β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因与应用。β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明首次通过采用β-淀粉酶和海藻糖合酶进行融合，获得的β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶能够利用直链淀粉或直链糊精生产海藻糖，同时减少了海藻糖合酶作用于麦芽糖产生海藻糖时，底物麦芽糖对产物海藻糖分离产生的影响。
【专利说明】β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因与应用，特别涉及一种 可利用直链淀粉或直链糊精生产海藻糖的β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因与 应用及其表达基因与应用，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 海藻糖（Trehalose, a-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranoside)又称为漏 芦糖、蕈糖，化学名α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡萄糖苷。研究人员首次在卷柏 (Selaginell lepidophylla)中提取出海藻糖，随后于1982年从黑麦的麦角菌中分离出 来。海藻糖由两分子葡萄糖分子通过α，α-1，1-糖苷键连接而成，每个葡萄糖分子减少的 部分用于形成α，α-1，1-糖苷键，不存在游离的醛基，因此，海藻糖是一种非还原性双糖。 自然界中，在昆虫、真菌和细菌，甚至在一些植物中都发现有海藻糖的存在，特别是在酵母、 霉菌以及蘑菇等真菌中，含量可高达干重的16%以上。
[0003] 海藻糖具有广泛的应用前景。海藻糖具有抗逆保鲜作用，不会发生美拉德反应，因 而用于食品工业中，不会对食品的色泽、风味、质地和香气产生影响，是理想的食品保鲜剂。 用海藻糖干燥的医学用生物活性物质在储存的过程中无需冷冻，在复水后均能恢复活力， 简化了酶试剂的制备。海藻糖具有独特的保护生物大分子的功能，可用于病毒、疫苗、激素、 重组人体蛋白、离体细胞和组织的保存，对于外科领域而言，为器官移植和生殖工程提供有 力的保障。研究人员发现隐生生物之所以能够在高度脱水后复活，是因为体内含有大量的 海藻糖。海藻糖可以提高生物膜结构和提高生物组织对低温、高温、盐碱、干旱等逆境条件 的抗性。另外海藻糖还可以用于化妆品行业，作为保湿剂和稳定剂。
[0004] 起初，人们通过菌体抽提的方法进行海藻糖的生产，但这种方法得到的海藻糖纯 度不高，且处理过程复杂，采用的提取溶剂一般都为有机溶剂，具有一定的污染性。也有研 究人员提出利用微生物发酵法，向发酵液中分泌海藻糖，但发酵液中积累的海藻糖含量较 低，效果不理想。随着科学技术的发展，一些研究人员提出利用酶法进行生产。目前利用的 酶主要为海藻糖合酶（Trehalose synthase,E. C. 5. 4. 99. 16)、麦芽糖磷酸化酶与海藻糖磷 酸化酶双酶系和低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶与低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶双酶系进 行海藻糖的生产，这些方法有利用麦芽糖为底物的，也有利用淀粉为底物进行生产。1995年 日本林原生化研究所首次报道了利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase)和麦芽寡糖基海 藻糖水解酶（MTHase)共用，由淀粉通过酶法转化生产海藻糖的方法，从此开辟了淀粉生产 海藻糖的时代。
[0005] 但上述两种酶共同作用不仅生产条件难于控制，而且中间产物为麦芽糖，而麦芽 糖与海藻糖分离较为困难，因此增加了后续分离纯化的难度。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供淀粉酶-海藻糖合酶融合酶及其表达基因 与应用。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] β -淀粉酶-海藻糖合酶融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 上述β -淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
[0010] 一种重组载体，该载体包含有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的功能片断。
[0011] 根据本发明优选的，所述的载体为PET质粒。
[0012] 一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组载体或表达上述β-淀粉酶-海藻糖合 酶融合酶。
[0013] 根据本发明优选的，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0014] 上述淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，淀粉酶-海藻糖合酶融合 酶、重组载体或重组细胞在制备海藻糖中的应用。
[0015] 有益效果
[0016] 1、本发明首次通过采用β-淀粉酶和海藻糖合酶进行融合，获得的β-淀粉 酶-海藻糖合酶融合酶能够利用直链淀粉或直链糊精生产海藻糖，同时减少了海藻糖合酶 作用于麦芽糖产生海藻糖时，底物麦芽糖对产物海藻糖分离产生的影响。
[0017] 2、由于β -淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的使用，可以简化生产工艺，有利于工艺条 件的控制，并且由于β-淀粉酶产生的麦芽糖位于海藻糖合酶的周围，使海藻糖合酶周围 的底物浓度高于溶液中其他位置，从而有利于海藻糖的生成，同时，麦芽糖合成海藻糖后， β -淀粉酶周围的麦芽糖减少，促进了 β -淀粉酶继续分解淀粉。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是β -淀粉酶重组质粒图谱；
