一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方法
【专利摘要】本发明公开了一种引物、靶核苷酸扩增方法及检测靶核苷酸序列扩增的方法，属于生物【技术领域】。所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括B片段，所述反向引物的5'末端包括A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，A片段与A1片段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。所述靶核苷酸扩增方法，提供靶核苷酸，加入正向引物和反向引物，所述正向链和所述反向链分别扩增。所述检测靶核苷酸序列扩增的方法用于检测靶核苷酸是否扩增。所述引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，所述靶核苷酸扩增方法与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。
【专利说明】一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核 苷酸扩增的方法。
【背景技术】
[0002] 核苷酸是组成核酸的基本单位，对核苷酸遗传序列分析方法是一种鉴定遗传疾 病、病原微生物等非常强有力的方法，该核苷酸序列分析方法可直接分析生命体的遗传特 征，并且，该核苷酸序列分析方法检测的对象是基因自身。
[0003] 常用的体外扩增核苷酸序列的方法包括PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合 酶链式反应）技术，该PCR技术由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步组成一个 周期，该周期循环进行，使得目的核苷酸得以扩增。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
[0005] 现有的PCR技术的扩增效率仍不能满足人们的要求，因此，该PCR技术的扩增效率 有待提1?。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中PCR技术的扩增效率低的问题，本发明实施例提供了一种引 物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方法。所述技术方案如下：
[0007] -方面，本发明实施例提供了一种引物，所述引物适用于扩增的所述靶核苷酸，所 述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括 B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片 段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1 片段，所述反向引物的3'末端包括所述C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片 段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补。
[0008] 具体地，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示，所述反向引物的序列 如序列表中SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 5所示。
[0009] 另一方面，本发明实施例提供了一种扩增靶核苷酸的方法，所述方法包括：
[0010] 提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片 段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段；
[0011] 加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反 向引物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增；
[0012] 所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所 述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所 述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段 互补；
[0013] 所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反 向引物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1 片段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末 端和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别通过所述A片段和所述A1片段互 补形成环链，所述第一正向链的5'末端和3'末端互补成环，所述第一反向链的5'末端和 3'末端互补成环；当所述反向引物的5'末端包括A1片段时，所述第一正向链的两端均具 有所述A片段，所述第一反向链的两端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互补 配对，使所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的5'末端和3'末端均互 补形成环链；
[0014] 所述第一正向链和所述第一反向链在互补后，在聚合酶的催化下，所述第一正向 链和所述第一反向链作为模板进行延长扩增，得到第二反向链和第二正向链；
[0015] 将所述第二反向链和第二正向链解链，解链后的所述第二反向链和第二正向链作 为下一个延长扩增反应的模板进行扩增，分别得到所述第二反向链和所述第二正向链的互 补链，并循环进行，使得所述靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成所述靶核苷酸的扩 增。
[0016] 具体地，当所述靶核苷酸为RNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆 菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
[0017] 具体地，当所述靶核苷酸为DNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆 菌DNA聚合酶。
[0018] 具体地，所述恒温的温度为60_65°C。
[0019] 进一步地，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0. 2所示，所述反向引物的序 列如序列表中SEQ ID N0. 4或SEQ ID N0. 5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
