Trail受体结合剂和其用途
【专利摘要】本发明一般涉及TRAIL受体结合剂的制备和其用途。特别地，本发明涉及抗TRAIL受体抗体的制备，所述抗体识别TRAIL受体1(TRAIL-R1)，以及它们用于TRAIL受体检测和TRAIL受体介导的功能的调节的用途。TRAIL受体结合剂对于在人类癌细胞中诱导细胞凋亡是有用的。本发明提供了本发明的TRAIL受体结合剂在癌症治疗中的用途。CGMCC 200120070413CGMCC 200520070413CGMCC 200420070413CGMCC 200320070413CGMCC 200220070413CGMCC169120060420CGMCC173320060609CGMCC166520060328CGMCC 200020070413
【专利说明】TRAIL受体结合剂和其用途
[0001] 本发明申请是基于申请日为2007年4月29日，申请号为200780024115.2(国际 申请号为PCT/CN2007/001453)，发明名称为"TRAIL受体结合剂和其用途"的专利申请的分 案申请。 发明领域
[0002] 本发明一般涉及TRAIL受体结合剂的制备和其用途。特别地，本发明涉及抗TRAIL 受体抗体的制备，所述抗体识别TRAIL-Rl，以及它们用于TRAIL受体检测和TRAIL受体介导 的功能的调节的用途。
[0003] 发明背景
[0004] TRAIL在上世纪90年代被鉴定。在TRAIL被发现后不久，人们注意到了它作为抗 癌剂用于癌症治疗的潜力。这是基于TRAIL选择性地杀死肿瘤细胞而不杀死正常细胞的能 力。重要地，TRAIL的抗肿瘤效力可以通过许多当前的癌症疗法（例如，化疗和放射治疗） 来显著地增强。另一方面，TRAIL可以致敏肿瘤细胞并提高肿瘤细胞对化疗和放射治疗的 敏感性。因此，TRAIL与化疗和放射治疗的组合已经被认为是将来非常有效的抗肿瘤治疗 方法。
[0005] TRAIL是TNF蛋白质家族的成员。这个家族的一些蛋白质的特征是它们诱导细 胞凋亡的能力，例如TNF-α和Fas配体。然而，由于它们的有毒副作用，TNF-α和Fas 配体没有临床应用的价值。相比之下，TRAIL展现对肿瘤细胞的选择性杀伤，它的临床价 值是明显的。迄今为止，已经鉴定了 TRAIL的五种受体，其中的两种DR4(TRAIL-R1)和 DR5(TRAIL-R2)能够转导细胞凋亡信号，而其他三种DcRl(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)和 护骨蛋白（〇ste 〇pr〇tegerin，OPG)不转导细胞凋亡信号。TRAIL的所有五种受体在它们的 细胞外配体结合结构域中有显著的同源性。DR4和DR5的细胞内片段含有保守的功能结构 域，即所谓的"死亡结构域"，其负责转导细胞凋亡信号。
[0006] 在几年的研究之后，TRAIL的主要生物学功能已经是公知的。TRAIL在对肿瘤细胞 的免疫监督中起到重要作用。活化的T淋巴细胞和NK细胞表达高水平的TRAIL，其为这些 免疫活性细胞提供杀死肿瘤细胞的手段。动物研究表明，TRAIL的敲除导致肿瘤发生率随 年龄提高。因此，TRAIL的缺陷或不充分的表达可能是肿瘤发生的关键因素。
[0007] 由于TRAIL的细胞凋亡诱导功能是由它的受体介导的，对TRAIL受体系统已经进 行了大量的研究。早期研究提示许多正常细胞可以在转录水平上表达TRAIL的死亡受体 (TRAIL-R1和TRAIL-R2)。随着抗死亡受体抗体的获得，已经相信的是，正常细胞和组织表 达非常低水平的细胞表面TRAIL-Rl和TRAIL-R2。相比之下，正常细胞和组织可能表达高水 平的TRAIL-R3和TRAIL-R4。在正常细胞中不同的TRAIL受体的这种差异表达可能是正常 细胞逃脱TRAIL杀伤的关键保护性机制。不同于正常细胞，大多数转化的肿瘤细胞表达高 水平的TRAIL-Rl和TRAIL-R2,而TRAIL-R3和TRAIL-R4的表达水平是非常低的。因而，大 多数肿瘤细胞对TRAIL介导的杀伤是敏感的。在正常细胞和肿瘤细胞之间TRAIL受体的差 异表达很好地解释了 TRAIL的选择性。
[0008] 许多前临床研究确认了 TRAIL是用于癌症治疗的安全的和有效的治疗剂。已经显 示的是，三聚化的可溶TRAIL的全身性施用在实验动物中不产生毒性，又能够诱导植入的 肿瘤的退化。更加鼓舞人心的是，当TRAIL与化疗或放射治疗组合时，它的抗肿瘤效力被显 著地增强。这种协同效应已经通过许多体外和体内实验展现。此外，TRAIL可以提高肿瘤 细胞对化疗和放射治疗的敏感性。由于肿瘤细胞对化疗和放射治疗的抗性是癌症治疗中的 主要障碍，TRAIL阻止或逆转化学或辐射抗性的能力可能是将来的癌症治疗中显著的进步。
[0009] 然而，作为治疗剂，TRAIL具有几个缺点。首先，TRAIL具有至少五种受体，包括两 种死亡受体和诱饵受体，因而缺乏对受体的选择性。特别地，当癌细胞表达不同的死亡受体 和诱饵受体时，难以预测TRAIL的细胞凋亡诱导能力。第二，重组TRAIL具有非常短的体内 半衰期，其限制了 TRAIL的体内有效剂量和抗癌效力。患者经常地接受重复的和大剂量的 TRAIL是不方便的。第三，人们担心重组TRAIL的某些形式具有潜在的肝细胞毒性。
[0010] TRAIL作为治疗剂的这些局限性导致了对TRAIL的替代物的开发。单克隆抗体可 以选择性地靶向TRAIL的死亡受体，其可能是癌症治疗的更有效和安全的策略。