[0019] 图2是β -淀粉酶与海藻糖合酶融合酶重组质粒图谱；
[0020] 图3是含有β -淀粉酶重组质粒的菌株抗性筛选结果；
[0021] 图4是β -淀粉酶重组质粒酶切后的电泳图；
[0022] 其中：1 :核苷酸标准分子量；2-3 :两个平行的酶切样品。
[0023] 图5是含有β -淀粉酶与海藻糖合酶融合酶重组质粒的菌株抗性筛选结果照片；
[0024] 图6是β -淀粉酶与海藻糖合酶融合酶重组质粒酶切后的电泳图；
[0025] 其中：1 :核苷酸标准分子量；2-3 :两个平行的酶切样品。
[0026] 图7是含有融合酶重组质粒的菌株胞内蛋白质的SDS-PAGE电泳分析结果；
[0027] 其中：泳道Μ:蛋白质标准分子量（自上而下分别为120kDa、100kDa、80kDa、 60kDa、50kDa。）
[0028] 泳道1 :菌株E. coli BL21 (pET_28a)所含蛋白质检测结果；
[0029] 泳道2 :菌株E. coli BL21 (pET-28a_BA)所含蛋白质检测结果；
[0030] 泳道3 :菌株E. coli BL21 (pET-28a-TS)所含蛋白质检测结果；
[0031] 泳道4-9 :菌株E. coli BL21 (pET-28a-BATS)所含蛋白质检测平行实验结果。
[0032] 图8是含有融合酶重组质粒的菌株胞内酶作用于底物（直链淀粉）后，HPLC对反 应混合液的分析结果；
[0033] 其中：图A、葡萄糖（Μ)、麦芽糖（G)和海藻糖⑴的混合标准样品HPLC结果（浓 度：20g/L);图B、融合酶BATS与直链淀粉溶液反应液HPLC结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0035] 以下实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 生物材料来源
[0037] 蜡状芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC :21732 ;
[0038] 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)购自美国菌种保藏中心（ATCC)，菌种编号： ATCC :17484。
[0039] 以下实施例中用到的培养基配方及抗生素配方如下：
[0040] LB培养基：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCllOg、琼脂粉20g(固体培养基时需添 加），定容至1L，121°C灭菌20min。
[0041] Ka溶液（10mg/mL):称取0· 5g卡那霉素，加入灭菌水定容至50mL，过滤除 菌，-20°C保存。
[0042] 含有Ka抗性的LB平板：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 10g、琼脂粉20g，定容至1L， 121°C灭菌20min。当培养基温度降至40?50°C时加入卡那霉素（Ka，培养基中Ka终浓度 为 50 μ g/mL)。
[0043] LB液体培养基（质量百分比）：蛋白胨，1% ;酵母浸粉，0. 5% ;NaCl，l%，余量水； ρΗ7· 0 ;在 121°C 下灭菌 20min。
[0044] 发酵培养基：蛋白胨12g ;酵母浸粉6g ;NaC112g ;甘油4mL ;pH7. 0 ;加水定容至 1000mL，121°C 下灭菌 20min。
[0045] 实施例1
[0046] β -淀粉酶表达载体的构建，步骤如下：
[0047] 提取蜡状芽孢杆菌的基因组DNA，经PCR扩增β -淀粉酶基因片段，然后将PCR扩 增产物经凝胶回收后通过限制性内切酶BamH I /HindIII酶切后，克隆到同样经限制性内切 酶BamH I /Hind III酶切的质粒pET-28a的相应位点，得到重组质粒pET-BA ;结果如图1所 /_J、1 〇
[0048] 引物 1 :5, -CGCGGATCCATGAAAAATCAGTTTCAATATTGTTGTATTGTTGTTTTG ;
[0049] 引物 2 :5, -CCCAAGCTTCCACCAACTTACATGAGAGGTAGTCTTCATTG ;
[0050] 上述PCR反应体系如表1所示：
[0051] 表 1
[0052]
【权利要求】
1. β -淀粉酶-海藻糖合酶融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 权利要求1所述β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种重组载体，该载体包含有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的功能片断。
4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的载体为pET质粒。
5. -种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组载体或表达上述β-淀粉酶-海藻糖合酶 融合酶。
6. 如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE)。
7. 权利要求2所述β -淀粉酶-海藻糖合酶融合酶的表达基因，权利要求1所述β -淀 粉酶-海藻糖合酶融合酶、权利要求3所述重组载体或权利要求5所述重组细胞在制备海 藻糖中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104059902SQ201410209147
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】马春玲, 王瑞明, 李丕武, 王腾飞, 李猛 申请人:齐鲁工业大学