一种高产没食子酸脱羧酶(gad)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法：从9种微生物中，通过底物诱导筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(Enterobacer?aerogenes)菌株；经过考察发酵时间、接种量、发酵温度、底物浓度、初始发酵液pH值等单因子以及3因素3水平的响应面分析和模型修正，确定该降解菌株的最佳发酵条件，并进行验证；再通过溶剂萃取和中压柱分离，得到质量分数98％以上的焦性没食子酸，为微生物法降解没食子酸生产焦性没食子酸的工业化生产提供一定的实践基础。
【专利说明】一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及微生物降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法。
二、【背景技术】
[0002]五倍子富含没食子单宁，由没食子酸与不同构型的葡萄糖结合的混合物，以五倍酰葡萄糖为核心，在C2、C3、C4位以缩酚键连接不同数目的倍酰基结构。没食子单宁通过化学法水解或生物法在单宁酶(tannase)的作用下发生降解生成没食子酸；没食子酸再经过化学法脱羧或在没食子酸脱羧酶(gallic acid decarboxylases, GAD)的作用下发生脱羧反应生成焦性没食子酸(如图1所示)。焦性没食子酸(1，2，3-三羟基苯)作为一种多元酚，在工业上具有广泛的用途。在摄影行业中，焦性没食子酸可以作为显影剂使胶片成像；在燃料工业上，焦性没食子酸与二羟代苯砜缩合产物是染制皮毛、皮革的优良染料；在医药工业中，焦性没食子酸可作为辅酶-QlO的抗氧化稳定剂，是重要的医药中间体；分析化学中，在重量分析上用以测定铋及锑，并用作磷钨酸的还原剂，红外线照相术的热敏剂，也是煤气、烟道气、炼焦煤气、水煤气等气体的除氧剂。
[0003]
[0004]
[0005]目前工业上主要通过化学法，将没食子酸在在6N HCl的作用下催化脱羧生产焦性没食子酸，但由于产生大量高浓度盐和高色度的废酸水，造成严重的环境污染问题和设备腐蚀等问题，急需开发环境友好和反应温和的微生物制备新工艺，关键在于产高活性没食子酸脱羧酶菌株及其降解工艺的优选。由于相较化学法，利用GAD来降解没食子酸生产焦性没食子酸的收率并不高，国内的研究基本上属于空白，国外虽然早在上世纪60年代就有相应的研究，但目前已发现可有高效降解效果的菌株仍然很少，但目前已发现可有高效降解效果的菌株仍然很少，诸如克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.0xidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等。研究发现,某些微生物菌种可以产生脱羧酶而将多羟基苯甲酸羧基脱去；某些微生物菌种可以在特定的培养基上产生高活性没食子酸脱羧酶(GAD)，将没食子酸降解成焦性没食子酸。Hajim等利用柠檬菌株(C.sp.64-1)，在厌氧条件下降解没食子酸生产焦性没食子酸，产率达到97.4%。Kumar等采用固定柠檬酸杆菌(C.freundii)生物反应，进行连续发酵没食子酸，焦性没食子酸的产率达到98.5%。Soni等从印度Rfjasthan地区的土壤中利用EDAE纤维素离子交换柱和交联葡萄糖G-50凝胶过滤色谱分离得到了一种肠杆菌(E.spp.)，该细菌可以产高活性没食子酸脱羧酶(GAD)，焦性没食子酸产率14.48%。Spiros等利用基因工程菌将葡萄糖生物合成没食子酸和焦性没食子酸，来代替生物催化生产焦性没食子酸的方法，产率可达93~97%。Grant利用产气杆菌研究了非氧化脱羧酶对多羟基苯甲酸的脱羧作用及部分脱羧酶的性质，主要是邻苯二酚、间苯二酚母核结构型多羟基苯甲酸和氨基苯甲酸的脱羧，微生物为黑曲霉菌、产气杆菌、假单胞菌、大肠杆菌等。目前已从多种细菌中分离得到没食子酸脱羧酶，如成团泛菌(P.agglomerans T71)、柠檬酸杆菌(C.freundii TB3)、柠檬酸杆菌(C.sp.64-1)、肠杆菌属(E.Spp),除细菌外还发现一株酵母菌(R.Glutinis)也可以产生没食子酸脱羧酶。
三、
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于将负压空化和负压微波喷雾干燥技术应用于中药五倍子提取中，通过对负压空
[0007]本发明的目的在于提供一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现:
[0008]第一步，培养基制备
[0009](I)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为种子培养基；
[0010](2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、琼脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基；
