一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法
【专利摘要】本发明提供一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，种特异性引物对包括：上游引物FL680：TTTGGGCACCCAGAAGTCTA?CATT；下游引物RL1057：TACAGACGAGTTAGCGAGAACA。利用辣椒实蝇的mt?DNA?COⅠ中设计种特异性引物对，通过SS-PCR扩增，如果被鉴别生物体属于辣椒实蝇种，则能够扩增出一条长度为378bp的特异条带；反之，如果被鉴别生物体不属于辣椒实蝇种，则不能扩增出目的条带。具体具有以下优点：特异性强、检测结果更加简单、快捷，大大缩短了辣椒实蝇的鉴定周期。可以快速、准确、特异性地检测出辣椒实蝇的各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
【专利说明】一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对、试剂盒及 鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种用于快速鉴定辣椒实蝇的 种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 辣椒实妮，拉丁 学名为：Bactrocera (Bactrocera) latifrons (Hendel)，属双翅 目（Diptera)实妮科（Tephritidae)果实妮属（Bactrocera)果实妮亚属（Bactrocera)。 辣椒实蝇是农业上的重要害虫，其是农业上水果和蔬菜的重要害虫，其生活习性为：成虫 产卵于果实皮下，幼虫孵化后钻入果内取食，使果实变质或腐烂，从而影响果蔬品质。辣 椒实蝇原产于南亚和东南亚，目前主要分布中国、印度、马来西亚、巴基斯坦、斯里兰卡、泰 国、老挺等，但是近年来又在夏威夷、日本、汤加及非洲的部分区域定殖（Mwatawala M，De Meyer M, White I et al,2007 ；Mwatawala M, Makundi R, Maerere AP, DE MEYER M. ,2010 ； Rwomushana I,Ekesi S, Gordon I, Ogol CK. , 2010 ；Liquido NJ, Harris EJ, Dekker LA., 1994 ；Peck SL, McQuate GT. , 2004 ；Meeyen K, Nanork Sopaladawan P, Pramual P. ,2014)〇 国内主要分布于台湾及云南省的畹町和瑞丽（梁广勤等，1989)。
[0003] 辣椒实蝇的传播途径为：以卵、幼虫或蛹随被害果传播。随着我国国内、以及我国 与其他国家间贸易和旅游业的快速发展，辣椒实蝇扩散几率越来越高，因此，在进出境的果 蔬中，如何快速准确的鉴别其是否携带有辣椒实蝇疫情，从而保证我国农业生产安全，具有 重要现实意义。
[0004] 由于对辣椒实蝇的成虫形态鉴别远比对幼虫、卵或蛹的鉴别容易，因此，目前的检 疫监管机构，通常采用的辣椒实蝇疫情的鉴别方法为形态学鉴别方法，即：首先将截获的 实蝇幼虫、卵或蛹在室内饲养为成虫，然后通过观察成虫形态，而鉴别其是否为辣椒实蝇。 该种鉴别方法存在的主要问题为：（1)将幼虫、卵或蛹饲养为成虫，需要花费较长的时间， 严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；（2)如果截获果蔬中实蝇的头、胸、腹、翅、足等残 体，由于无法将上述残体饲养为成虫，因此，无法准确识别所截获的残体是否为辣椒实蝇的 残体，具有较大的鉴别局限性。
[0005] 因此，现有技术中，迫切需要一种可克服形态学鉴别方法的不足、能够快速准确鉴 定辣椒实蝇的鉴别方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引 物对、试剂盒及鉴定方法，能够快速准确的对截获的疑似辣椒实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、 胸、翅、腹、足等残体进行鉴别。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明第一目的为提供一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对，包括上游 弓丨物FL680和下游引物RL1057 ;
[0009] 所述上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0010] 所述下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 本发明第二目的为提供一种用于快速鉴定辣椒实蝇的试剂盒，所述试剂盒包括 SS-PCR反应试剂和引物；所述引物包括：
[0012] 上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0013] 下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014] 优选的，所述SS-PCR反应试剂包括：双蒸水8. 5ul、2XEasyTaq PCR SuperMixl2.5ul、上游引物 FL680 lul、下游引物 RL1057 lul。
[0015] 本发明第三目的为提供一种采用上述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方 法，包括以下步骤：
[0016] S1，设计辣椒实蝇的种特异性引物对；其中，所述辣椒实蝇的种特异性引物对包 括：上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；下游引物RL1057的核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 所示；
[0017] S2,提取被鉴定生物体的DNA，并利用通用型引物LC01490和HC02198进行实蝇样 本DNA的质量检测；该通用型引物序列为：
[0018] LC01490 ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTG ；
