一种小麦粒重分子标记及其在育种中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】可应用于小麦育种领域，具体提供了一种小麦粒重分子标记，该标记位于小麦6A染色体RFL_CONTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之间；通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232，以加快小麦高产品种的选育进程，由于采用了专用的粒重分子标记不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。
【专利说明】一种小麦粒重分子标记及其在育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及涉及基因工程【技术领域】，可应用于小麦育种领域，具体提供了一种小 麦粒重分子标记。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国50-60%人口的主要口粮，目前，我国人均耕地只有0.093公顷，随着 生产粮食的土地和淡水资源的减少，粮食供应安全问题日益凸显，提高千粒重是培育高产 小麦的重要途径之一，田纪春等研究表明在穗数和穗粒数相对固定的前提下，千粒重每增 加1克，每公顷产量可增加157 kg。
[0003] 粒重由主基因和微效基因共同控制，基因数目多且效应较低，易受环境影响。在传 统育种中需要大规模的田间选择，工作量大，效率低难以满足现在的需要。而分子标记辅助 选择不受环境影响，可以进行程序化早代选择和预测，可显著提高目标性状选择的准确性， 对加快提高小麦单产及保障我国粮食安全具有重要的现实意义和理论价值。目前，在水稻 中已鉴定并克隆了 GS3、qSW5、GW2和GS5等与粒重有关的基因/QTL，在分子标记辅助选择 中发挥了作用。但是小麦是异源六倍体，与粒重有关的基因鉴定较少，缺乏分子标记辅助选 择的有效标记。
[0004] 目前小麦粒重分子标记辅助选择瓶颈效应主要表现在：
[0005] ①绝大多数QTLs不是功能性标记：从理论上讲，实效性分子标记经验证优化后可 用于所有育种材料的检测。它的发掘是以被克隆的基因序列为前提，并需建立位点/标记 与性状的关系。按照这一标准，多数发表的QTLs位点都没有经过育种过程或品种进行有效 性验证。
[0006] ②QTLs实用性差：单一遗传群体定位的基因位点，准确度差，而且由于置信区间 大，QTLs过多或存在假阳性QTLs，降低了分子辅助选择的实际效率，甚至没法有效应用到 小麦育种中。
[0007] 因此需要提供一种针对于小麦粒重的实用性分子标记以利于小麦的育种。
【发明内容】
[0008] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种小 麦粒重分子标记，该标记位于小麦6A染色体RFL_C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之间；通 过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232,以加 快小麦高产品种的选育进程，由于采用了专用的粒重分子标记不仅筛选快速精准，不受环 境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率 和质量。
[0009] 发明人提供的具体技术方案如下：
[0010] 一种小麦粒重分子标记，该标记位于小麦6A染色体RFL_C0NTIG4632_1512和 TaGW2-CAPS之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述，长度为303bp。 toon] 通过该分子标记的应用，可以检测小麦品种或品系中是否具有增加千粒重效应基 因位点QGW6A-232,具体方法如下：
[0012] 利用特异性引物扩增目标植株的叶片DNA，获得668bp片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，之后利用Haelll专一酶酶切后凝胶电泳检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的片段；
[0013] 具体判定标准是：不具有增大千粒重基因的品种或品系（低粒重）中出现303bp 的电泳带。而具有增大千粒重基因的品种或品系中该片段被切碎，该片段缺失。
[0014] 为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其
[0015] 正向引物序列：5/-CCTTCCATATGTTTTTTAATGAGCCGCC-3/(如SEQIDNO: 3所示）
[0016] 反向引物序列：5' -GCTTCTTTTCCAACTCAATAMTGAGCC-3'(如SEQ ID N0:4所示）
[0017] 通过特异性引物的扩增，以及对产物的酶切结果进行判定，主要原因在于：通过这 种方法可以判定该位点是否含有大粒增效基因位点，虽然小麦粒重受多个基因位点控制， 但是由于本发明所判定的位点为主效基因位点，其对于小麦的增重有着十分重要的增效效 果，故而即可获知待测小麦品种是否具有粒重增效效果的相关基因；为粒重基因聚合、进而 增加产量提供分子基础，从而可以更好的育种并应用于品种改良中去。