[0011](3)发酵培养基成团泛菌发酵培养基:0.3%没食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基:2.0%没食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌发酵培养基:1.0 %没食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 饱和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 缓冲溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 与 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸馏水制得)；氧化还原真杆菌发酵培养基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %细菌琼脂粉、0.2%没食子酸；植物乳杆菌、解没食子酸链球菌发酵培养基:包含5.0%去纤维蛋白的马血、20mM没食子酸的肉汤培养基；黏红酵母菌发酵培养基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM没食子酸、0.5%酵母提取物；肠杆菌属、产气肠杆菌属发酵培养基:0.06% MgSO4.7H20、0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%没食子酸、0.5%麦芽糖并取30mM pH值为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液，其中没食子酸于100°C下灭菌5min，麦芽糖于115°C下灭菌30min，其余成分在121°C下灭菌20min，制备发酵培养基。
[0012]第二步，高产没食子酸脱羧酶(GAD)的菌种筛选
[0013]初筛的方法:将培养好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.0xidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等菌液,分别放入相应的发酵培养基中培养发酵，如肠杆菌属(E.sp.)、产气肠杆菌(E.aerogenes)的发酵培养基如第一步中所示，温度30~37°C，每隔12h取样一次，然后取用3倍体积的乙醚萃取发酵液3次，合并萃取液、减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，经TLC和HPLC分析没食子酸和焦性没食子酸，筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和黏红酵母菌(R.glutinis)。
[0014]第三步，菌种底物诱导
[0015]配制CDM缺碳培养基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%没食子酸及 30mMpH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到250mL摇瓶(装液量10mL) CDM培养基中，在水浴温度为25~30°C，转速为180~200r/min的摇床中培养，每12h取样一次，HPLC检测培养发酵液中没食子酸和焦性没食子酸；
[0016]第四步，种子液制备及发酵培养
[0017]将培养好的斜面菌种以无菌操作取五环，转接到250mL摇瓶(装液量10mL)种子培养基中，温度30~40°C，静置培养6~8h，将培养好的种子液按照4~6%接种量，转接到发酵培养基中，温度30~35°C，180~200r/min摇床培养50~70h ；
[0018]第五步，摇瓶生理胁迫培养及响应面优化
[0019]通过考察接种量、发酵时间、磷酸盐浓度、底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值等因素对焦性没食子酸的收率的单因素影响，采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度、发酵温度、发酵液起始PH值)3水平的响应面优化，并进行验证。
[0020]第六步，发酵液中焦性没食子酸提取
[0021]取第五步最佳工艺条件下发酵液原液，于6000r/min条件下离心20min，取上清液用其体积3倍的有机溶剂萃取3次，合并萃取相、浓缩，得焦性没食子酸浓缩物；
[0022]第七步，中压柱分离制备
[0023]将焦性没食子酸浓缩物与中压柱填料按质量比1: 10~30吸附，洗脱剂为氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20~300cm，柱直径2~30cm，柱压为3~lOMPa，检测波长220~360nm，流速2~100mL/min，富集焦性没食子酸，室温真空同收溶剂，经HPLC分析，制备得到98%以上焦性没食子酸；
[0024]本专利采用克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.0xidoreducens)、大肠杆菌(E.coli)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis) 10种菌种进行筛选,配制不同的培养基，如产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.) CDM缺碳培养基为0.06 % MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2SO4^0.2%没食子酸及30mM pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液；弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii) CDM 缺碳培养基为 2.0 % 没食子酸，0.2 % (NH4)2HP04,0.1 % KH2PO4,0.05%MgSO4.7Η20，0.05%酵母提取物。在培养48h后产生了焦性没食子酸，通过初选，TLC和HPLC检测，选出具有高产没食子酸脱羧酶(GAD)产气肠杆菌(E.aerogenes),肠杆菌为(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌为(C.freundii)、解没食子酸链球菌为(S.gallolyticus)，黏红酵母菌为(R.glutinis)。
