一种鉴定线粒体基因效应的方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定线粒体基因效应的方法，该方法所采用的步骤是：通过制备转线粒体细胞，构建相同细胞核、不同线粒体（含有不同线粒体基因组）的细胞模型，通过比较各类细胞（包括核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞）的生化指标，结合各类细胞的mtDNA序列分析结果，建立线粒体基因组单倍型-细胞表型的关系，鉴定线粒体基因效应。
【专利说明】一种鉴定线粒体基因效应的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种鉴定线粒体基因效应的方法，属动物遗传学与分子育种领 域。本发明通过制备转线粒体细胞，构建相同细胞核、不同线粒体(含有不同线粒体基因组） 的细胞模型，并通过比较各类细胞(包括核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞）的生 化指标，结合mtDNA序列分析结果，建立线粒体基因组单倍型-细胞表型的关系，鉴定线粒 体基因效应。本发明涉及动物遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物化学和生物信息学的 技术方法。
【背景技术】
[0002] 自1988年发现mtDNA突变引发Leber遗传性视神经眼病以来（Wallace, et al. 1988)，目前已有上百种疾病被证实或怀疑与mtDNA突变有关（Greaves，etal. 2012; Park, etal. 2011)，mtDNA突变导致呼吸链复合体氧化磷酸化缺陷进而引发线粒体功能 缺陷已成为诱发众多疾病的病因（Ylikallio, etal. 2010)。除疾病以外的人类复杂性 状研究中也发现了 mtDNA的遗传效应。如发现运动员的耐受力与mtDNA类型密切相关 (Nogales-Gadea, etal. 2011; Eynon, etal. 2011; Kim, etal. 2012)，人类脂肪沉积存在 显著的mtDNA效应（Yang, etal. 2011)，人类及动物寿命与mtDNA类型密切相关（Moosmann andBehl, 2008; Vendelbo, etal. 2011)等。在人类线粒体疾病的研究中，直接验证mtDNA 突变效应的方法是转线粒体细胞模型。转线粒体细胞模型是将携带正常mtDNA和缺陷 mtDNA的线粒体分别转入无 mtDNA细胞（P°细胞）中，通过细胞融合而形成的细胞质杂交 细胞（cytoplasmic hybrid, cybrid)，从而引入外源性目的mtDNA,通过转线粒体细胞的基 因-表型-功能变化分析，同时比对线粒体疾病特征，验证mtDNA突变效应。在农业动物重 要经济性状的研究方面，目前已在牛、羊、猪、鸡、鸭等畜禽的研究中陆续报道了核外基因效 应。研究表明，mtDNA多态与农业动物重要经济性状(产奶量、日增重、肉质、繁殖、抗病等） 紧密相关。在奶牛mtDNA多态研究中发现，mtDNA D-loop、12SrRNA、16SrRNA以及tRNA存 在广泛的多态性，突变个体与正常个体间存在产奶量、乳脂量和乳脂百分含量等经济性状 的显著差异（Brown et al 1989; Schutz et al. 1994; Boettcher et al. 1996a, 1996b; Ron et al. 1993;赵兴波等· 2000)。肉牛肉质性状研究中也发现mtDNA D-loop单倍型与背最 长肌面积与大理石花纹等屠体性状存在强的关联性（Mannen, rt al. 1998 ;2003)，Biase等 (2007)还发现了 Nelore瘤牛mtDNA 的G/T突变与体重及估计育种值密切相关。在 家禽中，Li等（1998)发现白来航鸡mtDNA ND4基因的T11998C突变与抗马立克病性状存在 紧密关联；Zhang等（2010)研究了北京鸭mtDNA的多态性，发现C0III基因的G9902A突变 与屠体性状有很强的相关性（P〈〇. 05)。在猪的研究中，Wu (1994)发现猪的耳面积大小与 mtDNA D-loop单倍型相关，赵兴波等（1997)发现太湖猪具有独特的mtDNA D-loop单倍型和 ATPase6基因的突变型；Yen等（2007)研究发现猪mtDNA D-loop单倍型与21日龄断奶体重 紧密关联；Ferncindez等（2008)发现猪C0III基因的C9104T突变和cytb基因 A715G突变 与背最长肌的脂肪和蛋白含量紧密相关。