一种cho细胞无血清培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足CH0细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。
【专利说明】一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]传统的含血清培养基中的血清给科研和生产等带来多种不利因素。血清的主要作用在于给细胞提供生长增值所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，但其存在很多缺点:批间差异较大、需要大量验证工作、使用不方便、成分不明确、有抑制生长的成分、尤其不利于疫苗和单克隆抗体等目的产物的分离纯化、容易被病毒和支原体感染；血清昂贵可能发生供应紧张，血清的来源不稳定等问题。
[0003]近年来，国内开始针对CHO细胞无血清培养开发了许多无血清培养基产品，但是大多数均为了保证细胞的活性，在已有DMEM，DMEM/F12，MDM等基础培养基的基础上添加了不同来源的蛋白质等添加剂，由于成分复杂，蛋白质及其水解产物会在细胞培养过程中带来污染，影响下游分离纯化，目的产物表达量降低。
[0004]国外商品化的CHO细胞无血清培养基存在如下现状:大多以液体的形式提供，不适合大规模生产、价格昂贵、培养基成分配方不确定，Sigma、In-vitrogen、Hyclone和Lonza等国际知名培养基，每升价格高达上千元，在一定程度上限制了它的实际应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种CHO细胞无血清培养基及其制备方法，通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，既能满足CHO细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。
[0006]本发明的技术方案为:
[0007]一种CHO细胞无血清培养基，其中，包括下列重量份的组分:
[0008]氨基酸组合物1300-2000 ；
[0009]维生素组合物12-25 ；
[0010]无机盐组合物10-15 ；
[0011]微量元素组合物0.005-0.006;
[0012]无菌水900-1100。
[0013]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0014]丙氨酸7.35-31.5、精氨酸152.13-211.5、天冬酰胺40.26-250.48、半胱氨酸38.26-45.12、谷氨酸 8.14-32.51、甘氨酸 8.14-30.45、组氨酸 30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25、亮氨酸 58.94-167.23、赖氨酸 91.25-193.26、甲硫氨酸 15.26-61.42、苯丙氨酸 34.12-83.56、脯氨酸 17.34-35.41、丝氨酸 27.31-95.15、苏氨酸 54.16-97.24、色氨酸8.27-52.41、酪氨酸 57.21-145.13、缬氨酸 53.25-118.31 和谷氨酰胺 583.41-1248.93 ；
[0015]其中所述氨基酸均为L-氨基酸。
[0016]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0017]维生素B6 0.01-0.2、维生素 B12 0.02-0.42、维生素 C9-10、维生素 E0.30-0.31、生物素 0.4-1.21、氯化胆碱 0.064-0.072,D-泛酸钙 0.004-0.005、叶酸 0.062-0.081、肌醇0.83-1.43、烟酰胺0.17-0.20、吡哆醇盐酸盐0.0015-0.0017、核黄素0.06-0.29、腐胺二酸盐 0.00501-0.00503、氢化可的松 0.0015-0.0018 和吡哆醛.HCL1.01-9.48。
[0018]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0019]碳酸氢钠2440-2451、氯化钠 6995.50-7031.20、氯化钾 312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌 0.431-0.445、氯化钙 116.60-117.32、五水硫酸铜 0.0014-0.0016 和七水硫酸铁0.062-0.071。
[0020]优选的是,所述的CHO细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0021]硝酸银0.0001-0.0005、硫酸锰 0.00008-0.0008、硅酸钠 0.003-0.012、钥酸铵 0.0019-0.018、钒酸铵 0.00007-0.0007、氯化镍 0.00003-0.00031,氯化锡 0.00002-0.00023、亚硒酸钠 0.00005-0.0005、六水氯化铝 0.00001-0.0001、硫酸钡 0.00001-0.0001、氯化铝 0.00001-0.0001、硫代甘油 0.00001-0.0001、四水氯化钛0.00001-0.0001 和八水氯化氧锆 0.00001-0.0001。
[0022]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述培养基还包括1000-8000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成:
[0023]葡萄糖1000-7300 ；
[0024]生物碱类物质组合物17-50 ；
[0025]大分子糖类物质组合物1-21 ；
