一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用，涉及蛋白基因突变检测。所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、扩增试剂瓶和对照试剂瓶，所述扩增试剂瓶和对照试剂瓶设在盒体内。制备方法：1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA?PCR混合液和HBA酶混合液；2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α-珠蛋白基因突变检测试剂盒。所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测α-珠蛋白基因突变中应用。简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短，检测通量高，检测特异性高、结果容易判读。
【专利说明】-种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白基因突变检测，尤其是涉及一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒 及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] α -珠蛋白基因突变在人类基因组中较为常见，其基因突变包括单碱基或少数碱 基的转换、颠换、插入、缺失等多种类型。在α -珠蛋白基因簇中，α 1-珠蛋白基因和α 2-珠 蛋白基因是两个高GC含量且高度同源性的基因，且两个基因编码的多肽链序列完全相同， 而α-珠蛋白基因突变可以导致所编码的α-珠蛋白表达降低，从而导致α-地贫等一系 列生物学性状改变。因此，对α-珠蛋白基因突变的检测有重要的生物学意义。潘干华 等（潘干华，等.广东南海地区非缺失型α-地中海贫血分子流行病学调查.国际检验 医学杂志，2014, 35 (1):56-57.)报道了广东南海地区非缺失型α-地中海贫血分子流行 病学调查，指出中国人群的α-珠蛋白基因突变主要有三种形式：c. 369C>G、c. 377T>C和 c. 427T>C，且均发生在α2_珠蛋白基因上。
[0003] 目前，常用于α -珠蛋白基因突变检测主要是基于PCR的一系列方法，如反向 点杂交法（Reverse Dot Blot，RDB)、等位基因特异性PCR、PCR-SSCP、变性高效液相色谱 (DHPLC)、焦磷酸测序（Pyrosequencing)、Sanger测序法等。其中反向斑点杂交是目前使用 较为广泛的α -珠蛋白基因突变检测方法，该方法属于一种异相的突变检测方法，需要对 PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染，并且结果判读易受主观因素影响。 ARMS-PCR检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造成假阳性结果的发 生。DHPLC对仪器要求设备高，应用性不强。PCR-SSCP对实验条件要求严格，只能检测突变 是否存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序，且由于某些点突变类型对单 链DNA的空间构象改变小，容易漏检。焦磷酸测序、Sanger测序虽然原理不同，但均是通过 PCR扩增后再进行PCR产物测序，操作步骤繁琐，花费时间长，仪器设备昂贵，不能满足基因 突变检测所需快速、简便的要求。
[0004] 烙解曲线（Dissociation Curve)是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的 曲线。总的DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点（T m)，熔点是双链DNA固 有的属性，不同序列的双链DNA，Tm值不同，这与双链DNA的长度、碱基组成相关。在实时 PCR(Real-time PCR)技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR 扩增的特异性，根据PCR产物的Tm值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。随 着生物技术的发展，仪器设备分辨率的改进，目前基于荧光染料的熔解曲线技术已经发展 成的高分辨烙解曲线（High Resolution Melting Curve)技术，该技术可以识别单个碱基 的突变，Shih 等人（Hung-Chang Shih, etc. Development of a high-resolution melting method for the detection of hemoglobin alpha variants. Clinical Biochemistry, 20 10,43(7-8):671-676.)将该技术用于a-珠蛋白基因突变的快速检测，但由于该技术本身 的局限性，只能对基因突变进行扫描，需要对突变样本进行测序验证，以确定突变的类型， 且对DNA样本质量要求非常高，不太适合在各实验室的广泛推广应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染 及通量较低等缺点，提供一种简便快捷、灵敏度高、可靠性强、成本较低的基于荧光PCR熔 解曲线技术的一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用。
[0006] 所述α -珠蛋白基因突变检测试剂盒设有盒体、隔板、盒盖、HBA PCR混合液瓶、 ΗΒΑ酶混合液瓶、ΗΒΑ标准对照瓶和ΗΒΑ阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上， HBAPCR混合液瓶、ΗΒΑ酶混合液瓶、ΗΒΑ标准对照瓶和ΗΒΑ阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶 孔内。
[0007] HBA PCR混合液瓶内装有HBA PCR混合液，ΗΒΑ酶混合液瓶内装有ΗΒΑ酶混合液， ΗΒΑ标准对照瓶内装有ΗΒΑ标准对照，ΗΒΑ阴性对照瓶内装有ΗΒΑ阴性对照。