[0025]本发明采用pH值为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液，随着初始pH值的上升，焦性没食子酸的收率不断下降，当初始PH值为6.0时最大收率76.21 %，当初始pH值小于5.4和大于7.6时，均并未检测出焦性没食子酸，培养基pH值对菌种的影响很大。单因素实验中，过高或者过低的初始PH值的培养基下，都不会使没食子酸降解产生焦性没食子酸，因此实验的最适初始PH值选择在5.6~6.0之间。而没食子酸的降解率则随着pH值的增加呈现先增加后平稳的趋势，说明整个过程中在PH值较低时没食子酸的主要降解产物为焦性没食子酸，而随着PH值的增加，没食子酸其他的降解产物也逐渐生成，故在焦性没食子酸的收率下降的时候没食子酸的降解率仍然很高。
[0026]本发明发酵培养温度25~40°C，优选25~35°C，发酵温度达到35°C时，收率达到最大值为63.56%，随着温度的继续升高，过高的温度破坏了酶的产生的环境以及所产生的GAD的本身的稳定性，在温度为45~50°C时收率下降，整个过程与没食子酸的降解率呈相同的趋势。
[0027]本发明在180~300r/min摇床培养，优选180~220r/min。在培养4~6h时，高产没食子酸脱羧酶(GAD)的菌种处于对数生长期，将此时间段的细菌接种到发酵培养基中，细菌适应新环境所需的调整期会大大缩短，同时提高细菌在新的培养基中的成活率，本发明优选培养5h的菌种接种到发酵培养基中，在往复式水浴恒温振荡器中以180r/min的振荡速度恒温培养后，将发酵液萃取、浓缩之后HPLC检测分析，没食子酸的转化率97%以上，焦性没食子酸收率60~80%。
[0028]本发明发酵采用0.2~0.5%没食子酸为底物浓度，随着底物浓度的增加，没食子酸的降解率随着底物浓度的增加而增加，过高的底物浓度会对培养基的PH值改变较大，从而抑制细菌的生长或者其所产生的GAD的活性。因此优选底物浓度为0.4%为宜。
[0029]本发明采用摇瓶生理胁迫培养及响应面优化发酵工艺,采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度0.3%、0.4%、0.5% ;发酵温度25°C、30°C、35°C ;初始pH值
5.6、6.0、6.4) 3水平的响应面优化，并进行验证实验。利用Design Expert软件,进行多元线性回归拟合，获得焦性没食子酸的收率对编码自变量的二次多项回归方程为:Y =68.63-8.68ΧΧΑ11.80ΧΧ2_18.26XX3+20.STXX1XX2-?.QeXX1XX3+^.80ΧΧ2ΧΧ3_6.46ΧΧ/-23.69ΧΧ22-10.91 XX12XXjH.SSXX12XX3-?.62 X X1X X22
[0030]对响应面结果利用软件进行最优化分析，确定最优条件如下:发酵温度31.58°C，发酵液初始pH值为6.07，底物浓度为0.32%，在该条件下的预测值为80.0222%。为了方便操作，将发酵温度调整为32°C，发酵液初始pH值调整为6.0，底物浓度调整为0.32%，在此工艺条件下进行3次平行实验，得到的焦性没食子酸的平均得率为77.86% (RSD =1.21% )与预测值相差2.70%，说明吻合性良好，验证所建模型的正确性。
[0031]本发明采用HPLC分析焦性没食子酸，色谱柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分离柱，流动相为甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通过0.45 μ m孔径滤膜过滤，流速lmL/min，检测波长263nm，检测器PDA 二极管阵列检测器，室温。焦性没食子酸收率利用焦性没食子酸标准品(纯度>99.5%)绘制标准曲线，其保留时间分别为:
3.443min，焦性没食子酸标准曲线为y = 1318523.5x+6474.1，相关系数R = 0.99951。分析时以焦性没食子酸的收率为指标，其计算公式为:
[0032]焦性没食子酸收率y = (5Xc/Vl) X v0/m0X 100% ；
[0033]式中
[0034]vl:萃取体积；v0:发酵液实际体积；m0:焦性没食子酸的理论产量；c =HPLC检测时的焦性没食子酸浓度，由其标准曲线算出；数字5:进行检测的萃取液浓缩后用5mL流动相溶解的。
[0035]本发明采用有机溶剂萃取发酵液中的焦性没食子酸，选择乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I种或任2种混合溶剂，优选乙醚和乙酸乙酯。采用中压柱分离纯化萃取物中焦性没食子酸。中压柱填料选择200~300目的硅胶和氧化铝中的I种或2种任意比，洗脱剂为叔丁基甲醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇中的I种或几种的混合溶液，优选氯仿:甲醇=50: 1-10 (v/v)混合溶剂。填料也可选择孔径为60A，40~60μπι的ODS C18、C8和SephedexLH-20材料，洗脱剂为甲醇、乙醇和水中的I种或几种的混合溶液，优选I~20%的甲醇水溶液。
【专利附图】
【附图说明】
:
[0036]附图1为焦性没食子酸制备路线；
附图2为菌种筛选过程中产气肠杆菌降解没食子酸生产焦性没食子酸的HPLC检测图；
[0037]附图3为接种量对焦性没食子酸收率的影响图；
[0038]附图4为底物浓度对焦性没食子酸收率的影响图；
[0039]附图5为磷酸盐缓冲溶液含量对焦性没食子酸收率的影响图；
[0040]附图6为发酵时间对焦性没食子酸收率的影响；
[0041]附图7为发酵温度对焦性没食子酸收率的影响；
[0042]附图8为初始pH对焦性没食子酸收率的影响。
【具体实施方式】
[0043]以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