[0026]激素类物质组合物0.084-0.49 ；
[0027]脂肪酸类物质组合物0.14-1.16。
[0028]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:腺嘌呤2.43-9.89、次黄嘌呤2.13-8.56、鸟嘌呤3.85-8.16、尿嘌呤4.37-10.00、胸腺嘌呤0.21-2.37、胞嘧啶
4.85-10.00、乙醇胺 1.24-12.34 和腐胺 0.080-0.832。
[0029]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，
[0030]所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:核糖0.92-9.57和脱氧核糖0.10-10.32 ；
[0031]所述补充因子组合物中的脂肪酸类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:硫辛酸0.10-1.10和亚油酸0.042-0.053 ；
[0032]此外所述补充因子组合物中还包括0.32-2.12重量份的B-硫基乙醇。
[0033]优选的是，所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:丙酮酸钠220.00-230.00、氢化可的松
0.037-0.39、地塞米松 0.039-0.0393、孕酮 0.006-0.032 和雌二醇 0.0028-0.028。
[0034]一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其中，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤:
[0035]步骤一、按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分并混合；
[0036]步骤二、研磨；
[0037]步骤三、高温灭菌；
[0038]步骤四、无菌分装。
[0039]本发明具有以下有益效果:通过加入化学成分明确的多种氨基酸、维生素、无机盐、微量元素及生物碱、脂肪酸及激素等补充因子，使该培养基能使CHO细胞在悬浮培养条件下无需适应即可快速生长，通过对比试验检验，细胞密度和细胞活性都可以与有血清培养基相当，并优于国外商品化的CHO细胞无血清培养基，本发明既能满足CHO细胞培养需求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素，降低生产成本，可完全取代有血清培养基进行CHO细胞的大规模培养和生产。另外，通过采用粉末状保存的方式，可以有效规避产品运输风险，降低运输成本，满足对CHO细胞进行规模化培养生产的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1为所述的CHO细胞无血清培养基制备工艺流程图；
[0041]图2为CHO细胞在本发明所述的CHO细胞无血清培养基和Gibco公司的⑶-CHO培养基中生长曲线图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
[0043]如图1所示，一种CHO细胞无血清培养基，由下列重量份组分制备而成:
[0044]氨基酸组合物1300-2000 ；
[0045]维生素组合物12-25 ；
[0046]无机盐组合物10-15 ;
[0047]微量元素组合物0.005-0.006 ；
[0048]无菌水900-1100。
[0049]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0050]丙氨酸7.35-31.5、精氨酸152.13-211.5、天冬酰胺40.26-250.48、半胱氨酸38.26-45.12、谷氨酸 8.14-32.51、甘氨酸 8.14-30.45、组氨酸 30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25、亮氨酸 58.94-167.23、赖氨酸 91.25-193.26、甲硫氨酸 15.26-61.42、苯丙氨酸 34.12-83.56、脯氨酸 17.34-35.41、丝氨酸 27.31-95.15、苏氨酸 54.16-97.24、色氨酸
8.27-52.41、酪氨酸 57.21-145.13、缬氨酸 53.25-118.31 和谷氨酰胺 583.41-1248.93 ；
[0051]其中所述氨基酸均为L-氨基酸。
[0052]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0053]维生素B6 0.01-0.2、维生素 B12 0.02-0.42、维生素 C9-10、维生素 Ε(λ 30-0.31、生物素 0.4-1.21、氯化胆碱 0.064-0.072,D-泛酸钙 0.004-0.005、叶酸 0.062-0.081、肌醇
0.83-1.43、烟酰胺0.17-0.20、吡哆醇盐酸盐0.0015-0.0017、核黄素0.06-0.29、腐胺二酸盐 0.00501-0.00503、氢化可的松 0.0015-0.0018 和吡哆醛.HCL1.01-9.48。
[0054]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0055]碳酸氢钠2440-2451、氯化钠 6995.50-7031.20、氯化钾 312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌 0.431-0.445、氯化钙 116.60-117.32、五水硫酸铜 0.0014-0.0016 和七水硫酸铁0.062-0.071。
