一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于特基拉芽孢杆菌(Bacillus?terquilensis)的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第20位，117位和165位的赖氨酸通过重叠延伸PCR的方法突变为丝氨酸，分别获得单突变体K20S，K117S和K165S。将三个突变位点进行整合突变，获得K20S/K117S/K165S三突变酶。四株突变酶表现出了更高的催化活力及更好的热稳定性。这些突变酶和野生酶相比更有利于其在工业上的应用。
【专利说明】—种1, 3-1, 4- β -葡聚糖酶突变体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高催化活性和热稳定性的1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002]β -葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、小麦、大米等经济类谷物中含量很高。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1，3或β-1，4糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量β_葡聚糖，未降解的β -葡聚糖存在于麦汁中会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。而在生产纯生啤酒时，过多β-葡聚糖酶会造成滤膜的膜孔堵塞，过滤能力下降。在饲料行业中，麦类饲料中的葡聚糖无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能被直接消化吸收，必须经过酶促降解后才能被利用，且其阻止了有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分转化率，是一种抗营养因子，并为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养造成大量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。
[0003]来源于特基拉芽孢杆菌(Bacillusterquilensis)CGX5-1 的 1，3-1，4_β -葡聚糖酶，简称葡聚糖酶。1，3-1，4-β-葡聚糖酶是一类可以在3-0-吡喃葡萄糖位点专一性切割β_葡聚糖为三糖和四糖，这是其工业应用的基础。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从48°C提高至78°C，而饲料行业中烘焙的温度也在65°C以上。而目前筛选得到的大部分野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的最适温度主要集中在45°C和55°C，并不能满足工业上的需求。而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β -葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β -葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β -葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够提高野生型1，3-1，4- β -葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β_葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。
[0004]为了提高1，3-1，4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经进行了一些研究。目前研究发现，I, 3-1，4-β -葡聚糖酶中唯一存在的一对二硫键对于蛋白质热稳定性影响不大。而Glnl、Thr2、Ser5和Phe7的突变大幅度地提高了 β -葡聚糖酶的热稳定性。对β _葡聚糖酶的杂交结果显示，将来源于浸麻芽孢杆菌(B.macerans)的前16个氨基酸替换为淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16-M)和两者之间前12个氨基酸进行替换，或删除Tyrl3形成的杂交酶H(A12-M)-Λ 13在高温下有很好的稳定性。
[0005]本发明所使用的来源于特基拉芽孢杆菌(B.terquilensis) CGX5-1的野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的最适温度为45°C，比活力为2490.lU/mg，并不能适应工业应用的要求。因此，进一步提高该酶的催化活力及热稳定性对其在工业上的应用推广有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高催化活性和热稳定性的1，3-1，4-β -葡聚糖酶突变体。
[0007]所述突变体的氨基酸序列如以下⑴或⑵或(3)或⑷或(5)所示:
[0008](I)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，
[0009](2) SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，
[0010](3) SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，
[0011](4) SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，
[0012](5)在(I)或(2)或(3)或(4)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或者添加，且具有1，3-1，4-β -葡聚糖酶活性的氨基酸序列。
[0013]编码上述突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
[0014]氨基酸序列如SEQ ID N0.1的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的第20位的赖氨酸Lys突变成丝氨酸Ser。所得突变体命名为K20S。
[0015]氨基酸序列如SEQ ID N0.2的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4-β -葡聚糖酶的第117位的赖氨酸Lys突变成丝氨酸Ser。所得突变体命名为K117S。
[0016]氨基酸序列如SEQ ID N0.3的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4-β -葡聚糖酶的第165位的赖氨酸Lys突变成丝氨酸Ser。所得突变体命名为K165S。
[0017]氨基酸序列如SEQ ID N0.4的突变体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的第20、117、165位的赖氨酸Lys均突变成丝氨酸Ser。所得突变体命名为 K20S/K117S/K165S。