[0044]实施例1没食子酸和焦性没食子酸的HPLC分析及计算方法
[0045]准确称取10mg的焦性没食子酸标准品流动相溶解，于10mL容量瓶中定容。分别取2、4、6、8、10mL至1mL的容量瓶中定容，得0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mg/mL的标准溶液。然后在流动相为:甲醇:水(0.5%醋酸水)=37: 63的条件下，于高效液相分析仪中检测。采用HPLC分析焦性没食子酸，色谱柱Thermo 0DS-2C18 (5 μ m250X4.6mm)分离柱，流动相为甲醇-水(含0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通过0.45 μ m孔径滤膜过滤，流速ImL/min,检测波长263nm，检测器PDA 二极管阵列检测器，室温。焦性没食子酸收率利用焦性没食子酸标准品(纯度>99.5%)绘制标准曲线，其保留时间分别为:3.443min，焦性没食子酸标准曲线为I = 1318523.5X+6474.1，相关系数R = 0.99951。分析时以焦性没食子酸的收率为指标，其计算公式为:
[0046]焦性没食子酸收率y = (5Xc/n,) X v0/m0X 100% ；
[0047]式中
[0048]vl:萃取体积；v0:发酵液实际体积；m0:焦性没食子酸的理论产量；c =HPLC检测时的焦性没食子酸浓度，由其标准曲线算出；数字5:进行检测的萃取液浓缩后用5mL流动相溶解的。
[0049]实施例2.焦性没食子酸的制备方法
[0050]第一步，培养基制备
[0051](I)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为种子培养基；
[0052](2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、琼脂15.0g,在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基；
[0053](3)发酵培养基成团泛菌发酵培养基:0.3%没食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、0.001% FeSO4.7Η20、0.I % KH2PO4^0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基:2.0%没食子酸、0.2% (NH4)2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌发酵培养基:1.0 %没食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、
2.0% (NH4)2SO4^0.8M 饱和 Na2B4O7.1H2O 水溶液、0.5M Na2HPCM.12H20 缓冲溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2HPO4.12H20 或者 4.969g Na2HPO4 与 2.340g NaH2P04.2Η20 溶于 10mL 蒸馏水制得)；氧化还原真杆菌发酵培养基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %细菌琼脂粉、
0.2%没食子酸；植物乳杆菌、解没食子酸链球菌发酵培养基:包含5.0%去纤维蛋白的马血、20mM没食子酸的肉汤培养基；黏红酵母菌发酵培养基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM没食子酸、0.5%酵母提取物；肠杆菌属、产气肠杆菌属发酵培养基:0.06% MgSO4.7H20、
0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%没食子酸、0.5%麦芽糖并取30mM pH值为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液，其中没食子酸于100°C下灭菌5min，麦芽糖于115°C下灭菌30min，其余成分在121°C下灭菌20min， 制备发酵培养基。
[0054]第二步，高产没食子酸脱羧酶(GAD)的菌种筛选
[0055]初筛的方法:将培养好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.0xidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等菌液,分别放入相应的发酵培养基中培养发酵，如肠杆菌属(E.sp.)、产气肠杆菌(E.aerogenes)的发酵培养基如第一步中所示，温度30~37°C，每隔12h取样一次，然后取用3倍体积的乙酸乙酯萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，经TLC和HPLC分析没食子酸和焦性没食子酸，筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和黏红酵母菌(R.glutinis)。
[0056]第三步，菌种底物诱导
[0057]配制CDM缺碳培养基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%没食子酸及 30mMpH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到250mL摇瓶(装液量10mL) CDM培养基中，在水浴温度为25~30°C，转速为180~200r/min的摇床中培养，每12h取样一次，HPLC检测培养发酵液中没食子酸和焦性没食子酸；
[0058]第四步，种子液制备及发酵培养
