一种制备阿托伐他汀手性中间体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以基因工程菌作为全细胞生物催化剂制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,具体包括以下步骤:根据羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶表达特征,设计并优化羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的串联共表达策略,建立一个辅酶循环再生和6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原相匹配的全新生物催化体系,实现阿托伐他汀钙手性侧链合成前体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的原位生物合成。通过表达条件和反应条件的优化,在5%二甲基亚砜助溶剂、反应液pH7.0、20℃、葡萄糖:底物=1.2:1的条件下,原位生物合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的底物浓度可达35g/L,同时完全去除了外源性辅酶的添加,应用前景广阔。
【专利说明】一种制备阿托伐他汀手性中间体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于手性医药中间体制备领域,涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法,具体涉及一种以6-氰基_(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物,以共表达羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌作为生物催化剂,实现单一光学纯度的6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的工艺方法。
【背景技术】
[0002]他汀类药物(Statins)最早在真菌类的次级代谢产物中被发现,其分子结构由一个刚性的疏水母核与(3R,5S/R)_ 二羟基酯结构的侧链构成。由于该侧链结构与羟甲基戊二酰基具有结构相似性,故他汀类药物对羟甲基戊二酰辅酶A还原酶具有强烈的竞争性抑制作用。该抑制作用可以阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径,使细胞内胆固醇合成减少,从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体,使其数量和活性增加,增加血清胆固醇清除率从而降低血清胆固醇水平。由于他汀类的调脂作用强、耐受性好,临床上被用为治疗动脉粥样硬化、冠心病等高脂血症的首选药物。而且随着相关研究的深入,他汀类药物的新用途也被开发出来,例如预防骨质疏松和阿尔兹海默症等。按照来源的不同,他汀类药物可以分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托 伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀)两类,其中人工合成类他汀药物以其高效、低副作用的特点成为了他汀类药物的主要类别。
[0003]由于他汀类药物手性侧链存在特殊的手性间二醇结构,使得传统的化学合成工艺存在手性选择性不高,反应条件苛刻,反应步骤耗时长等缺陷(参见Tetrahedron.Lett.2002,43,2569-2571 及 Tetrahedron.Lett.2002,43,2679-82)。诸如低温反应(-600C )等工艺极大地增加了整个反应工艺的能耗,降低了经济性。
[0004]上世纪末开始发展的生物催化技术具有很强的底物专一性、较高的催化效率、温和的反应条件、简便的反应步骤及环境污染小等特点,已被广泛地用于制备他汀类手性侧链前体。已有多种酶类应用于他汀手性侧链的生物合成工艺,例如醇脱氢酶、酯酶、脱卤酶、羰基还原酶及醛缩酶等,每种酶类使用的底物种类与反应工艺都不尽相同。现有报道一种来自 Saccharomyces cerevisiae 的擬基还原酶(参见 Biosc1.Biotechnol.Biochem.2004, 68,2306-2312),可以还原α -羰基脂类底物中的羰基,该过程具有很高的手性选择性和底物特异性。例如有报道该酶可以在存在NADPH的环境下将6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原为6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯,反应 ee 值达到 99% (参见 Biochim.Biophys.Acta.2007,1773,321-329),该反应产物可以作为合成阿托伐他汀手性侧链的重要前体。但在实际的工业化生产中,该催化工艺都存在着诸多障碍,例如由于需要添加高成本的尼克酰胺类辅酶NADPH,粗酶液催化效率较低以及粗酶液制备工艺较为复杂等原因,造成了经济性差、生产效率低等一系列阻碍大规模生产的问题。
[0005]因此建立一种高效制备他汀类手性侧链前体的生物催化工艺,达到高底物浓度、零辅酶投入和生产工艺简洁的要求,对工业化生产中提高经济性和可行性具有广泛的实用价值和重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的是通过优选羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的串联共表达的先后顺序,建立一个辅酶循环再生和6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原相匹配的全新生物催化体系,提供一种制备6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的方法,在保证无外源辅酶添加、高立体选择性、高转化率与高收率的基础上,有效提高底物浓度,简化生产工艺和降低生产成本。
[0007]为达到上述发明目的,本发明采用了的技术方案是:一种制备阿托伐他汀手性中间体的方法,包括以下步骤:
(1)所述发酵菌体为含重组共表达质粒的大肠杆菌工程菌;底物浓度为I~55g/L,优选35g/L ;助溶剂二甲基亚砜的体积分数为O % -10 %,优选5 %,共底物葡萄糖与底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的摩尔比为20:1~0.5:1,优选1.2:1 ;