[0011]自产生第一个单克隆抗体以来的25年间，单克隆抗体已经在癌症治疗中展现了 很大的影响。大多数那些临床上有效的单克隆抗体靶向在癌细胞表面高度表达的抗原或 受体，并阻断肿瘤生长所需的生长信号。这些抗体通过活化补体和抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)来杀死肿瘤细胞。此外，当与放射性同位素、毒素或药物缀合时，单克隆抗体可以用 作追踪分子，将这些治疗剂带往癌症组织并增强抗癌效力。
[0012] 已经成功地生产了 TRAIL-Rl或TRAIL-R2特异性单克隆抗体来替换TRAIL用于癌 症治疗。几种这样的抗体已经进入临床试验。初步的结果显示这些抗体不仅具有强的抗癌 效力，与TRAIL相比也是安全的。
[0013] 日本医药公司Sankyo首先开发了一种抗TRAIL-R2抗体，TRA-8。Ichikawa等人 使用了 TRAIL-R2-FC融合蛋白作为免疫原来免疫Balb/c小鼠。虽然TRA-8不诱导正常细 胞的细胞凋亡，许多肿瘤细胞对于TRA-8诱导的细胞凋亡是高度敏感的。虽然TRAIL-R2 的mRNA广泛地分布在正常的组织中，TRAIL-R2蛋白质却在正常的组织包括肝、肺、乳腺、肾 脏、脾脏、卵巢、耳和胰腺中检测不到。然而，这些组织中的癌细胞则表达高水平的TRAIL-R2 蛋白质。此外，正常的胶质细胞和外周血细胞表达极低水平的TRAIL-R2,对于TRA-8诱导的 细胞凋亡不是敏感的，而胶质瘤细胞和白血病细胞的水平表达高，并且对TRA-8诱导的细 胞凋亡非常敏感。在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡方面，TRA-8也展现了比TRAIL更高几倍的 细胞凋亡诱导能力。重要地，TRA-8不诱导正常肝细胞的细胞凋亡。当与化疗或放射治疗 组合时，TRA-8的抗癌效力被显著地增强。TRA-8当前处于I期临床试验中。
[0014] 人类基因组科学（Human Genome Sciences)进行了抗TRAIL-Rl抗体的I期试验。 初步数据表明，患者良好地耐受，在几个患者中观察到阳性应答，表明抗TRAIL-Rl是安全 和有效的治疗剂。
[0015] 能够诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的许多抗体对于TRAIL-Rl或TRAIL-R2是特异性 的。还报道了针对TRAIL-Rl和TRAIL-R2的双特异性抗体。（Lynch，US2002/0155109)。 由于肿瘤细胞可能选择性地表达死亡受体的仅一种类型，因而，这些抗体具有有限的谱 (spectrum)，不能靶向所有的肿瘤细胞。同时，由于癌细胞可能差异表达两种类型的受体 并具有优选的信号转导，这些抗体的杀伤活性变化很大。因而，本领域需要使用其他的抗 TRAIL受体抗体用于TRAIL受体检测和TRAIL受体介导的功能的调节。
[0016] 发明概述
[0017] 本发明涉及识别TRAIL-Rl和TRAIL-R2共有的共同抗原决定簇（即表位）的TRAIL 受体结合剂（例如抗体）的制备，以及它们用于TRAIL受体检测和TRAIL受体介导的功能的 调节的用途。在一个方面，本发明提供了结合TRAIL受体I(TRAIL-Rl)和/或TRAIL受体 2(TRAIL-R2)的TRAIL受体结合剂（例如，抗体），其中处于其可溶形式的所述TRAIL受体结 合剂（例如，抗体）在低浓度下在表达TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2的癌细胞中具有体内和体 外的细胞死亡诱导活性。在一个实施方式中，所述TRAIL受体结合剂（例如，抗体）结合在 至少一个细胞的表面表达的多肽TRAIL受体I (TRAIL-Rl)和/或TRAIL受体2 (TRAIL-R2)。 在一个实施方式中，所述TRAIL受体结合剂（例如，抗体）结合TRAIL受体I(TRAIL-Rl)和 /或TRAIL受体2 (TRAIL-R2)之间具有至少约百分之九十的氨基酸同源性的多肽区域。在 一个实施方式中，本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）结合的氨基酸同源性的区域 包含氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE (SEQ ID NO :44)，其中X是K或G，并且能够诱导具有 TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2受体的细胞的细胞死亡。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了具有与CGMCC登录号1665的小鼠-小鼠杂交瘤 CTB003所产生的相同的表位特异性的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）。
[0019] 在另一个方面，本发明提供了 TRAIL受体结合剂（例如，抗体）或其抗原结合片 段，至少包含HITMVVGPFA(SEQ ID N0:11)的重链⑶R3氨基酸序列或具有一个或多个保守 性氨基酸替换的所述序列，其中所述TRAIL受体结合剂（例如，抗体）或其片段结合TRAIL 受体 I (TRAIL-Rl)和 / 或 TRAIL 受体 2 (TRAIL-R2)，并且在表达 TRAIL-Rl 和 / 或 TRAIL-R2 的癌细胞中具有体内和体外的细胞死亡诱导活性。