[0059]将培养好的斜面菌种以无菌操作取五环，转接到250mL摇瓶(装液量10mL)种子培养基中，温度30~40°C，静置培养6~8h，将培养好的种子液按照4~6%接种量，转接到发酵培养基中，温度30~35°C，180~200r/min摇床培养50~70h ；
[0060]第五步，摇瓶生理胁迫培养及响应面优化
[0061]通过考察接种量、发酵时间、磷酸盐浓度、底物浓度、发酵温度、发酵液起始pH值等因素对焦性没食子酸的收率的单因素影响，采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度、发酵温度、发酵液起始PH值)3水平的响应面优化，并进行验证。
[0062]第六步，发酵液中焦性没食子酸提取
[0063]取第五步最佳工艺条件下发酵液原液，于6000r/min条件下离心20min，取上清液用其体积3倍的有机溶剂萃取3次，合并萃取相、浓缩，得焦性没食子酸浓缩物；
[0064]第七步，中压柱分离制备
[0065]将焦性没食子酸浓缩物与中压柱填料按质量比1: 10~30吸附，洗脱剂为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I种或几种的混合溶液，中压柱柱长20~300cm,柱直径2~30cm,柱压为3~1MPa,检测波长220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性没食子酸，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到98%以上焦性没食子酸；
[0066]本实施配制不同的培养基，如产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)CDM缺碳培养基为 0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4'0.2%没食子酸及 30mM pH 值为 6.6 的磷酸盐缓冲溶液；弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii) CDM缺碳培养基为2.0 %没食子酸，0.2%(NH4)2HPO4,0.1 % KH2PO470.05 % MgSO4.7H20，0.05 % 酵母提取物。在进行培养 48h 后产生了焦性没食子酸，通过初选，TLC(条件为:展开剂为乙醚:乙醇=7: 3 ;显色剂:碘蒸气)和HPLC检测，选出具有高产没食子酸脱羧酶(GAD)产气肠杆菌(E.aerogenes)，肠杆菌(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus),黏红酵母菌(R.glutinis)。
[0067]本实施采用pH值为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液，优选5.6~6.0，发酵培养温度25~40°C，优选25~35°C，发酵温度达到35°C时，在180~300rpm摇床培养，优选180~220rpm。在培养4~6h时，高产没食子酸脱羧酶(GAD)的菌种处于对数生长期，将此时间段的细菌接种到发酵培养基中，细菌适应新环境所需的调整期会大大缩短，同时提高细菌在新的培养基中的成活率，本发明优选培养5h的菌种接种到发酵培养基中，在往复式水浴恒温振荡器中以180r/min的振荡速度恒温培养后，将发酵液萃取、浓缩之后HPLC检测分析，没食子酸的转化率97%以上，焦性没食子酸收率60~80%。
[0068]本实例发酵采用0.2~0.5%没食子酸为底物浓度，优选0.4%。采用摇瓶生理胁迫培养及响应面优化发酵工艺，采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度0.3%,
0.4%,0.5% ;发酵温度25°C、30°C、35°C ;初始pH值5.6、6.0、6.4) 3水平的响应面优化，并进行验证实验。
[0069] 本实例采用有机溶剂萃取发酵液中的焦性没食子酸，选择乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I种或任2种混合溶剂，优选乙醚和乙醇。采用中压柱分离纯化萃取物中焦性没食子酸。中压柱填料选择200~300目的硅胶和氧化铝中的I种或2种任意比，洗脱剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的一种或几种的混合溶液，优选甲基叔丁基醚:甲醇=50:1~30 (v/v)混合溶剂。填料也可选择孔径为60A, 40~60 μ m的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料，洗脱剂为乙酸乙酯、乙醚和乙醇中的一种或几种的混合溶液，优选I~20%的乙醇水溶液。
[0070]实施例3.发酵单因素工艺
[0071](I)接种量对于焦性没食子酸收率的影响
[0072]配制CDM培养基，组成为0.2%没食子酸，0.5 %麦芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，30mM磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.6)，将没食子酸、麦芽糖以及剩余盐溶液分开灭菌后，分别混合装到11瓶250mL的三角烧瓶里，在双人单面净化工作台中用移液枪分别接入