尽管从不同研究层面都有mtDNA影响农业动物重 要经济性状的报道，但在农业动物上直接验证线粒体基因效应的研究目前还没有报道。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种鉴定线粒体基因效应的有效方法。本方法通过制备转线粒体 细胞，构建相同细胞核、不同线粒体(含有不同线粒体基因组）的细胞模型。通过比较分析 各类细胞(包括核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞）的生化指标，结合各类细胞的 mtDNA序列分析结果，建立线粒体基因组单倍型-细胞表型的关系，鉴定线粒体基因效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0004] 图1为核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞SDH活性比较。LT/R-6G，XP/ R-6G和LW/R-6G是正常细胞分别用5 Pg/mL罗丹明6G处理8天（rho细胞），胞质杂种细胞 都是由蓝塘猪提供细胞核，+LT，+XP和+LW表示分别由蓝塘猪、香猪和大白猪提供线粒体。 不同字母表示差异显著（P〈〇. 05)，数值表示为平均值土标准差； 图2为核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞ATP含量比较。LT/R-6G，XP/R-6G 和LW/R-6G分别由正常的LT，XP和LW细胞经罗丹明6G处理得来（rho细胞）；LT+表示由 蓝塘猪细胞提供细胞核，+LT，+XP和+LW表示蓝塘猪、香猪和大白猪分别提供线粒体与rho 蓝塘细胞进行细胞融合。不同的小写字母表示差异显著（P〈〇. 05)，数据表示为平均值土标 准差； 图3为核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞R0S活性比较。LT/R-6G，XP/R-6G 和LW/R-6G分别由正常的LT，XP和LW细胞经罗丹明6G处理得来（rho细胞）；LT+表示由 蓝塘猪细胞提供细胞核，+LT，+XP和+LW表示蓝塘猪、香猪和大白猪分别提供线粒体与rho 蓝塘细胞进行细胞融合。不同的小写字母表示差异显著（P〈〇. 05)，数值表示为平均值土 标准差。
[〇〇〇5] 【具体实施方式】 下面结合具体实例对本发明做进一步的详细说明。以下的实施例在以本发明技术方案 为前提下实施，给出了详细的实施方式和过程便于更好地理解本发明，但本发明的保护范 围不限于下述的实施例； 一、 实验材料 蓝塘猪肌肉卫星细胞（LT)、香猪胎儿成纤维细胞（XP)和大白猪胎儿成纤维细胞（LW)。 猪细胞培养在完全培养基中，由DMEM添加10%的胎牛血清、50 μ g/mL尿苷、ImM丙酮酸钠、 100U/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素组成。筛选胞质杂种细胞时，培养基中不加尿苷和丙酮 酸钠，血清换为5%的透析胎牛血清，同时添加筛选抗生素 G418,直到克隆形成并扩大培养。 所有细胞的培养条件为37° C，5%C02/95%02空气； 二、 转线粒体细胞的制备 (1) 蓝塘猪肌肉卫星细胞作为核供体细胞，对此细胞转染pAPl载体使细胞核携带新霉 素抗性和绿色荧光蛋白基因转染试剂使用Lipofectamine 2000 ; (2) 将（1)中得到LT- 细胞使用5 μ g/mL的罗丹明6G (R-6G)处理8d，使之成 为线粒体完全失活的rho细胞。rho细胞在缺乏尿苷和丙酮酸钠的培养基中不能生存，处 理的LT- 细胞可通过营养缺陷实验和詹纳斯绿（Janus Green B)检测线粒体失活效 果； (3) 香猪胎儿成纤维细胞（XP)和大白猪胎儿成纤维细胞（LW)做为线粒体供体细胞，转 染线粒体靶向红色荧光蛋白基因0--°)，获得线粒体为红色荧光蛋白标记的线粒体供体细 胞 ΧΡ-7Ρ/Ρ 和 LW-7P/P ; (4) 将ΧΡ-例0和LW-例0培养在合适的基片上。待基片上的细胞长到80%时，倒放在 50mL离心管中，加入10mL含有10 μ g/mL的细胞松弛素 Β的细胞培养液中继续培养20min， 然后在37° C、12,000g条件下离心40min脱核。脱核的细胞可用吉姆萨（Giemsa)染液检 测脱核效果； (5) 取106的rho细胞分别与106的去核细胞进行融合，细胞融合液用45%的聚乙二醇。 融合后加入lmL的DMEM完全培养基终止融合作用，离心去掉融合液，用完全培养基重悬融 合细胞； (6) 重悬的融合细胞放入培养箱继续培养24h，以后换成选择培养基(添加抗生素 G418,不含尿苷和丙酮酸钠)，这样只有融合细胞能够存活下来，其他细胞逐渐死亡。