[0056]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:
[0057]硝酸银0.0001-0.0005、硫酸锰 0.00008-0.0008、硅酸钠 0.003-0.012、钥酸铵 0.0019-0.018、钒酸铵 0.00007-0.0007、氯化镍 0.00003-0.00031,氯化锡 0.00002-0.00023、亚硒酸钠 0.00005-0.0005、六水氯化铝 0.00001-0.0001、硫酸钡 0.00001-0.0001、氯化铝 0.00001-0.0001、硫代甘油 0.00001-0.0001、四水氯化钛
0.00001-0.0001 和八水氯化氧锆 0.00001-0.0001。
[0058]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述培养基还包括1000-8000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成:
[0059]葡萄糖1000-7300 ；
[0060]生物碱类物质组合物17-50 ；
[0061]大分子糖类物质组合物1-21 ；
[0062]激素类物质组合物0.084-0.49 ；
[0063]脂肪酸类物质组合物0.14-1.16。
[0064]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:腺嘌呤2.43-9.89、次黄嘌呤2.13-8.56、鸟嘌呤3.85-8.16、尿嘌呤4.37-10.00、胸腺嘌呤0.21-2.37、胞嘧啶4.85-10.00、乙醇胺
1.24-12.34 和腐胺 0.080-0.832。
[0065]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:核糖0.92-9.57和脱氧核糖0.10-10.32 ；所述补充因子组合物中的脂肪酸类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:硫辛酸
0.10-1.10和亚油酸0.042-0.053 ;此外所述补充因子组合物中还包括0.32-2.12重量份的B-硫基乙醇。
[0066]所述的CHO细胞无血清培养基中，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:丙酮酸钠220.00-230.00、氢化可的松0.037-0.39、地塞米松 0.039-0.0393、孕酮 0.006-0.032 和雌二醇 0.0028-0.028。
[0067]按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分，与95_105ml无菌水混合溶解，调节pH值为7.0-8.0后定容至1000ml，用孔径为0.3-0.5 μ m的微孔滤膜过滤除菌即可。
[0068]一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其中，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤:
[0069]步骤一、按配方量称取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分并混合均匀；
[0070]步骤二、进行充分的研磨，研磨至100-200目筛；
[0071]步骤三、高温灭菌，本发明采用高压蒸汽湿热灭菌方法，灭菌温度126-132?，蒸汽压力 0.044-0.049MPa，灭菌时间 3_7min。
[0072]步骤四、无菌分装，采用无菌操作进行一定剂量的分装并密封。
[0073]使用时仅需按照配方量将粉末状的CHO细胞无血清培养基溶解于无热源无菌水即可制备而成。
[0074]所述CHO细胞全称为中国仓鼠卵巢细胞，所述CHO细胞无血清培养基是在参考现有的文献基础上经过大量实验验证而设计出的培养基配方，通过选择适当的微量元素和氨基酸代替血清蛋白成分，应用Plackett-Burman实验设计,对培养基添加成分进行了评价，采用响应面分析法优化各个组分的最佳使用剂量得到所述的CHO细胞无血清培养基，其中所述的主要成分的作用分别为:
[0075](I)氨基酸为蛋白合成的前体和合成其他生物大分子的中间体，是细胞提供的必要营养成分；
[0076](2)维生素是细胞组成成分，细胞的代谢活动，离开维生素都无法进行，因此它是必须的；
[0077](3)无机盐起到调节渗透压的作用；
[0078](4)微量元素主要起调节、传递和控制的作用。
[0079]本发明可用于CHO细胞传代培养和高密度连续灌注悬浮培养，具有以下优点:
[0080](I)无任何含血清添加物，化学成分确定，便于配置、储存；
[0081](2)无需适应即可支持CHO细胞生长、维持活力时间长，在产物表达方面与血清培养基接近或相当；
[0082](3)支持细胞长期传代培养；
[0083](4)所有化学结构已知，有利于产物的分离纯化，提高产品的品质；
[0084](5)成分均为小分子物质，成本低，适合大规模工业化生产。
[0085]实施例1
[0086]按照下列配方称取个组分，本发明所有原料采购Sigma细胞培养级的原料，并按照相关要求储存。
[0087]L-氨基酸的组分和用量:
[0088]
【权利要求】
1.一种CHO细胞无血清培养基，其特征在于，包括下列重量份的组分: 氨基酸组合物1300-2000 ； 维生素组合物12-25 ； 无机盐组合物10-15 ; 微量元素组合物0.005-0.006 ； 无菌水 900-1100。