[0020] 在某些实施方式中，本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）（或其抗原 结合片段）缀合于癌症治疗剂，其中所述治疗剂优选地选自由肿瘤活化前体药物 (tumor-activated prodrug)、放射性核素、化疗药物和毒素构成的组。
[0021] 在另一个方面，本发明提供了编码本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）的分 离的核酸。
[0022] 在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体） 的分离的核酸的宿主细胞或载体。
[0023] 在另一个方面，本发明提供了包含本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）和药 学上可接受的载体的组合物。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的商业试剂盒，其包含处在容器中的 本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体），所述商业试剂盒进一步包含用于治疗癌症的化 疗剂和/或癌症治疗性TRAIL受体结合剂（例如，抗体），其中所述化疗剂和/或癌症治疗 性TRAIL受体结合剂（例如，抗体）任选地被置入分别（separate)的容器中。
[0025] 在另一个方面，本发明提供了 TRAIL-Rl和TRAIL-R2的表位，包含氨基酸序列 VXDCTPWSDIECVHKE (SEQ ID NO :44)，其中X是K或G，所述表位被能够结合TRAIL-Rl和/或 TRAIL-R2并且能够诱导具有TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2受体的细胞的细胞死亡的TRAIL受 体结合剂（例如，抗体）所识别。在一个实施方式中，本发明提供了通过制备含有TRAIL-Rl 和TRAIL-R2的表位的免疫原而产生的TRAIL受体结合剂（例如，抗体），所述免疫原包含 氨基酸序列VXDCTPWSDIECVHKE (SEQ ID NO :44)，其中X是K或G，且所述表位被能够结合 TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2并能够诱导具有TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2受体的细胞的细胞 死亡的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）所识别。
[0026] 在另一个方面，本发明提供了本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）在制备用 于在表达TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2的癌细胞中选择性诱导细胞死亡的药物中的用途。
[0027] 在另一个方面，本发明提供了本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体）在制备用 于在表达TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2的癌细胞中增强其他化疗剂的抗癌活性的药物的用 途，其中所述治疗剂是化疗剂，其中所述治疗剂选自由博来霉素、卡钼、苯丁酸氦芥、顺钼、 秋水仙碱、环磷酰胺、柔红霉素、放线菌素、己烯雌酚、阿霉素（doxoribicin)、鬼白乙叉甙、 5_氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脱氧核苷、美法仑、氨甲蝶呤、丝裂霉素 C、巯嘌呤、紫杉醇、鬼臼噻 吩甙、6-硫代鸟嘌呤、长春新碱和长春碱构成的组。
[0028] 在另一个方面，本发明提供了药学有效量的本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗 体）在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中药学有效量的TRAIL受体结合剂（例如，抗 体）选择性地诱导表达TRAIL-Rl和/或TRAIL-R2多肽的癌细胞的细胞死亡。
[0029] 在另一个方面，本发明提供了药学有效量的本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗 体）作为药物的用途。
[0030] 在另一个方面，本发明提供了在有需要的受试者中选择性地诱导表达TRAIL-Rl 和/或TRAIL-R2多肽的细胞的细胞死亡的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量 的本发明的TRAIL受体结合剂（例如，抗体），从而选择性地诱导表达TRAIL-Rl和/或 TRAIL-R2多肽的细胞的细胞死亡。在所述方法的一个实施方式中，表达TRAIL-Rl和/或 TRAIL-R2多肽的细胞是癌细胞。在所述方法的一个实施方式中，所述癌细胞选自由乳腺癌 细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞构成的组。
[0031] 附图简要说明
[0032] 附图例示而不是限制性地描绘了优选的实施方式。