0、l、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL菌液，然后放入转速180r/min、温度30V的往复式水浴恒温摇床中发酵60h。将上述发酵好的11瓶三角烧瓶取出至双人单面净化工作台中，每瓶取样20mL。将取样后的菌液放入离心机中，在转速为6000r/min的条件下分离20min。分离好的菌液用乙醚萃取两次，每次乙醚用量30mL。再用旋转蒸发器进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后进样HPLC检测分析。结果见附图3，可以发现:随着接种量的增加，焦性没食子酸的收率在不断的增加，当接种量达到5%时焦性没食子酸收率为48.97%，此后焦性没食子酸的收率趋于稳定；当接种量为8%时收率达到最大为49.99%，但从经济效益考虑选择5%接种量为宜。
[0073](2)底物浓度对于焦性没食子酸收率的影响
[0074]配制CDM 培养基，组成为 0.5%麦芽糖，0.06% Mg(SO4)2,0.4% (NH4)2S04，30mM 磷酸盐缓冲溶液(pH = 6.6)，没食子酸含量分为0,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%,
0.7%,0.8%,0.9%Λ.0%,2.0%,2.5%等13种不同含量，将没食子酸分别放入250mL的三角烧瓶里。分开灭菌后，分别接入5mL菌液于13瓶三角烧瓶中，然后放入转速180r/min、温度30°C的往复式水浴恒温摇床中发酵60h,分别取样20mL,在转速为6000r/min的条件下离心20min ;然后，乙醚萃取两次，每次乙醚用量30mL ;再进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后HPLC检测分析。结果见附图4，可以发现:随着底物浓度的增加焦性没食子酸的收率不断上升，当底物浓度为0.4%时，焦性没食子酸的收率达到57.98%，此后趋于平稳；当底物浓度为0.7%时，收率达到最大为65.27%，但从经济效益考虑选择底物浓度为0.4%为宜；当底物浓度为0.8、0.9、1.0%时未检测出焦性没食子酸，原因是因为没食子酸本身作为一种酸对培养基的PH的存在影响，过高的底物浓度会对培养基的pH改变较大，从而抑制了产气肠杆菌产生GAD，这样就无法降解没食子酸产生焦性没食子酸。
[0075](3)磷酸盐缓冲溶液的含量对于焦性没食子酸收率的影响
[0076]配制CDM培养基，组成为0.4%没食子酸，0.5 %麦芽糖，0.06 % Mg (SO4) 2，0.4 %(NH4)2S04，10、30、50、70、90、110mM磷酸盐缓冲溶液各两个，将没食子酸、麦芽糖以及剩余盐溶液分开灭菌后，分别混合装到12瓶250mL的三角烧瓶里，分别接入5mL菌液于12瓶三角烧瓶中，然后放入转速180r/min、温度30°C的往复式水浴恒温摇床中发酵60h。取样20mL,在转速为6000r/min的条件下离心20min,然后用乙醚萃取两次,每次乙醚用量30mL ;再进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后HPLC检测分析。结果见附图5，可以发现:随着磷酸盐缓冲溶液体积的上升，焦性没食子酸的收率呈先上升后下降的趋势，当磷酸盐缓冲溶液含量为70mM时收率达到最大为56.39%。当磷酸盐缓冲溶液含量为10、30mM时未检测出焦性没食子酸，可能是由于磷酸盐缓冲溶液主要作用是调节平衡培养基的PH，所以过少的磷酸盐无法发挥作用，在培养基灭菌和在后续的培养过程中由于菌种本身的发酵使得培养基的PH改变较大却无法平衡，故导致较少的磷酸盐缓冲溶液没有焦性没食子酸的产生。当磷酸盐溶液含量大于70mM时，由于高浓度磷酸盐对培养基溶液的盐浓度的改变，使得菌种细胞膜的通透性发生了相应的改变，从而导致了整体上菌种活性的下降，如细胞产生GAD的减少，故随着磷酸盐含量的增加，焦性没食子酸的收率逐渐下降。因此，综合考虑，在实际的后续试验中选择50mM的磷酸盐缓冲溶液的含量作为最佳选择。
[0077](4)发酵时间对于焦性没食子酸收率的影响
[0078]配制CDM培养基，组成为0.4%没食子酸，0.5%麦芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，70mM磷酸盐缓冲溶液，将没食子酸、麦芽糖以及剩余盐溶液分开灭菌后，混合装到13瓶250mL的三角烧瓶里，分别接入5mL菌液，然后放入转速180r/min、温度30°C的往复式水浴恒温摇床中分别发酵0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132h。将上述发酵好的13瓶三角烧瓶取出至双人单面净化工作台中，每瓶取样20mL，在转速为6000r/min的条件下离心20min ;然后，用乙醚萃取两次，每次乙醚用量30mL ;再进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后HPLC检测分析。结果见附图6，可以发现:随着发酵时间的增加，焦性没食子酸的收率呈先上升后下降的趋势，并且在24~48h和72~120h趋于稳定，当发酵时间达到60h时焦性没食子酸收率达到最大为63.41%。当发酵时间小于60h时由于菌种本身接种到一个新的培养基上需要一定的时间进行调整，因此在发酵开始的时候随着时间的延长，焦性没食子酸的收率越来越大；当发酵时间大于72~120h时由于菌种经历了调整期、增长期开始进入稳定期，因此这个过程中，菌种数量上基本上变化不大，因此这个过程中的焦性没食子酸的收率基本上趋于稳定；120h之后菌种逐步进入到衰亡期，培养基的内部环境也由于发酵等原因，如PH和营养物质开始大量减少，因此这个过程中的焦性没食子酸的收率是逐渐下降的。
[0079](5)发酵温度对于焦性没食子酸收率的影响