[0008] 所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和ΗΒΑ酶混合液；所述HBA PCR混合液包括 1父？0?缓冲液，3.〇11111%(：12，(^了？、(101\(?^1\(1111\(1^1 3各0.21111，0.041111〇2-珠蛋白基 因扩增引物F1、0. 04 μ Μ内参基因扩增引物F2,0. 4 μ Μα 2-珠蛋白基因扩增引物R1、0. 4 μ Μ 内参基因扩增引物R2,0. 2μΜ荧光探针Ρ1、0. 2μΜ荧光探针Ρ2、0. 2μΜ荧光探针Ρ3 ;所述 ΗΒΑ酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶，0· 1U/ μ L UNG酶。
[0009] 所述扩增引物的长度为15?40bp的寡核苷酸链，Tm为50?70°C。
[0010] 优选的，所述内参基因为保守基因G6PD基因。
[0011] 优选的，所述α 2-珠蛋白基因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为： 5' -GGGCCTGGGCCGCACT-3'（SEQ ID Ν0. 1)。
[0012] 优选的，所述α 2-珠蛋白基因扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为： 5, -CAGGAAGGGCCGGTGCA A-3' （SEQ ID N0.2)。
[0013] 优选的，所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为： 5; -CCTTTCTTCCACCAGACAG C-3; (SEQ ID NO. 3)〇
[0014] 优选的，所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为： 5' -GCTCAACTTAGCAGAGCC T-3'（SEQ ID N0.4)。
[0015] 所述荧光探针可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针， 包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
[0016] 优选的，荧光探针可为5'末端和3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬 灭探针。
[0017] 优选的，荧光基团可为 ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、 CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、R0X、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、 CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5. 5 或 Quasar 705 等。
[0018] 优选的，淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA等。
[0019] 优选的，荧光探针的长度可为15?40bp的寡核苷酸链，Tm为50?80°C，GC含量 40%?70%。
[0020] 优选的，所述荧光探针P1的碱基 BHQ1-3，（SEQIDN0.5)。
[0021] 优选的，所述荧光探针P2的碱基 BHQ1-3，（SEQIDN0.6)。
[0022] 优选的，所述荧光探针P3的碱基序列为：5/-1?(?-了6(^640^0^44了40^1^446(：-BHQ2-3，（SEQ ID N0.7)。
[0023] 所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照。
[0024] 优选的，HBA标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
[0025] 所述HBA阴性对照不含目的基因片段，优选为无菌水或Tris-HCl缓冲液。
[0026] 所述PCR缓冲液可以是1 XPCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。
[0027] 所述α -珠蛋白基因突变检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0028] 1)制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和ΗΒΑ酶混合液；所述ΗΒΑ PCR 混合液包括 1 XPCR 缓冲液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各 0· 2mM， 0. 04mMa 2-珠蛋白基因扩增引物F1、0. 04μΜ内参基因扩增引物F2,0. 4μΜα 2-珠蛋白基 因扩增引物Rl、〇. 4μΜ内参基因扩增引物R2,0. 2μΜ荧光探针Ρ1、0. 2μΜ荧光探针Ρ2、 0. 2 μ Μ荧光探针Ρ3 ;所述ΗΒΑ酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶，0. 1U/ μ L UNG酶；所 述扩增引物的长度为15?40bp的寡核苷酸链，Tm为50?70°C ;
[0029] 2)制备对照试剂，所述对照试剂包括HBA标准对照和HBA阴性对照；
[0030] 3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α -珠 蛋白基因突变检测试剂盒。
[0031] 所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒可在检测α-珠蛋白基因突变中应用，所述 应用的具体操作步骤如下：
[0032] 1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
[0033] (1)试剂准备--配液区