2.如权利要求1所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种: 丙氨酸7.35-31.5、精氨酸152.13-211.5、天冬酰胺40.26-250.48、半胱氨酸38.26-45.12、谷氨酸 8.14-32.51、甘氨酸 8.14-30.45、组氨酸 30.48-105.98、异亮氨酸53.41-131.25 、亮氨酸 58.94-167.23、赖氨酸 91.25-193.26、甲硫氨酸 15.26-61.42、苯丙氨酸 34.12-83.56、脯氨酸 17.34-35.41、丝氨酸 27.31-95.15、苏氨酸 54.16-97.24、色氨酸8.27-52.41、酪氨酸 57.21-145.13、缬氨酸 53.25-118.31 和谷氨酰胺 583.41-1248.93 ； 其中所述氨基酸均为L-氨基酸。
3.如权利要求2所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述维生素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种: 维生素 B6 0.01-0.2、维生素 B12 0.02-0.42、维生素 C9-10、维生素 E0.30-0.31、生物素 0.4-1.21、氯化胆碱 0.064-0.072、D-泛酸钙 0.004-0.005、叶酸 0.062-0.081、肌醇0.83-1.43、烟酰胺0.17-0.20、吡哆醇盐酸盐0.0015-0.0017、核黄素0.06-0.29、腐胺二酸盐 0.00501-0.00503、氢化可的松 0.0015-0.0018 和吡哆醛.HCL1.01-9.48。
4.如权利要求3所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述无机盐组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种: 碳酸氢钠 2440-2451、氯化钠 6995.50-7031.20、氯化钾 312.81-313.90、氯化镁29.65-30.42、硫酸镁48.85-49.21、一水磷酸二氢钠62.51-62.53、磷酸氢二钠71.03-72.15、硫酸锌 0.431-0.445、氯化钙 116.60-117.32、五水硫酸铜 0.0014-0.0016 和七水硫酸铁0.062-0.071。
5.如权利要求4所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述微量元素组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种: 硝酸银 0.0001-0.0005、硫酸锰 0.00008-0.0008、硅酸钠 0.003-0.012、钥酸铵 0.0019-0.018、钒酸铵 0.00007-0.0007、氯化镍 0.00003-0.00031、氯化锡0.00002-0.00023、亚硒酸钠 0.00005-0.0005、六水氯化铝 0.00001-0.0001、硫酸钡 0.00001-0.0001、氯化铝 0.00001-0.0001、硫代甘油 0.00001-0.0001、四水氯化钛0.00001-0.0001 和八水氯化氧锆 0.00001-0.0001。
6.如权利要求5所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述培养基还包括1000-8000重量份的补充因子组合物，所述补充因子组合物由下列重量份的组分组成: 葡萄糖 1000-7300 ； 生物碱类物质组合物17-50 ； 大分子糖类物质组合物1-21; 激素类物质组合物0.084-0.49 ；脂肪酸类物质组合物0.14-1.16。
7.如权利要求6所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充因子组合物中的生物碱类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:腺嘌呤2.43-9.89、次黄嘌呤2.13-8.56、鸟嘌呤3.85-8.16、尿嘌呤4.37-10.00、胸腺嘌呤0.21-2.37、胞嘧啶4.85-10.00、乙醇胺 1.24-12.34 和腐胺 0.080-0.832。
8.如权利要求7所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于， 所述补充因子组合物中的大分子糖类物质组合物包括下列重量份的组分中的一种或几种:核糖0.92-9.57和脱氧核糖0.10-10.32 ； 所述补充因子组合物中的脂肪酸类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:硫辛酸 0.10-1.10 和亚油酸 0.042-0.053 ； 此外所述补充因子组合物中还包括0.32-2.12重量份的B-硫基乙醇。
9.如权利要求8所述的CHO细胞无血清培养基，其特征在于，所述补充因子组合物中的激素类物质包括下列重量份的组分中的一种或几种:丙酮酸钠220.00-230.00、氢化可的松 0.037-0.39、地塞米松 0.039-0.0393、孕酮 0.006-0.032 和雌二醇 0.0028-0.028。
10.一种CHO细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述CHO细胞无血清培养基也可制为粉末状培养基，包括以下步骤: 步骤一、按配方量称 取所述CHO细胞无血清培养基中的各组分并混合； 步骤二、研磨； 步骤三、高温灭菌； 步骤四、无菌分装。
【文档编号】C12N5/071GK104073464SQ201410321893
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】张春颖 申请人:西藏天虹科技股份有限责任公司