[0020] 具体地，所述等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，所述解链温度调节剂为甜 菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
[0021] 具体地，在所述正向引物和所述反向引物中，所述A片段的长度小于所述B片段和 所述C片段的长度。
[0022] 又一方面，本发明实施例提供了一种检测上述靶核苷酸序列扩增的方法，在所述 等温扩增反应液中添加检测试剂，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的靶核苷酸，若电泳结 果得到清晰明亮的特征性条带，则靶核苷酸已扩增；若未出现特征性条带，则靶核苷酸未扩 增。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的引物能够高效进 行环形扩增并不断延长靶核苷酸，该引物与靶核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸 区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增。同时， 本发明提供的靶核苷酸扩增方法，其扩增过程在变性反应过程中无需的温度变化，且全程 的反应条件均在恒温条件下进行，进而避免了温度变化，提高了扩增的效率，在序列互补链 成环后，高效率的加长重复片段，利用该新型引物与核苷酸结合扩增出两端相同或互补的 核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增， 能够用于检测各种基因或基因突变的方法，与现有技术相比检测效率至少提高了 20倍，即 提高了灵敏度。同时，本发明提供的检测方法能够快速有效的检测出靶核苷酸是否扩增。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025] 图1是本发明实施例二提供的正向引物和反向引物的序列示意图；
[0026] 图2是本发明实施例二提供的正向链和反向引物互补以及反向链和正向引物互 补配对的示意图；
[0027] 图3是本发明实施例二提供的第三反向链和第三正向链的示意图；
[0028] 图4是本发明实施例二提供的第三正向链和反向引物以及第三反向链和正向引 物互补并进行扩增的示意图；
[0029] 图5是本发明实施例二提供的第四正向链和第四反向链的示意图；
[0030] 图6是本发明实施例二提供的第四正向链和反向引物以及第四反向链和正向引 物互补并进行扩增的示意图；
[0031] 图7是本发明实施例二提供的第一正向链和第一反向链的示意图；
[0032] 图8是本发明实施例二提供的第一正向链和第一反向链分别通过正向引物和反 向引物扩增，以及互补成环的示意图；
[0033] 图9是本发明实施例二提供的第二反向链和第二正向链的示意图；
[0034] 图10是本发明实施例二提供的解链后的第二反向链和第二正向链作为模板进行 扩增的示意图；
[0035] 图11是本发明实施例二提供的得到第二反向链和第二正向链的互补链的示意 图；
[0036] 图12是本发明实施例二提供的反应液A的电泳图；
[0037] 图13是本发明实施例二提供的反应液B较高浓度样本的电泳图，且泳道1为HAV DNA (1 X l(T15mol)，泳道 2 为 HCV DNA (1 X l(T15mol)，泳道 3 为 HBV DNA (-)，泳道 4 为 DL2000 的 Marker，泳道 5 为 HBV DNA (1 X l(T18mol)，泳道 6 为 HBV DNA (1 X lO'mol)，泳道 7 为 HBV DNA(lXl(T20mol);
[0038] 图14是本发明实施例二提供的反应液B低浓度样本的电泳图，且泳道1为HBV DNA (-)，泳道 2 为 HBV DNA (1 X l(T23mol)，泳道 3 为 HBV DNA (1 X l(T22mol)，泳道 4 为 HBV DNA (1 X l(T21mol)，泳道 5 为 DL2000 的 Marker ;
[0039] 图15是本发明实施例三提供的正向引物和反向引物的序列示意图；
[0040] 图16是本发明实施例三提供的正向链和反向引物互补以及反向链和正向引物互 补配对的示意图；
[0041] 图17是本发明实施例二提供的第二反向链和第二正向链的不意图；
[0042] 图18是本发明实施例三提供的第三正向链和反向引物以及第三反向链和正向引 物互补并进行扩增的示意图；
[0043] 图19是本发明实施例三提供的第四正向链和第四反向链的示意图；
[0044] 图20是本发明实施例三提供的第四正向链和反向引物以及第四反向链和正向引 物互补并进行扩增的示意图；
[0045] 图21是本发明实施例三提供的第一正向链和第一反向链的示意图；
[0046] 图22是本发明实施例三提供的第一正向链和第一反向链分别通过正向引物和反 向引物扩增，以及互补成环的示意图；
[0047] 图23是本发明实施例三提供的第二反向链和第二正向链的示意图；
[0048] 图24是本发明实施例三提供的解链后的第二反向链和第二正向链作为模板进行 扩增的示意图；
[0049] 图25是本发明实施例三提供的得到第二反向链和第二正向链的互补链的示意 图；
[0050] 图26是本发明实施例三提供的反应液C的样本电泳图，且泳道1为DL2000的 Marker，泳道 2 为 HBV DNA (1 X l(T21mol)，泳道 3 为 HBV DNA (1 X l(T22mol)，泳道 4 为 HBV DNA (1 X 10_23mol)，泳道 5 为 HBV DNA (-)。
【具体实施方式】
[0051] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。
[0052] 实施例一
[0053] 本发明实施例提供了一种引物，该引物适用于扩增靶核苷酸，该靶核苷酸包括互 补的正向链和反向链，正向链包括B片段和C片段，反向链包括B1片段和C1片段，该引物包 括正向引物和反向引物，正向引物的5'末端包括A片段，正向引物的3'末端包括B片段， 反向引物的5'末端包括A1片段或A片段，反向引物的3'末端包括C1片段，A片段与A1片 段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。
[0054] 进一步地，A片段可以包括10-20个碱基，且A片段的退火温度低于B片段和C片 段的退火温度。
[0055] 采用本发明提供的引物能够用于定量扩增靶核苷酸，该靶核苷酸可以为RNA链或 DNA链，当靶核苷酸为RNA链时，可以为丙肝病毒或肠道病毒71型核酸，当靶核苷酸为DNA 链时，可以为乙肝病毒或人乳头瘤病毒核酸等。
[0056] 具体地，当靶核苷酸为RNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合 酶和反转录聚合酶。
[0057] 具体地，当靶核苷酸为DNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合 酶。