[0034] ①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：取 11父19.84 1^耶4?〇?1^1(11根据反应管数确定）和11\0.24 1^耶4酶混合液加入到1.51^ 离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心（如3000rpm离心5s)。PCR反应液应即配即用，隔 夜使用需-18°C以下贮存。
[0035] ②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20 μ L分装于PCR薄壁反应管。
[0036] ③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18°C以下冰箱储存直至样本提 取完。
[0037] (2)样品的加样--模板间
[0038] ①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5 μ L相应的待检DNA样本、HBA标 准
[0039] 对照和ΗΒΑ阴性对照，并立即盖严管盖。
[0040] ②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
[0041] (3) PCR扩增和熔解曲线分析--扩增区
[0042] ①PCR扩增程序可为：
[0043] 第一步：5CTC 2min，95°C lOmin ;
[0044] 第二步：95°C 15s - 65 ?56°C 15s - 76°C 20s，10 个循环，其中 65 ?56°C 15s 每 个循环下降rc;
[0045] 第三步：95°C 15s - 55°C 15s - 76°C 20s，50 个循环；
[0046] ②熔解曲线分析程序可为：
[0047] 95°C lmin - 35°C 3min - 40 ?85°C，其中 40 ?85°C 以 0· 4°C /5s 的升温速率进 行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、R0X的荧光信号。
[0048] ③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管（闭管）取出放入凹凸袋，将封口封严，按污 染源处理。
[0049] 2)结果判读，具体方法如下：
[0050] 根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm 值的变化进行判断待检样本是否含有α 2-珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型。这其中 涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起 的熔点误差。数据分析按以下步骤进行：
[0051] 1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的Tm值；
[0052] 2)读取待检测样本在各检测通道的Tm值；
[0053] 3)将待检测在各检测通道的Tm值减去野生型对照在各检测通道对应的Tm值，得 到各通道的Λ ^值，参照表1，判断待检是否含有突变，以及突变的类型。
[0054] 表 1
[0055]
【权利要求】
1. α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、HBA PCR混合液 瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶，隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上， HBA PCR混合液瓶、HBA酶混合液瓶、HBA标准对照瓶和HBA阴性对照瓶分别插入隔板上的 瓶孔内；HBA PCR混合液瓶内装有HBA PCR混合液，HBA酶混合液瓶内装有HBA酶混合液， HBA标准对照瓶内装有HBA标准对照，HBA阴性对照瓶内装有HBA阴性对照。
2. 如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述HBA PCR混合 液包括1\?〇?缓冲液，3.0禮1%(：12，(^了？、(101\(?^1\(1111\(1^1 3各0.21111，0.041111〇2-珠 蛋白基因扩增引物F1、0. 04 μ Μ内参基因扩增引物F2,0. 4 μ Μα 2-珠蛋白基因扩增引物R1、 0. 4μΜ内参基因扩增引物R2,0. 2μΜ荧光探针Ρ1、0. 2μΜ荧光探针Ρ2、0. 2μΜ荧光探针 Ρ3 ;所述ΗΒΑ酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶，0· 1U/ μ L UNG酶。
3. 如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述扩增引物的长 度为15?40bp的寡核苷酸链，Tm为50?70°C ; 所述内参基因为保守基因G6H)基因。
4. 如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述α 2-珠蛋白基 因扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：
5. -GGGCCTGGGCCGCACT-3,； 所述α 2-珠蛋白基因扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为： 5, -CAGGAAGGGCCGGTGCA Α-3,； 所述内参基因扩增引物F2为上游引物，其喊基序列为： 5' -CCTTTCTTCCACCAGACAG C-3/ ； 所述内参基因扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为： 5, -GCTCAACTTAGCAGAGCC T-3，。