(2)步骤⑴所得反应体系在振荡或搅拌条件完成,反应液pH范围为5.0~9.0,优选7.0,反应温度为15~35°C,优选20°C。反应完成后乙酸乙酯萃取后得到6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯粗品。
[0008]上述技术方案中,步骤(1)中,所述的基因重组E.Coli具体指经过基因重组的,共表达来自于Saccharomyces cerevisiae的擬基还原酶与来自于Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶的两种大 肠杆菌中的一种。
[0009]上述技术方案中,根据重组方案不同,所述的的羰基还原酶基因序列可以是SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2。
[0010]上述技术方案中,根据重组方案不同,所述的的葡萄糖脱氢酶基因序列可以是SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
[0011]上述技术方案中,步骤(1)中,所述的发酵液的制备还包括步骤(3):将基因重组E.Coli接种到无菌的LB培养基中,在振荡的条件下,与37°C培养至培养液OD6tltl =
0.8±0.1后,加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG,在15~35°C下,优选25°C,继续培养16h。
[0012]在进一步的技术方案中,在对发酵液的活性考察中,还包括步骤(4):步骤(3)结束后将发酵液离心得到湿菌体后,加入适量PH = 7.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液,将菌体均匀重悬后使用高压破碎仪进行破碎,将破碎后的菌体离心后得到粗酶液。利用SDS-PAGE对粗酶液中的两种酶的共表达情况进行考察,并同时构建ImL反应体系,并用紫外分光光度法检测反应体系中的辅酶消耗或生成,分别考察粗酶液中两种酶的比活力以确定优选诱导温度。
[0013]上述技术方案中,步骤(1)中,所述的发酵液使用的LB培养基的配制方法为现有技术。
[0014]上述技术方案中,步骤(1)中,所述的底物6-氰基_(5R)_羟基-3-羰基己酸叔丁酯结构式为:.νΧΧΛ*y。
[0015]上述技术方案中,步骤⑴中,各试剂的添加顺序为任意随机的次序,无严格顺序要求。
[0016]上述技术方案中,步骤(2)中,调节反应体系pH的试剂选自甲酸、乙酸、盐酸、氨水、氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
[0017]进一步技术方案中,所述制备6-氰基_(3R,5R)_ 二羟基己酸叔丁酯的方法还包括:步骤(2)反应完成后将反应液与等体积的乙酸乙酯混合,使蛋白质变性并从水相体系中萃取产物,离心除去变性蛋白,除溶剂后,得到6-氰基-(3R,5R) - 二羟基己酸叔丁酯油状物。
[0018]由于上述技术方案的运用,本发明与现有技术相比具有以下特点:
1、由于本发明使用了共表达NADPH依赖型羰基还原酶与NADP+依赖型葡萄糖脱氢酶的基因重组大肠杆菌作为生物催化剂,这两种酶组成了细胞内辅酶循环再生体系。利用大肠杆菌内源的辅酶进行高效的辅酶循环,在反应中完全不需要外源性的辅酶添加,极大地降低了工艺成本。
[0019]2、通过优选羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的串联表达序列,建立了羰基还原酶催化合成6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯和葡萄糖-葡萄糖脱氢酶NADPH再生系统相匹配的的生物合成系统。
[0020]3、由于反应采用大肠杆菌发酵液作为催化剂,不需要对菌体进行分离收集,更不需要由菌体制备粗酶液,极大地简化了工艺。同时本发明的工艺可以在发酵罐中实现发酵-反应的全过程,非常便于工业放大生产,具有较高的经济价值。同时采用发酵罐进行高密度发酵后可以进一步提高发酵液密度,从而进一步提升反应的最大底物载量。
[0021]4、本发明采用的辅酶还原力供体为葡萄糖,价格低廉,性质稳定,在反应中易于操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为实施例一中所述的两种基因重组E.Coli中包含表达质粒的图谱。
[0023]图2为实施五例中所述的由葡萄糖脱氢酶介导的辅酶循环体系偶联羰基还原酶催化合成6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯反应过程示意图。
[0024]【具体实施方式】
结合附图,列出下述实施例用于说明本发明,但不应视为对本发明的限制。
[0025]p-gdh-crl质粒中的羰基还原酶基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0026]p-crl-gdh质粒中的羰基还原酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0027]p-crl-gdh质粒中的葡萄脱氢酶基因序列如SEQ ID NO:3所示。
[0028]p-gdh-crl质粒中的葡萄脱氢酶基因序列如SEQ ID NO:4所示。
[0029]实施例一
基因重组E.Coli的构建
全合成来自Saccharomyces cerevisiae的擬基还原酶基因crl与来自Bacillusmegaterium的葡萄糖脱氢酶基因gdh,并在基因序列上游和下游分别插入限制性酶内切位点:共表达载体pETDeut-Ι的I号多克隆位点(MCSl)上插入外源基因所采用的酶切位点为Nco I和BamH I位点;2号多克隆位点(MCS2)上插入外源基因所采用的酶切位点为Nde I和Xho I。利用本领域的技术人员熟悉的酶切-连接方法,分别将羰基还原酶基因及葡萄糖脱氢酶基因分别插入原核生物共表达载体的I号及2号多克隆位点(MCS)。经验证和鉴定之后,按照基因插入位点的不同将阳性质粒分为2种方案,方案1:羰基还原酶基因位于MCS1,葡萄糖脱氢酶基因位于MCS2,重组质粒为p-crl-gdh ;方案2:羰基还原酶基因位于MCS2,葡萄糖脱氢酶基因位于MCSl,重组质粒为p-gdh-crl。将这两种重组质粒分别转入E.ColiBL21表达宿主中,得到两种基因重组E.Coli,按照表达载体中基因插入顺序的不同分别称为PGC菌(羰基还原酶基因在MCS2)和pCG菌(羰基还原酶基因在MCSI)。
[0030]实施例二
基因重组E.Coli发酵液的制备
将实施例一中得到的两种基因重组E.Coli分别在50mL的LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)中,37°C振摇过夜培养。将20mL过夜培养后的菌液加入到250mL的LB培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)中,37°C振摇培养至培养液0D_ = 0.8±0.1时,加入终浓度为0.5mM的IPTG,在15~35°C下继续振摇培养16h后,得到基因重组E.Coli发酵液。
