件下具有较高的乙醇发酵效率。[0006]本发明涉及一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株(4126-SET5)，该菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae,菌株的登记入册编号为CGMCC N0.8724,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期为2014年01月15日。
[0007]所述菌株SET5基因来源于实验室模式酿酒酵母S288c，将PCR扩增得到的SET5基因连接到PHO组成型整合表达载体(Applied Energy, 2012, 110:33_40)，线性化后转入工业酿酒酵母，实现整合表达。
[0008]所述具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株(4126-SET5)根据已有的转录组分析结果，选择变化显著的靶点SET5基因，该基因序列的GenBank登录号为NC_001140.6。PGKl启动子序列GenBank登录号为FJ415226.1，CYCl终止子序列GenBank登录号为EF210198.1。通过基因工程手段在酵母的HO整合载体(NCB1:#AF324728，美国Utah大学David J.Stillman 惠赠；Nucleic acids research, 2001，29:e59)的基础上连接 PGKl 强启动子和CYCl终止子构成pHO组成型表达载体。然后把PCR扩增获得的SET5基因连接在PGKl启动子和CYCl终止子之间，线性化后电转导入工业酿酒酵母4126中，进行过表达。导入的质粒会在酿酒酵母基因组的HO基因位点(Yeast，1997，13:1563-1573)整合表达。
[0009]本发明采用酿酒酵母的pHO组成型表达载体进行重组菌株的整合表达，pHO组成型表达载体可以通过同源重组的方式在酿酒酵母的HO基因位点进行整合表达，该载体通过基因工程手段在质粒的多克隆位点插入PGKl启动子和CYCl终止子，用于组成型整合表达，根据载体含有的遗传霉素G418抗性进行抗生素筛选。
[0010]本发明的有益成果是:本发明的重组酿酒酵母4126-SET5能在分别含有高浓度乙酸、过氧化氢、乙醇和高温等环境胁迫条件下良好生长。并能在较强的环境胁迫条件下，比如高浓度乙酸条件下具有较高的乙醇发酵效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是SET5基因片段的PCR扩增。
[0012]图2是载体构建。
[0013]图3是阳性转化子PCR鉴定。
[0014]图4是重组空载酵母4126-H0对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在含有不同胁迫因素的平板中生长比较。
[0015]图5是重组空载酵母4126-H0对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的生长结果。
[0016]图6是重组空载酵母4126-H0对照菌株和重组酿酒酵母4126-SET5在5g/L乙酸中的发酵结果。
【具体实施方式】
[0017]实施例1:含组蛋白甲基化酶编码基因SET5的重组酿酒酵母的构建和转化
[0018]本发明涉及的组 蛋白甲基化酶编码基因SET5序列来自于NCBI公共数据库，该基因的GenBank登录号为NC_001140.6。基因的启动子用PGKl启动子，用CYCl终止子作为终止子，以酶切连接的方式在PGKl启动子和CYCl终止子之间插入SET5基因。然后通过酶切位点NotI把构建的质粒酶切成线性，转化到工业酿酒酵母4126中表达。
[0019]1.1酿酒酵母基因组DNA提取
[0020](I)将过夜培养的酵母菌液离心，12000rpm, 2min,去上清；
[0021 ] (2)向沉淀加入480 μ L TE溶液(ρΗ8.0)，20 μ L溶菌酶溶液(2mg/mL)，震荡混匀后放入37°C摇床1.5小时；
[0022](3)加入适量RNase A，再次放入37°C摇床0.5小时；
[0023](4)从摇床中拿出，加入50 μ L20%SDS溶液，5 μ L蛋白酶K (PK浓度为20 μ g/mL)混合震荡，55°C水浴锅中放置Ih以上；
[0024](5)离心将管盖上附着的液体收集到管底；加入500μ L苯酚:氯仿:乙戊醇(25:24:1)，震荡混匀后，12000rpm离心10分钟，取上清液，转新管；
[0025](6)加入等体积异丙醇，放入_20°C冰箱I小时以上，沉淀DNA ；
[0026](7)12000rpm离心10分钟,去上清液，加入lmL70%乙醇,洗沉淀I一2次，12000rpm离心8分钟，弃上清；
[0027](8) 37°C干燥后加入 TE (ρΗ8.0) 50 μ L 溶解 DNA，_20°C保存备用。
[0028]1.2PCR扩增目标基因条带
[0029]以实验室酵母S.cerevisiae S288c DNA作为模板扩增基因SET5。引物序列如下:
[0030]
【权利要求】
1.一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),其特征在于:所述菌株的登记入册编号为CGMCC N0.8724，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年01月15日。
2.根据权利要求1所述的一株具有胁迫耐受性的重组酿酒酵母菌株，其特征在于:所述菌株SET5基因来源于实验室模式酿酒酵母S288c，将PCR扩增得到的SET5基因连接到pHO组成型整合表达载体，·线性化后转入工业酿酒酵母,实现整合表达。
【文档编号】C12N15/63GK103849576SQ201410103468
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】赵心清, 张明明, 白凤武 申请人:大连理工大学