[0033] 图1.显示来自杂交瘤CGMCC1665的免疫球蛋白重链和轻链的可变区的核苷酸和 氣基酸序列的不意图。画面A显不了 CTB003Vk核昔酸和氣基酸序列。画面B显不了 CTB003Vh 核苷酸和氨基酸序列。CDR序列加有下划线。
[0034] 图2.显示CTB003的特征的图。含有人类TRAIL-Rl和TRAIL-R2的细胞外结构域的 异二聚形式的重组人类IgGl-Fc融合蛋白，或含有TRAILl、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4 的同二聚形式的重组人类IgGl-Fc融合蛋白被固定在ELISA平板上，与各种浓度的CTB003 温育。在与HRP缀合的山羊抗小鼠 IgGl反应之后，添加 TMB底物来进行显色反应。通过 CTB003与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。数据表示为0D450/650作为CTB003浓度 (ng/ml)的函数。
[0035] 图3.显示在人类癌细胞的细胞凋亡诱导中CTB003的剂量应答关系的图。人类 癌细胞系的图面：图面A.乳腺癌；图面B.结肠癌；图面C.胰腺癌；图面D.卵巢癌；图面 E.前列腺癌；以及图面F.肺癌与各种的浓度的CTB003温育过夜。利用培养基对照作为 100 %细胞活力，通过ATPLite分析测定细胞活力。
[0036] 图4.显示在癌细胞的细胞凋亡诱导中CTB003的时间依赖性应答的图。人类乳腺 癌细胞（MDA231)和结肠癌细胞（C〇1〇205)与1000ng/ml的CTB003温育标明的时间点，通 过ATPLite分析测定细胞活力。数据表示为细胞活力（％)作为温育时间（小时）的函数。
[0037] 图5.显示CTB003和阿霉素协同诱导癌细胞死亡的图。人类乳腺癌细胞系（BT474) 在存在或不存在各种浓度的阿霉素的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite 细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度（ng/ml)的函数的细胞活力 (%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力（％)的柱形图。
[0038] 图6.显示CTB003和紫杉醇（Taxol)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细 胞系（SW620)在存在或不存在各种浓度的紫杉醇的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。 通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度（ng/ml)的函 数的细胞活力（％)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力（％)的柱形图。
[0039] 图7.显示CTB003和顺钼协同诱导癌细胞死亡的图。将人类肺癌细胞系（A437)在 存在或不存在各种浓度的顺式钼氨的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite 细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度（ng/ml)的函数的细胞活力 (%)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力（％)的柱形图。
[0040] 图8.显示CTB003和CTP-Il协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结肠癌细胞系 (SW1116)在存在或不存在各种浓度的CTP-Il的条件下与各种浓度的CTB003温育过夜。通 过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003浓度（ng/ml)的函数 的细胞活力（％)的图。图面B显示了各个处理组观察到的细胞活力（％)的柱形图。
[0041] 图9.显示CTB003和吉西他滨（Gemcitabine)协同诱导癌细胞死亡的图。将人 类胰腺癌细胞系（PANCl)在存在或不存在各种浓度的吉西他滨的条件下与各种浓度的 CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了作为CTB003 浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B显示了各个处理组观察的细胞活力 (%)的柱形图。
[0042] 图10.显示CTB003和抗TRAIL-R1(CTB007)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结 肠癌细胞系（SW1116)在存在或不存在各种浓度的抗TRAIL-Rl抗体（CTB007)的条件下与 各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了 作为CTB003浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B显示了各个处理组观察到 的细胞活力（％)的柱形图。