[0058] 具体地，本发明实施例提供一种引物，该引物用于乙肝核酸定量检测，该引物的序 列如序列表中SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示，具体引物如下：
[0059] 选择乙肝特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information, NCBI)(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)，获得乙肝B基因型和C基因型的基因序列，在该基因序列的基因区选择一段保守序列 进行比对，该序列如序列表中 SEQ ID N0. 6 所示：GCGACGCGGYGATTGAGRCCTTCGTCTGCGAGGC GAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCSYCKKYVTCTAACAACASHAGTYTCCGGAAGTGTTGATAAGATAGGGGC A，序列中 Y = C 或 T，K = G 或 T，V = A、C 或 G，S = C 或 G，R = A 或 G，H = A、C 或 T。利 用实时PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应）的专业引物设计软件Primer Premierf. 0设计引物序列，引物序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保乙肝引物序 列能检测全部B基因型和C基因型的序列。
[0060] 具体地，B片段可以选取扩增区保守性强的约15-30个碱基的序列，C片段可以选 取扩增区保守性强的约15-30个碱基的互补序列，且B片段和C片段可以为靶核苷酸的正 向链中的根据设计软件筛选出的最佳引物序列。
[0061] 具体引物序列参见表1，具体引物的组合见表2 :
[0062] 表1. A组引物
[0063]
【权利要求】
1. 一种引物，其特征在于，所述引物适用于扩增靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正 向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述 引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末 端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3' 末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C 片段与所述C1片段互补。
2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示。
3. -种扩增靶核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括： 提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C 片段，所述反向链包括B1片段和C1片段； 加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反向引 物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增； 所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反 向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A 片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述Cl片段互补； 所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反向引 物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片 段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末端 和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别通过所述A片段和所述A1片段互补 形成环链，所述第一正向链的5'末端和3'末端互补成环，所述第一反向链的5'末端和3' 末端互补成环；当所述反向引物的5'末端包括A1片段时，所述第一正向链的两端均具有 所述A片段，所述第一反向链的两端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互补配 对，使所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的5'末端和3'末端均互补 形成环链； 所述第一正向链和所述第一反向链在互补后，在聚合酶的催化下，所述第一正向链和 所述第一反向链作为模板进行延长扩增，得到第二反向链和第二正向链； 将所述第二反向链和第二正向链解链，解链后的所述第二反向链和第二正向链作为 下一个延长扩增反应的模板进行扩增，分别得到所述第二反向链和所述第二正向链的互补 链，并循环进行，使得所述靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成所述靶核苷酸的扩增。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述靶核苷酸为RNA链时，所述等温扩 增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述靶核苷酸为DNA链时，所述等温扩 增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒温的温度为60-65°C。
7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示，所述祀核苷 酸的序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应液中包括解链温度调 节剂，所述解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
9. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述正向引物和所述反向引物中，所述 A片段的长度小于所述B片段和所述C片段的长度。
10. -种检测如权利要求3所述的靶核苷酸扩增的方法，其特征在于，在所述等温扩增 反应液中添加检测试剂，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的靶核苷酸，若电泳结果得到清 晰明亮的特征性条带，则靶核苷酸已扩增；若未出现特征性条带，则靶核苷酸未扩增。
【文档编号】C12Q1/68GK104195135SQ201410381499
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月5日 优先权日:2014年8月5日
【发明者】刘映乐, 罗虹, 唐景峰 申请人:武汉海帝客生物科技有限公司