[0018]本发明的另一个目的是提供一种构建所述1，3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的方法，是将来源于B.terquilensis CGX5-1的野生酶基因(SEQ ID N0.9)为模板，采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得；得到编码β -葡聚糖酶突变体的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示。经过测序鉴定所有突变位点均已成功按照预设目标得到突变，随后将编码突变酶的基因片段进行重组表达获得突变体。
[0019]所述重组表达优选以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
[0020]对于三株葡聚糖酶单突变酶K20S、K117S和K165S的构建方法，优选以野生酶基因为模板，分别将20位、117位和165位的赖氨酸Lys通过重叠延伸PCR的方法突变为丝氨酸Ser。
[0021]对于三突变酶K20S/K117S/K165S的构建方法，优选以K20S单突变酶为模板，通过重叠延伸PCR的方法经过两步分别将117位和165位赖氨酸Lys突变为丝氨酸Ser。
[0022]本发明要解决的第三个技术问题是提供发酵生产所述1，3-1，4-β -葡聚糖酶突变体的方法，优选以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。以TB液体培养基为发酵培养基，重组菌在37°C 200rpm培养至OD6tltl约为1.0，加入0.06mM终浓度IPTG和和8mM终浓度α-乳糖诱导表达，并在24°C 150rpm下培养6h。将所得菌液离心后弃菌体收集上清。上清经过N1-NTA亲和层析柱纯化以及GEro-1O柱脱去咪唑，得到1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体。
[0023]所述重组菌的活化方法优选在平板上挑取单菌落于含100 μ g/mL硫酸卡纳霉素的LB液体培养基，370C 200rpm培养10_12h。
[0024]本发明的有益效果:本发明提供的四株β_葡聚糖酶突变体和野生酶相比，比活力提高了 98.2%;最适温度由45°C提高到55-60°C;T5Q值由62°C升高至76°C左右；在50°C下的半衰期由95min最高延长至214min，远远高于野生酶，提高了 125.3% ;在60°C下的半衰期，由32.5min最多延长至59min，提高了 81.5%。可见突变酶的催化活性和热稳定性均有所大幅度的提闻，更有利于在工业上的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1野生酶与四株葡聚糖酶突变体的最适温度比较；□:野生酶，〇:K20S，Δ:K117S,V:K165S,O:K20S/K117S/K165S。
[0026]图2野生酶与四株葡聚糖酶突变体的T5tl值比较；□:野生酶，〇:K20S,A:K117S, V:K165S,O:K20S/K117S/K165S。
[0027]图3野生酶与四株β -葡聚糖酶突变体的在50°C的半衰期比较；□:野生酶，O:K20S,A:K117S, V:K165S, O:K20S/K117S/K165S。
[0028]图4野生鱼四株葡聚糖酶突变体的在60°C的半衰期比较；□:野生酶，〇:K20S,A:K117S, V:K165S, O:K20S/K117S/K165S。
【具体实施方式】
[0029]实施例1突变位点的选择
[0030]将β-葡聚糖酶的推定氨基酸序列提交至1-TASSER在线服务器进行同源建模，并将建模得到的PDB文件输入Voronoia软件中计算赖氨酸在结构中的位置。从表1可以看出，在β -葡聚糖酶三维结构中，所有12个赖氨酸的平均包装值处于0.47至0.62之间，均处于蛋白质表面，且具有最高的溶液可及性。这意味着位于蛋白表面的赖氨酸可能对于β-葡聚糖酶热稳定性有影响。
[0031]表1 β -葡聚糖酶中12个赖氨酸的平均包装密度值
[0032]
【权利要求】
1.一种1，3-1，4-β-葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如以下(I)或⑵或(3)或⑷或(5)所示: (1)SEQID N0.1所示的氨基酸序列， (2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列， (3)SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列， (4)SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列， (5)在(I)或(2)或(3)或(4)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或者添加，且具有1，3-1，4-β -葡聚糖酶活性的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或重组细胞。
4.一种获得权利要求1所述1，3-1，4- β -葡聚糖酶突变体的方法，其特征在于，是以野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的基因为模板，采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因片段进行重组表达获得突变体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对于氨基酸序列分别如SEQID N0.USEQID N0.2,SEQ ID N0.3所示的β -葡聚糖酶单突变体K20S、K117S和K165S的构建，以野生酶基因为模板，分别将第20位、117位和165位的赖氨酸通过重叠延伸PCR突变为丝氨酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对于氨基酸序列如SEQID N0.4所示的三突变体K20S/K117S/K165S的构建，先后将第20位、117位和165位的赖氨酸通过重叠延伸PCR突变为丝氨酸。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法,其特征在于，以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以TB液体培养基为发酵培养基，重组菌在37°C培养至OD_ = 0.8-1.0，加入IPTG和α -乳糖诱导表达，将所得菌液离心后弃菌体，收集含有1，3-1，4-β -葡聚糖酶突变体的上清。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，上清经过N1-NTA亲和层析柱纯化以及GEPD-10柱脱去咪唑， 得到1，3-1，4- β -葡聚糖酶突变体。
10.权利要求1所述突变体在啤酒生产中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104130988SQ201410351568
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】朱林江, 钮成拓, 李崎, 李永仙, 王金晶, 刘春凤, 郑飞云 申请人:江南大学