[0080]配制CDM培养基，组成为0.4%没食子酸，0.5%麦芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4) 2S04，35mL磷酸盐缓冲溶液，将没食子酸、麦芽糖以及剩余盐溶液分开灭菌后，混合装到21瓶250mL的三角烧瓶里，分别接入5mL菌液。每3瓶三角烧瓶为一组，放入转速180r/min往复式水浴恒温摇床中在温度分别为20、25、30、35、40、45、50°C的条件下发酵60h。将上述发酵好的14瓶三角烧瓶取出至双人单面净化工作台中，每瓶取样20mL，，在转速为6000r/min的条件下离心20min ;然后,用乙醚萃取两次,每次乙醚用量30mL ;再进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后HPLC检测分析。结果见附图7，可以发现:刚开始随着温度的上升焦性没食子酸的收率变化并不大，当温度达到35°C时，收率达到最大值为63.56%,随着温度的继续升高，收率在下降，在温度为45、50°C时未检测出焦性没食子酸。原因是过高的温度破坏了酶的产生的环境以及所产生的GAD的本身的稳定性，因此后续试验中45、50°C时菌种无法降解没食子酸产生焦性没食子酸。
[0081](6)初始pH值对于焦性没食子酸收率的影响
[0082]配制CDM培养基，组成为0.4%没食子酸，0.5%麦芽糖，0.06% Mg (S04) 2,0.4 %(NH4)2S04，35mL磷酸盐缓冲溶液，将没食子酸、麦芽糖以及剩余盐溶液分开灭菌后(灭菌条件参考2.3.3)，混合装到12瓶250mL的三角烧瓶里。每3瓶为一组，分别调pH为5.6、6.0、6.4、6.8。在双人单面净化工作台中用移液枪分别接入5mL备用菌液于12瓶三角烧瓶中。然后放入转速180r/min、温度30°C的往复式水浴恒温摇床中分别发酵60h。将上述发酵好的12瓶三角烧瓶取出至双人单面净化工作台中，每瓶取样20mL。将取样后的菌液放入离心机中，在转速为6000r/min的条件下分离20min。分离好的菌液用乙醚萃取两次，每次乙醚用量30mL。再用旋转蒸发器进行浓缩，得到焦性没食子酸样品。结果见附图8，可以发现:样品用5mL流动相溶解，然后用0.45 μ m孔径的微孔滤膜过滤至1mL的一次性离心管中，最后HPLC检测分析。随着初始pH的上升，焦性没食子酸的收率不断下降，最大值为初始pH5.6时的70.79%，最小值为pH6.8时的29.27%，当初始pH为5.2和7.2时，并未检测出焦性没食子酸。由上述表图可以看出，培养基PH对菌种的影响是很大的，因此在此单因素实验中，过高或者过低的初始pH的培养基下，都不会使没食子酸降解产生焦性没食子酸，因此实验的最适初始pH可以选择在5.6~6.0。
[0083]实施例4.响应面优化工艺
[0084]在上述单因素结果中，可以发现微生物降解过程中底物浓度、pH值、温度三个因素，各个因素之间有较大的相互影响，另外底物没食子酸，本身作为一种酸，对发酵液的PH值的也有一定的影响。因此，为了更进一步的了解各个因素对焦性没食子酸收率的影响，该实验部分利用Box-Behnken实验设计进行3因素3水平的响应面分析，建立分析模型，找到收率最大的区域。
[0085]表1响应面分析实验因素水平
[0086]
【权利要求】
1.一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于由以下步骤组成: 第一步，培养基制备 (1)种子培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为种子培养基; (2)试管斜面保藏培养基称取蛋白胨5.0g、牛肉浸取物3.0g、NaC15.0g、琼脂15.0g，在IL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，用lmol/L盐酸将pH值调至6.5~7.0，在121°C下灭菌20min，冷却后为试管斜面保藏培养基； (3)发酵培养基成团泛菌发酵培养基:0.3%没食子酸、0.5%丙三醇、0.5%蛋白胨、.0.001% FeSO4.7Η20、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、1.0 %酵母提取物;弗氏柠檬酸杆菌发酵培养基:2.0 % 没食子酸、0.2% (NH4) 2ΗΡ04、0.1% ΚΗ2Ρ04、0.05% MgSO4.7Η20、0.05%酵母提取物；克雷伯氏菌发酵培养基:1.0 %没食子酸、3.0% C13H15N3O2 (4-氨酰安替比林)、.2.0% (NH4)2SO4^0.8M 饱和 Na2B4O7.1H2 水溶液、0.5M Na2HPO4.12H20 缓冲溶液(ρΗ7.2 可由 12.535g Na2H PO4.Iffi2O 或者 4.969g Na2HPO4 与 2.340g NaH2PO4.2H20 溶于 10mL 蒸馏水制得)；氧化还原真杆菌发酵培养基:30mM C6H7O8Na, 30mM HCOONa.2Η20、I %细菌琼脂粉、.0.2%没食子酸；植物乳杆菌、解没食子酸链球菌发酵培养基:包含5.0%去纤维蛋白的马血、20mM没食子酸的肉汤培养基；黏红酵母菌发酵培养基:0.5% C6H12O6^0.9% NaCU0.5mM没食子酸、0.5%酵母提取物；肠杆菌属、产气肠杆菌属发酵培养基:0.06% MgSO4.7H20、.0.4% (NH4)2S04、0.2%~0.5%没食子酸、0.5%麦芽糖并取30mM pH值为6.0~7.0的磷酸盐缓冲溶液，其中没食子酸于100°C下灭菌5min，麦芽糖于115°C下灭菌30min，其余成分在121°C下灭菌20min，制备发酵培养基； 第二步，没食子酸脱羧酶(GAD)的高产菌种筛选 初筛的方法:将培养好的克雷伯氏菌(K.aerogenes)、产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属Φ.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、成团泛菌(P.agglomerans)、氧化还原真杆菌(E.0xidoreducens)、植物乳杆菌(L.planetarium)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、黏红酵母菌(R.glutinis)等菌液,分别放入相应的发酵培养基中培养发酵，如肠杆菌属(E.sp.)