[0031]实施例三
羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶在不同温度下共表达情况的考察将实施例二中的菌体发酵液经5000*g离心15min收集菌体,其中15°C获得湿菌8g/L,25°C获得湿菌llg/L,20°C获得湿菌13g/L。菌体收集后加入的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液重悬菌体,经35kpsi高压破碎菌体。将破碎后的菌体15000*g离心20min后得到粗酶液。使用15%的SDS-PAGE对粗酶液进行检测,pGC和pCG中均正常共表达2种酶,其中羰基还原酶CRl单体分子量约35.5kDa,葡萄糖脱氢酶⑶H单体分子量约为28.3kDa。
[0032]实施例四
羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的活力匹配性优选
将实施例二中得到的粗酶液进行酶活测定,其中羰基还原酶活力测定体系为pH为7.0的0.1M磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、0.1 μΜ應0?!1、5 4 16-氰基-(510-羟基-3-羰基己酸叔丁酯以及10 μ L的适当稀释的粗酶液,总体积为lmL。葡萄糖脱氢酶活力测定体系为pH为7.0的0.1M磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、0.6μ M NADP+、5 μ M葡萄糖以及IOyL的适当稀释的粗酶液,总体积为lmL。利用紫外分光光度计,在37°C的恒温条件下测定反应体系中340nm波长的吸光度变化可以反映出体系中辅酶的增减,进而计算出体系中特定酶的比活力。在本发明中,I个单位的酶活力定义为每升新鲜发酵液中所含有的酶每分钟氧化NADPH/还原NADP+的微摩尔数。表1为两种不同的基因重组E.coli粗酶液中两种酶的比活数据。根据活力数据,在含PGC质粒的重组大肠杆菌中,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的活力匹配性更高。
[0033]表1不同诱导温度下粗酶液中两种酶比活力
【权利要求】
1.一种制备6-氰基_(3R,5R)_ 二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)向重组大肠杆菌发酵液中加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、助溶剂二甲基亚砜、共底物葡萄糖,构建原位生物合成体系; 所述发酵菌体为含重组共表达质粒的大肠杆菌工程菌;底物浓度为I~55g/L,优选35g/L ;助溶剂二甲基亚砜的体积分数为0% -10 %,优选5%,共底物葡萄糖与底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的摩尔比为20:1~0.5:1,优选1.2:1 ; (2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件完成,反应液pH范围为5.0~9.0,优选7.0,反应温度为15~35°C,优选20°C。
2.反应完成后乙酸乙酯萃取后得到6-氰基_(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯纯品。
3.根据权利要求1所述的制备6-氰基-(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的重组质粒为含羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶基因的重组共表达载体。
4.根据重组方案不同羰基还原酶基因序列可以是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2 ;葡萄糖脱氢酶基因序列可以是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
5.根据权利要求2所述的重组质粒,其特征在于,所述的表达载体为原核生物共表达载体,含有2个或2个以上多克隆位点(MCS);重组共表达质粒构建方案特征在于,方案1:羰基还原酶基因可位于MCS1,葡萄糖脱氢酶基因位于MCS2,重组质粒为p-gdh-crl ;方案2:羰基还原酶基因在表达载体MCS2,葡萄糖脱氢酶基因插入MCSl,重组质粒为p-crl-gdh。
6.根据权利要求1所述的含重组共表达质粒的大肠杆菌工程菌,其特征在于,所含的重组表达质粒优选为PGC,反应过程中羰基还原酶催化6-氰基_(5R)_羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原反应和葡萄糖脱氢酶介导的内源性辅酶循环系统完全匹配,无需利用外源性辅酶; 权利要求1所述的制备6-氰基_(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法中,步骤⑴所述的大肠杆菌发酵液的制备方法,其特征在于,含重组共表达质粒的工程菌在LB培养基中,37°C下振摇培养至培养液OD6tltl = 0.8±0.1后,加入0.5mM的诱导剂IPTG,在15~35°C下继续培养16h。
7.根据权利要求1所述的制备6-氰基-(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,所述制备6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的方法还包括:步骤(2)反应完成后将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取,得到6-氰基_(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯油状物。
8.根据权利要求1所述的制备6-氰基-(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于,步骤(2)中,调节 反应体系pH的试剂选自甲酸、乙酸、盐酸、氨水、氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
【文档编号】C12R1/19GK103911403SQ201410176223
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】陈依军, 苟旭东, 吴旭日 申请人:中国药科大学