[0018] 综上所述，本发明的发明人首次提供了一种小麦粒重分子标记，该标记位于小麦 6A染色体RFL_C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之间；通过该分子标记的应用，可以检测小 麦品种或品系中是否具有增加千粒重的QGW6A-232,以加快小麦高产品种的选育进程，由于 采用了专用的粒重分子标记不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了 生广成本，大大提商了商广小麦品种或品系的选择效率和质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为利用本发明所述的分子标记和判定方法对大粒体系和小粒体系的酶切验 证结果电泳图，通过图中可知，小粒体系经过酶切后出现了 303bp的电泳带，而大粒体系中 则没有出现；
[0020] 图中A为大粒品系和亲本01-35 ;B为小粒品系和亲本9411。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0022] 实施例1小麦的叶片DNA提取
[0023] (1)取约0· 3-0. 5 g叶片入5mL离心管，液氮速冻后研成粉末；
[0024] (2)加入约1600 μ L已预热至65°C的缓冲液S，多次倒置混勻，水浴0. 5-lh，其间 轻摇几次以充分混匀；
[0025] (3)降温至室温，等待10分钟，加10-15 μ L RNA酶（10mg/mL) 37°C水浴30钟，其 间轻摇几次以充分混匀，约1次/10 min ;
[0026] (4)取出离心管，加入等体积1600yL，4°C苯酚（Tris-平衡酚）：氯仿：异戊醇 (25 :24 :1(体积比）抽提，轻轻混匀10 min，4°C冰箱静置5 min，然后8000 rpm离心10 min ；
[0027] (5)取上清液于另一管，约1300 μ L，加入等体积冷氯仿（4°C冰箱放置），轻摇10 min 混勻，8000 rpm 离心 10 min ;
[0028] (6)取上清液于另一管，加100 μ L 3M NaAC(醋酸钠），加入1000 μ L的冷异丙醇 (或2倍体积的冷乙醇），充分混匀后于-20°C冰箱静置20 min ;
[0029] (7)用枪头挑出絮状的DNA，用70%乙醇清洗2-3次，稍离心5分钟，去掉乙醇，气 干后（无乙醇气味即可），溶于200yL 1XTE，轻轻混匀，-20°C储存；
[0030] (8)用微量可见/紫外分光光度计NanoDrop2000,测定DNA浓度，稀释DNA浓度为 200ng/ μ L做为工作液。
[0031] 附录：溶液配制：
[0032] (1)3 M NaAc(pH 5. 2)
[0033] 600 mL H20中加408. 24 g NaAc-3H20,（或者246. 24g无水醋酸钠）溶解后用冰 醋酸（冰乙酸）调pH值至5. 2,定容至1 L，灭菌，备用。
[0034] (2) 1 X TE (pH 8. 0)
[0035] 800 mL H20 中加 1.211 g Tris、0.3723 g Na2EDTA-2H20,用 HCL 调 pH值至 8.0,定 容至1 L，灭菌，备用。
[0036] (3) RNA酶：（若商业化配置好的lmL处理好的分装RNA酶，可以直接使用。）
[0037] 将固体RNA酶溶于0· 01 M NaAc，使酶浓度为10 mg/mL，加热至100°C处理15 - 20 1^11，慢慢冷却至室温，然后加入0.1倍体积111^8-!〇^(?!17.4)，分装后于-201：冰箱 保存。
[0038] (4)缓冲液 S
[0039] 按照如下配方配制后，定容至1 L。
[0040]
【权利要求】
1. 一种小麦粒重分子标记，其特征在于：该标记位于小麦6A染色体RFL_ C0NTIG4632_1512和TaGW2-CAPS之间；其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述。
2. 权利要求1所述分子标记在育种中的应用，其特征在于：利用其判定植株是否含有 增加千粒重效应基因位点QGW6A-232,具体步骤为： 利用特异性引物扩增目标植株的的叶片DNA，获得668bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用Haelll专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 述的片段； 判定标准为：不具有增大千粒重基因的品种或品系中出现如SEQ ID N0:1所述的 303bp的电泳带；具有增大千粒重基因的品种或品系中该片段被切碎，该片段缺失。
3. 根据权利要求2所述的小麦粒重分子标记，其特征在于：其特异性引物， 正向引物序列-CCTTCCATATGTTTTTTAATGAGCCGCC-3'，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:3所示； 反向引物序列：5 ^ -GCTTCTTTTCCAACTCAATAAATGAGCC-3 ^ 其核苷酸序列如 SEQ ID NO :4所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104087586SQ201410356641
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】田纪春, 李青芳, 陈建省, 张莹, 邓志英, 陈广凤, 孙彩铃 申请人:山东农业大学