、产气肠杆菌(E.aerogenes)的发酵培养基如第一步中所示,温度30~37°C，每隔12h取样一次，然后取用3倍体积的乙醚萃取发酵液3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，经TLC和HPLC分析没食子酸和焦性没食子酸，筛选出高产没食子酸脱羧酶(GAD)的产气肠杆菌(E.aerogenes)、肠杆菌属(E.sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和黏红酵母菌(R.glutinis)； 第三步，菌种底物诱导 配制 CDM 缺碳培养基:0.06% MgSO4.7Η20、0.4% (NH4)2SO4^0.2%没食子酸及 30mM pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到10mL CDM培养基的250mL摇瓶中，在水浴温度为25~30°C，转速为180~200r/min的摇床中培养，每12h取样一次，HPLC检测发酵液中没食子酸和焦性没食子酸； 第四步，种子液制备及发酵培养 将培养好的斜面菌种以无菌操作取五环，转接到10mL发酵培养基的250mL摇瓶中，温度30~40°C，静置培养6~8h，将培养好的菌液按照4~6%接种量，转接到发酵培养基中，温度30~35°C，180~200r/min摇床培养50~70h ； 第五步，摇瓶生理胁迫培养及响应面优化 通过考察接种量、发酵时间、磷酸盐浓度、底物浓度、发酵温度、发酵液起始PH值等因素对焦性没食子酸的收率的单因素影响，采用Box-Behnken实验设计进行3因素(底物浓度、发酵温度、发酵液起始PH值)3水平的响应面优化，并进行验证； 第六步，发酵液中焦性没食子酸提取 取第五步最佳工艺条件下发酵液原液，于6000r/min条件下离心20min,取上清液用其体积3倍的有机溶剂萃取3次，合并萃取相、浓缩，得焦性没食子酸浓缩物； 第七步，中压柱分离制备 将焦性没食子酸浓缩物与中压柱填料按质量比1: 10~30吸附，洗脱剂为甲基叔丁基醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇和水中的I种或几种的混合溶液，中压柱柱长20~300cm,柱直径2~30cm,柱压为3~1MPa,检测波长220~360nm,流速2~lOOmL/min,富集焦性没食子酸，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到98%以上焦性没食子酸。
2.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于步骤2中产气肠杆菌(E.aerogenes)等菌种具有降解没食子酸生产焦性没食子 酸的能力。
3.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于权利I中没食子酸和焦性没食子酸TLC条件为:展开剂为乙醚:乙醇=7: 3 ;显色剂:碘蒸气。
4.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于权利I中焦性没食子酸HPLC条件为:色谱柱Thermo0DS-2C18(5ym250X4.6mm)分离柱，流动相为甲醇-水(含 0.5%醋酸)=37-63 (v/v)，通过0.45 μ m孔径滤膜过滤,流速:lmL/min,检测波长:263nm,检测器:PDA 二极管阵列检测器，检测温度:室温。焦性没食子酸标准曲线为y= 1318523.5X+6474.1，相关系数R =0.99951。
5.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于第五步焦性没食子酸收率测定计算公式为: 焦性没食子酸收率y = (5 XcA1) Xv0Ai0X 100% ； 式中 V1:有机溶剂萃取体积；V(1:菌种发酵液实际体积吨:焦性没食子酸的理论产量；c:HPLC检测时菌种发酵液中焦性没食子酸浓度；数字5:进行检测的萃取液浓缩后用5mL流动相溶解的。
6.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于步骤中第六步萃取用的有机溶剂，选自乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯等其中I种或任2种混合溶剂。
7.根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于第七步中压柱填料，选择200~300目的硅胶和氧化铝中的I种或2种任意比，洗脱剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇和乙醇中的I种或几种的混合溶液，优选乙醚:乙醇=50:1~30 (v/v)混合溶剂。
8. 根据权利要求1所述的一种高产没食子酸脱羧酶(GAD)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于第七步中压柱填料，选择孔径为60A，40~60μπι的ODS C18、C8和S^hedex LH-20材料中任一种，洗脱剂为乙酸乙酯、乙醚和乙醇的I种或者几种的混合溶液，优选1~20% (v/v)的乙醇水溶液。
【文档编号】C12Q1/14GK104178552SQ201410366064
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】王成章, 李文君, 闵凡芹 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所