[0043] 图11.显示CTB003和抗TRAIL-R2(CTB006)协同诱导癌细胞死亡的图。将人类结 肠癌细胞系（SW1116)在存在或不存在各种浓度的抗TRAIL-R2抗体（CTB006)的情况下与 各种浓度的CTB003温育过夜。通过ATPLite细胞活力分析测定细胞活力。图面A显示了 作为CTB003浓度（ng/ml)的浓度的函数的细胞活力（％)的图。图面B显示了对各个处理 组观察的细胞活力（％)的柱形图。
[0044] 图12.表现CTB003的体内抗肿瘤活性的图。Balb/c裸鼠皮下接种人类乳腺癌细 胞（MDA231)。接种后10天，小鼠接受200 μ g CTB003的腹膜内（i. p.)注射，以三天的间隔 每周两次。处理重复进行三周。每周测量肿瘤大小。数据表示为作为处理后的时间（天） 的函数的肿瘤大小（cm 3)。
[0045] 图13.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠 TRAIL受体结合剂CTB003对人类乳 腺癌细胞系MDA231的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间（天） 的函数的肿瘤大小改变的百分比％。
[0046] 图14.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠 TRAIL受体结合剂CTB003对人类肝 癌细胞系7402的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间（天）的 函数的肿瘤大小改变的百分比％。
[0047] 图15.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠 TRAIL受体结合剂CTB003对人类结 肠癌细胞系C〇1〇205的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间（天） 的函数的肿瘤大小改变的百分比％。
[0048] 图16.显示在鼠异种移植体内实验模型中鼠 TRAIL受体结合剂CTB003对人类胰 腺癌细胞系MIAcapa的生长的影响的时间依赖性的图。数据表示为作为治疗后的时间（天） 的函数的肿瘤大小改变的百分比％。
[0049] 图17.显示与阿霉素组合的CTB003的杀肿瘤活性的直方图。Balb/c裸鼠皮下接 种人类乳腺癌细胞（MDA231)。接种后10天，小鼠首先接受IOOyg阿霉素的腹膜内注射， 一天后接受200 μ g CTB003的腹膜内注射。小鼠以三天的间隔每周两次地处理。重复进行 处理两周的时间。在最后一次治疗后两天测量肿瘤大小。数据表示为作为处理组（之前和 之后）的函数的肿瘤大小（cm 3)。显示的处理组如下：未处理（对照）；阿霉素；CTB003 ;和 阿霉素+CTB003。
[0050] 图18.显示在人类MDA231乳腺癌异种移植模型中与抗TRAIL-R2 (CTB006)组合的 CTB003的杀肿瘤活性的直方图。Balb/c裸鼠皮下接种人类乳腺癌细胞（MDA231)。接种后 10天，小鼠接受200 μ g CTB003和CTB006的腹膜内注射。小鼠以三天的间隔每周两次地 进行处理。处理重复进行两周的时间。在最后一次处理后两天测量肿瘤大小。数据表示为 作为处理组（之前和之后）的函数的肿瘤大小（cm 3)。显示的处理组是：未处理（对照）； CTB003 ;CTB006 ;和 CTB003+CTB006。
[0051] 图19.显示CTB003识别的TRAIL-R2的抗原表位的分析的图。利用多肽抑制测定 来确定TRAIL-R2中CTB003所识别的表位。将ELISA平板用TRAIL-R2-FC融合蛋白包被，并 与编码TRAIL-R2的细胞外结构域的不同部分的一系列多肽（A-G)温育。数据表示为作为 肽浓度（nM)的函数的、所观察到的CTB003对TRAIL-R2的结合的最大结合的百分比（％)。
[0052] 图20.显示CTB003所识别的TRAIL-Rl和TRAIL-R2的抗原表位的实验确认的图。 利用多肽抑制测定来确定TRAIL-Rl和TRAIL-R2中CTB003所识别的表位。将ELISA平板 用TRAIL-Rl或TRAIL-R2-FC融合蛋白包被，并将其在存在或不存在各种浓度的分别编码 TRAIL-Rl和TRAIL-R2的细胞外结构域的多肽（I和H)的条件下与CTB003温育。数据表示 为作为肽浓度（nM)的函数的、所观察到的CTB003对TRAIL-Rl (图面A)或TRAIL-R2 (图面 B)的结合的最大结合的百分比（％)。
[0053] 图21.显示CTB003(鼠）和hCTB003(人源化、嵌合的）TRAIL受体结合剂的结合 特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗原的细胞外结构域的重组人类 IgGl-Fc 融合蛋白（图面 A)、TRAIL-Rl-Fc (图面B)、TRAIL-R2-Fc (图面 C)、TRAIL-R3-Fc (图 面D)、TRAIL-R4-Fc (图面E)或BSA(对照；图面F)固定在ELISA平板上，与各种浓度（ng/ ml)的CTB003 (鼠）或hCTB003 (人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB003)温育。与HRP缀合的 山羊抗小鼠 CTB003 (鼠）IgGl反应，或与HRP缀合的山羊抗人kappa反应之后，添加 TMB底 物来进行显色反应。通过CTB003或hCTB003与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。每个 图面（A-F)中的数据表示为作为抗体浓度（ng/ml) (S卩，CTB003浓度（ng/ml)或嵌合CTB003 浓度（ng/ml))的函数的0D450/650。