5. 如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针为与 靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但不限于自淬灭探针、相 邻探针、容忍型分子信标； 荧光探针可为5'末端和3'末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针； 荧光基团可为 ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5. 5 或 Quasar 705; 淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE或TAMRA ; 荧光探针的长度可为15?4(^?的寡核苷酸链，1'"1为50?801：，6(：含量40%?70%。
6. 如权利要求2所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针PI的 碱基序列为： 5， -FAM-CGGTGCACGCCTCCCCGGACAAGT T-BHQ1-3，； 所述荧光探针P2的碱基序列为： 5， -HEX-CGTGCCTGCTCCATGCCTCAGCACG-BHQ1-3，； 所述突光探针P3的喊基序列为： 5， -ROX-TGCTGACCTCCAAATACCGTCAAG C-BHQ2-3，。
7. 如权利要求2所述a-珠蛋白基因突变检测试剂盒，其特征在于HBA标准对照为正 常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA ; 所述HBA阴性对照不含目的基因片段，采用无菌水或Tris-HCl缓冲液； 所述PCR缓冲液可为1 X PCR缓冲液。
8. 如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以 下步骤： 1) 制备扩增试剂，所述扩增试剂包括HBA PCR混合液和ΗΒΑ酶混合液；所述ΗΒΑ PCR 混合液包括 1 X PCR 缓冲液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP 各 0· 2mM， 0. 04mMa 2-珠蛋白基因扩增引物F1、0. 04μΜ内参基因扩增引物F2,0. 4μΜα 2-珠蛋白基 因扩增引物Rl、〇. 4μΜ内参基因扩增引物R2,0. 2μΜ荧光探针Ρ1、0. 2μΜ荧光探针Ρ2、 0. 2 μ Μ荧光探针Ρ3 ;所述ΗΒΑ酶混合液包括5U/ μ L Taq DNA聚合酶，0. 1U/ μ L UNG酶；所 述扩增引物的长度为15?40bp的寡核苷酸链，Tm为50?70°C ; 2) 制备对照试剂，所述对照试剂包括ΗΒΑ标准对照和ΗΒΑ阴性对照； 3) 将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得α-珠蛋白 基因突变检测试剂盒。
9. 如权利要求1所述α-珠蛋白基因突变检测试剂盒在检测α-珠蛋白基因突变中的 应用。
10. 如权利要求9所述应用，其特征在于其具体操作步骤如下： 1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下： (1) 试剂准备--配液区 ① 首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为：取nX 19. 8 μ L HBA PCR Mix和ηΧΟ. 2 μ L ΗΒΑ酶混合液加入到1. 5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时 离心，PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18°C以下贮存，其中，η根据反应管数确定，所述 离心可采用3000rpm瞬时离心5s ; ② PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20 μ L分装于PCR薄壁反应管； ③ 将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18°C以下冰箱储存直至样本提取完； (2) 样品的加样--模板间 ① 用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5 μ L相应的待检DNA样本、HBA标准对 照和ΗΒΑ阴性对照，并立即盖严管盖； ② 将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区； (3) PCR扩增和熔解曲线分析--扩增区 ① PCR扩增程序为： 第一步：50°C 2min，95°C lOmin ; 第二步：95°C 15s - 65 ?56°C 15s - 76°C 20s，10 个循环，其中 65 ?56°C 15s 每个 循环下降rc ; 第三步：95°C 15s - 55°C 15s - 76°C 20s，50 个循环； ② 熔解曲线分析程序为： 95°C lmin - 35°C 3min - 40?85°C，其中40?85°C以0· 4°C /5s的升温速率进行熔 解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX的荧光信号； ③ 程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理； 2)结果判读，具体方法如下： 根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm值的 变化进行判断待检样本是否含有α 2-珠蛋白基因突变，以及基因突变的类型，其中涉及待 测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点 误差，数据分析按以下步骤进行： 1) 读取标准对照在各检测通道的熔解峰的^值； 2) 读取待检测样本在各检测通道的Tm值； 3) 将待检测在各检测通道的Tm值减去野生型对照在各检测通道对应的Tm值，得到各 通道的Λ ^值，如表1所示； 表1
由表1判断待检是否含有突变，以及突变的类型。
【文档编号】C12Q1/68GK104120080SQ201410376846
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】黄秋英, 李庆阁, 王旭东 申请人:厦门大学, 厦门致善生物科技有限公司