每隔2 天换液1次，大约21-28d后克隆形成，挑出单克隆继续扩大培养； 三、 转线粒体细胞制备效果的检测 通过DNA测序鉴定各类细胞线粒体高变区（D-loop)异质型，判断转线粒体细胞的制备 效果。具体方法为：如果转线粒体细胞的mtDNA为纯合型，且与线粒体供体细胞mtDNA-致， 则判定为成功的转线粒体细胞，可进行下一步分析；如果mtDNA为异质型，或与线粒体供体 细胞mtDNA不一致，则判定为不成功的转线粒体细胞，需要重新筛选或重新制备转线粒体 细胞； 四、 各类细胞线粒体基因组测序 通过猪线粒体基因组测序，获得蓝塘猪肌肉卫星细胞（LT)、香猪胎儿成纤维细胞（XP) 和大白猪胎儿成纤维细胞（LW)的线粒体基因组序列。通过比较发现，蓝塘猪和香猪的线粒 体基因组序列之间仅有18个差异位点(其中6个氨基酸变异位点)，二者与大白猪差异位点 分别为201 (其中31个氨基酸变异位点）和198个(其中29个氨基酸变异位点)，说明蓝塘 猪和香猪的线粒体基因组序列更为接近，二者与大白猪差异较大； 三、 测定各类细胞(包括核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞）的生化指标(包 括ATP含量、R0S活性、SDH活性)，发现蓝塘猪和香猪胞质杂种细胞的线粒体功能接近，二者 均与大白猪胞质杂种细胞差异较大，大白猪胞质杂种细胞ATP含量和SDH活性均显著低于 蓝塘猪和香猪的胞质杂种细胞（P〈〇. 05)，而R0S含量显著高于蓝塘猪和香猪胞质杂种细胞 (Ρ〈0·05)(附图1、附图2、附图3); 四、 结合各类细胞的mtDNA序列分析结果，蓝塘猪和香猪的线粒体基因组可看做同一 线粒体基因组类型，大白猪为不同的类型。蓝塘猪和香猪的转线粒体细胞与大白猪转线粒 体细胞在SDH活性、ATP含量和R0S活性等指标上均存在显著差异。由于三个转线粒体细 胞具有相同细胞核，即核基因相同，唯一的区别是线粒体不同(含有不同线粒体基因组)，因 此，直接鉴定了猪mtDNA的基因效应。
【权利要求】
1. 一种鉴定线粒体基因效应的方法，其特征在于，通过制备转线粒体细胞，构建相同 细胞核、不同线粒体(含有不同线粒体基因组）的细胞模型，并测定各类细胞(包括核供体细 胞、线粒体供体细胞、转线粒体细胞）的生化指标，结合各类细胞的mtDNA序列分析结果，建 立线粒体基因组单倍型-细胞表型的关系，通过比较分析，鉴定线粒体基因效应。
2. 如权利要求书1所述，制备转线粒体细胞的方法，其特征包括如下具体步骤： (1) 将核供体细胞LT转染新霉素抗性基因(/^〇)和绿色荧光蛋白基因传代、筛 选获得转基因阳性细胞; (2) 使用罗丹明6G(R-6G)处理细胞，传代、筛选获得线粒体失活细胞（rho 细胞）； (3) 将线粒体供体细胞XP和LW转染线粒体靶向红色荧光蛋白基因 0?/P)，获得线粒体 为红色荧光蛋白标记的线粒体供体细胞LW-7?/W ; (4) 使用细胞松弛素 B分别处理线粒体供体细胞ΧΡ-ΤΡ/Ρ和LW-7P/P，离心去核，获得 ΧΡ-ΤΡ/Ρ 和 LW-TtM0 胞质体； (5) 通过聚乙二醇处理，将核供体细胞分别与ΧΡ-ΤΡ/Ρ和LW-7P/P胞质体进 行融合； (6) 将上述得到的胞质杂种细胞在适当的条件下培养一段时间后，进行抗生素 G418和 荧光标记筛选，分别获得转线粒体的单克隆细胞。
3. 转线粒体细胞制备效果的检测方法；通过DNA测序鉴定各类细胞线粒体高变区 (D-loop)异质型，判断转线粒体细胞的制备效果；具体方法为：如果转线粒体细胞的mtDNA 为纯合型，且与线粒体供体细胞mtDNA-致，则判定为成功的转线粒体细胞，可进行下一步 分析；如果mtDNA为异质型，或与线粒体供体细胞mtDNA不一致，则判定为不成功的转线粒 体细胞，需要重新筛选或重新制备转线粒体细胞。
4. 如权利要求书1所述，测定各类细胞(包括核供体细胞、线粒体供体细胞、转线粒体 细胞）的生化指标(包括ATP含量、R0S活性、SDH活性)，结合各类细胞的mtDNA序列分析结 果，建立线粒体基因组单倍型-细胞表型的关系，通过比较分析，验证线粒体基因效应；其 特征为：当相同细胞核、不同线粒体(含有不同线粒体基因组）细胞的某项生化指标存在显 著差异时，则该线粒体单倍型对该项细胞表型存在基因效应，反之则不存在基因效应。
【文档编号】C12Q1/68GK104059986SQ201410316457
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月5日 优先权日:2014年7月5日
【发明者】赵兴波, 于光辉, 尹涛 申请人:赵兴波