[0054] 图22.显示CTB006(鼠）和hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合的CTB006) TRAIL受体结合剂的结合特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗 原的细胞外结构域的重组人类IgGl-Fc融合蛋白（图面A)、TRAIL-Rl-Fc (图面B)、 TRAIL-R2-FC (图面 C)、TRAIL-R3-Fc (图面 D)、TRAIL-R4-Fc (图面 E)或 BSA (对照；图面 F) 固定在ELISA平板上，并与各种浓度（ng/ml)的CTB006(鼠）或hCTB006(人源化、嵌合的） 温育。与HRP缀合的山羊抗小鼠 CTB006 (鼠）IgG反应，或与HRP缀合的山羊抗人kappa反 应之后，添加底物来进行显色反应。通过CTB006或hCTB006与每种蛋白质的OD值来测定 结合能力。每个图面（A-F)中的数据表示为作为抗体浓度（ng/ml) ( S卩，CTB006浓度（ng/ ml)或嵌合CTB006浓度（ng/ml))的函数的0D450/650。
[0055] 图23.显示CTB007(鼠）和hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌合的CTB007) TRAIL受体结合剂的结合特征的比较的图。将含有TRAIL-R1/TRAIL-R2异二聚体抗 原的细胞外结构域的重组人类IgGl-Fc融合蛋白（图面A)、TRAIL-Rl-Fc (图面B)、 TRAIL-R2-FC (图面 C)、TRAIL-R3-Fc (图面 D)、TRAIL-R4-Fc (图面 E)或 BSA (对照；图面 F) 固定在ELISA平板上，并与各种浓度（ng/ml)的CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的） 温育。与HRP缀合的山羊抗小鼠 CTB003 (鼠）IgG反应，或与HRP缀合的山羊抗人kappa反 应之后，添加底物来进行显色反应。通过CTB007或hCTB007与每种蛋白质的OD值来测定结 合能力。通过CTB007或hCTB007与每种蛋白质的OD值来测定结合能力。每个图面（A-F) 中的数据表示为作为抗体浓度（ng/ml) (S卩，CTB007浓度（ng/ml)或嵌合CTB007浓度（ng/ ml))的函数的 0D450/650。
[0056] 图24.显示hCTB003(即，人源化、嵌合的CTB003 ;也称为嵌合CTB003)所识别 的TRAIL-Rl和TRAIL-R2的抗原表位的确认的图。利用多肽抑制测定来确定TRAIL-Rl和 TRAIL-R2中hCTB003所识别的表位。将ELISA平板用TRAIL-Rl或TRAIL-R2-FC融合蛋白 包被，在存在或不存在各种浓度的分别编码TRAIL-Rl和TRAIL-R2的细胞外结构域的多 肽（I和H)的条件下与CTB003温育。数据表示为作为肽浓度（nM)的函数的、所观察到的 hCTB003对TRAIL-Rl (图面A)或TRAIL-R2(图面B)的结合的最大结合的百分比（％ )。
[0057] 图25.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类乳腺癌细胞 系MDA231的体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌 合的；也称为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为 CTB006(鼠）或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的 细胞活力（％ )的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌 合CTB007)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％ )的图。
[0058] 图26.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类结肠直肠癌细 胞系C〇1〇205的体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌 合的；也称为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为 CTB006(鼠）或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的 细胞活力（％ )的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌 合CTB007)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。
[0059] 图27.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类胰腺癌细胞系 MIAcapa体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌合的；也 称为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为CTB006(鼠） 或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％) 的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB007)的浓 度（ng/ml)的函数的细胞活力（％ )的图。
[0060] 图28.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类卵巢癌细胞系 Caov3体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌合的；也称 为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为CTB006(鼠） 或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％) 的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB007)的浓 度（ng/ml)的函数的细胞活力（％ )的图。
[0061] 图29.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类前列腺癌细胞 系Dul45体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌合的；也 称为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为CTB006(鼠） 或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％) 的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB007)的浓 度（ng/ml)的函数的细胞活力（％ )的图。
[0062] 图30.比较本发明的鼠的和人源化的嵌合TRAIL受体结合剂对人类肺癌细胞系 H2122体外生长的影响的图。图面A是作为CTB003(鼠）或hCTB003(人源化、嵌合的；也称 为嵌合CTB003)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)的图。图面B是作为CTB006(鼠） 或hCTB006(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB006)的浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％) 的图。图面C是作为CTB007(鼠）或hCTB007(人源化、嵌合的；也称为嵌合CTB007)的浓 度（ng/ml)的函数的细胞活力（％ )的图。
[0063] 图31.显示人类TRAIL受体的选定区域的氨基酸序列比对的示意图。
[0064] 图32.显示在差异表达TRAIL-Rl和TRAIL-R2的肿瘤细胞中CTB003的结合和细 胞凋亡诱导活性的图。图面A所示的图表现了针对CTB003、CTB006和CTB007与Jurkat 细胞的细胞表面结合的流式细胞术分析所得的数据。图面B所示的图表现了针对CTB003、 CTB006和CTB007与Ramos细胞的细胞表面结合的流式细胞术分析所得的数据。图面C是 显示CTB003、CTB006和CTB007在Jurkat细胞中的细胞凋亡诱导活性的图。图面D是显示 CTB003、CTB006和CTB007在Ramos细胞中的细胞凋亡诱导活性的图。图面C和图面D中 是数据表示为作为抗体浓度（ng/ml)的函数的细胞活力（％)。
[0065] 发明详述
[0066] 概述.要理解的是，下文以不同的详略程度描述本发明的某些方面、模式、实施方 式、变化形式和特征，以提供对本发明的实质上的理解。
[0067] 本发明一般地提供了 TRAIL受体结合剂（例如，抗体），其可以同时结合两种类 型的死亡受体来提高它的抗肿瘤谱和活性。本发明公开了这样的作用剂，它们等同地 (equally)结合TRAIL-Rl和TRAIL-R2,并能够诱导任何可表达单一类型的所述受体或两种 类型的所述受体的肿瘤细胞的凋亡。特别地，本发明提供了本发明的TRAIL受体结合剂结 合的TRAIL-Rl和/或-R2受体的细胞外结构域中TRAIL-Rl和TRAIL-R2的共有"表位"的鉴 定。这个表位大约处在跨越人类TRAIL-Rl的aa218到aa233的氨基酸残基（aa218-aa233 ; VKDCTPWSDIECVHKE，SEQ ID N0:45)的结构域中，或处在跨越人类TRAIL-R2的aal67到 aal82 的氨基酸残基（aal67-aal82;VGDCTPWSDIECVHKE，SEQ ID N0:46)的结构域中。从 而，本发明的各个方面涉及TRAIL受体结合剂的制备、表达和表征。
[0068] 本发明的TRAIL受体结合剂能够单独地或组合地用于检测测试样品中的TRAIL受 体多肽（也称为目标多肽），以及用于调节TRAIL受体介导的功能。TRAIL受体结合剂能 够用于在有需要的受试者中诊断、预防和/或治疗TRAIL受体相关的医学状况。本发明的 TRAIL受体结合剂（例如，抗体）提供了抗死亡受体策略的独特的生物学功能和广泛的抗癌 活性。虽然可溶的TRAIL已经显示在诱导体内肿瘤细胞的凋亡方面是有效的，但由于它非 常短的半衰期，它的杀伤活性似乎非常低，通常需要大的（和重复的）剂量。根据本发明的 结合剂与TRAIL及其他单特异性的抗TRAIL-Rl或TRAIL-R2抗体相比在携带人类癌细胞系 的动物中具有更高的药物有效性。
[0069] 本发明的各个方面进一步涉及诊断方法和试剂盒，它们使用本发明的TRAIL受体 结合剂来鉴定具有医学状况倾向的个体或者对于药物应答性、副作用或最佳药物剂量来对 个体分类。在其他方面，本发明提供了 TRAIL受体结合剂用于预防或治疗TRAIL受体介导的 病症以及用于筛选和/或验证配体（例如结合TRAIL受体多肽的小分子）等用途。因而， 下文将说明这些方面的各种特定的实施方式。
[0070] 在以下附随的说明中将阐述本发明的一个或多个实施方式的细节。虽然类似于或 等同于在此描述的那些的任何方法和材料可以被用于本发明的实践和测试，现在描述了优 选的方法和材料。根据说明书和权利要求书，本发明的其他特征、目的和益处将是明显的。 一般地，根据制造商的说明进行酶促反应和纯化步骤。技术和操作一般根据本领域的常规 方法和各种一般参考文献（一般参见，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989)进行，其在本申请文件全文中均有提供。
[0071] 除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语的含义一般与本发明所属技术领 域的普通技术人员通常所理解的相同。在本说明书和附随的权利要求中使用的单数形式 "一种/个（a，an)"和"该（the)"包括了复数的所指，除非文章内容明确地另有所指。例 如，提及"一种细胞"包括两种或更多细胞的组合，等等。一般地，在此使用的命名法，和本 文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学及杂交中的实验方法是 本领域公知和常用的。核酸和肽合成使用标准的技术。化学合成和化学分析使用标准的技 术或其修改方案。在此引用的所有参考文献在此为了所有目的通过将它们完全引用来合并 在此，其程度与具体的，单独的指示为了所有目的通过将其完全引用来合并每个单独的出 版物、专利、或专利申请相同。
[0072] 选用的缩写.选用的生物化学和血液学术语的缩写分别总结在下面的表1和表2 中。
[0073]
【权利要求】
1. 一种结合TRAIL受体l(TRAIL-Rl)的抗体，其中所述抗体以其可溶形式在低浓度下 在表达TRAIL-R1多肽的癌细胞中具有体内和体外的细胞死亡诱导活性。
2. 权利要求1的抗体，其包含： 如SEQ ID N0:32所示的轻链CDR1序列； 如SEQ ID N0:33所示的轻链CDR2序列； 如SEQ ID N0:34所示的轻链CDR3序列； 如SEQ ID N0:37所示的重链CDR1序列； 如SEQ ID N0:38所示的重链CDR2序列；和 如SEQ ID N0:39所示的重链CDR3序列。
3. 权利要求1或2的抗体，其包含： 如SEQ ID N0:31所示的轻链可变区氨基酸序列，和 如SEQ ID N0:36所示的重链可变区氨基酸序列。
4. 权利要求1-3中任一项的抗体，其是由CGMCC登录号1733的小鼠-小鼠杂交瘤 CTB007产生的。
5. 权利要求1-4中任一项的抗体，其是嵌合抗体或人源化抗体。
6. 权利要求1-4中任一项的抗体的抗原结合片段。
7. 权利要求1-5中任一项的抗体，其与癌症治疗剂缀合，其中所述治疗剂优选地选自 由肿瘤活化的前体药物、放射性核素、化疗药物和毒素构成的组。
8. -种分离的核酸，其编码权利要求1-5中任一项的抗体。
9. 一种宿主细胞或载体，其包含权利要求8的分离的核酸。 10. CGMCC登录号1733的小鼠-小鼠杂交瘤CTB007。
11. 一种组合物，其包含： 权利要求1_5、7的任一项的抗体，或者权利要求6的抗原结合片段；和 药学上可接受的载体。
12. -种用于治疗癌症的商业试剂盒，其在容器中包含权利要求1_5、7的任一项的抗 体或者权利要求6的抗原结合片段，所述商业试剂盒进一步包含用于治疗癌症的化疗剂和 癌症治疗抗体，其中所述化疗剂和癌症治疗抗体任选地置于分别的容器中。
13. 权利要求1_5、7中任一项的抗体或者权利要求6的抗原结合片段在制备用于在表 达TRAIL-R1的癌细胞中选择性诱导细胞死亡的药物中的用途，其中所述癌细胞选自乳腺 癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
14. 药学有效量的权利要求1_5、7中任一项的抗体或者权利要求6的抗原结合片段 用于制备治疗癌症的药物的用途，其中所述药学有效量的抗体选择性地诱导表达TRAIL-R1 多肽的癌细胞的细胞死亡，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 肺癌和肝癌。
15. 权利要求1_5、7中任一项的抗体或者权利要求6的抗原结合片段与由CGMCC登录 号1665的小鼠-小鼠杂交瘤CTB003所产生的抗体的组合用于制备治疗乳腺癌的药物的用 途。
【文档编号】C12N5/20GK104402999SQ201410212584
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2007年4月29日 优先权日:2006年4月30日
【发明者】余征, 周敏, 沈恩允, 贾冼钊, 宋扬 申请人:北京同为时代生物技术有限公司