[0019] HC02198 ： TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA ；
[0020] S3,以所述被鉴定生物体的DNA为模板，使用所述辣椒实蝇的种特异性引物对对 所述被鉴定生物体的DNA进行SS-PCR扩增；
[0021] S4,采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有378bp的 特征条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为辣椒实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为 辣椒实蝇种。
[0022] 优选的，S1中，通过以下方法设计得到辣椒实蝇的种特异性引物对：
[0023] S1. 1，选用辣椒实蝇的标本，采用试剂盒法从所述辣椒实蝇的标本中提取辣椒实 蝇的基因组DNA;
[0024] 通过NCBI数据库查找辣椒实蝇已公布的登录基因序列；通过对所述目标序列和 所述已公布的登录基因序列进行比较分析，最后选定登录号为FJ903490的基因序列，下 载该登录号的FASTA格式的基因序列；利用Primer-Premier 5. 0设计引物，再利用Oligo 6. 44对所设计的引物进行评价，最后利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同 源序列，通过筛选获得所述辣椒实蝇的种特异性引物对。
[0025] 优选的，S2中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫 生物形态的DNA、来自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA ;
[0026] 其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足。
[0027] 优选的，S3中，DNA模板的浓度为25. 21 X Krtig/ul ;
[0028] S3 中，所述 SS-PCR扩增的反应体系组成为：2XEasyTaq PCR SuperMixl2. 5ul，模 板DNA 2ul，上游引物lul，下游引物lul，最后用双蒸水将反应体系补至25ul。
[0029] 优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：93?95 °C预变性4?6min ;93?95 °C 变性35?45s ;退火温度50?60°C，25?35s ;72°C延伸0. 5?1. 5min ;20?30个循环， 最后72°C延伸7?lOmin停止反应。
[0030] 优选的，所述SS-PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性40s ;退火温 度55°C，30s ;72°C延伸l.Omin ;25个循环，最后72°C延伸8min停止反应。
[0031] 优选的，S4中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是 否含有378bp的特征条带，具体为：
[0032] S4. 1，提取 SS-PCR 扩增后的 5ul SS-PCR 产物；
[0033] S4. 2,在含DNA染色剂的1. 5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ulSS-PCR 产物120V电泳30min ;
[0034] S4. 3,利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出378bp的特征条带。
[0035] 本发明提供的用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，在 辣椒实蝇的基因组DNA中设计种特异性引物对，通过SS-PCR扩增，如果被鉴别生物体属于 辣椒实蝇种，则能够扩增出一条长度为378bp的特异条带；反之，如果被鉴别生物体不属于 辣椒实蝇种，则不能扩增出目的条带。具体具有以下优点：
[0036] (1)种特异性引物对更加特异，扩增效率更高，结果判断更加直观、便捷；
[0037] (2)检测结果更加简单、快捷，6-8小时内即可完成检测与鉴定，传统形态学鉴定 中，需要饲养15天得到成虫再进行鉴定；可见，本发明大大缩短了辣椒实蝇的鉴定周期；
[0038] (3)本发明提供的种特异性引物对，可以快速、准确、特异性地检测出辣椒实蝇的 各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为本发明比较例一提供的电泳检测结果图；
[0040] 图2为本发明比较例五提供的电泳检测结果图；
[0041] 图3为本发明比较例六提供的电泳检测结果图；
[0042] 图4为本发明试验例一提供的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0043] 本发明提供的用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对、试剂盒及鉴定方法，能 够快速可靠的对截获的疑似辣椒实蝇的幼虫、卵、蛹，以及头、胸、翅、足等残体进行鉴别。具 有检测结果可靠、对辣椒实蝇特异性高的优点。
[0044] 以下通过具体的比较例或试验例，证明本发明提供的种特异性引物对的特异性和 可靠性：
[0045] 比较例一
[0046] (1)本发明设计的种特异性引物序列如下所示：
[0047] 上游引物 FL680 : TTTGGGCACCCAGAAGTCTACATT ;
[0048] 下游引物 RL1057 :TACAGACGAGTTAGCGAGAACA。
[0049] (2)选取试验样：
[0050] 本发明所选取的阴性对照样，均为不同种类的实蝇，与辣椒实蝇属于近缘种范围， 具体选取下列阴性对照样，分别为：
[0051] 阴性对照样 1-番石槽实妮 Bactrocera (Bactrocera) correcta (Bezzi)
[0052] 阴性对照样 2_ 桔小实妮 Β· (Β· ) dorsails (Hendel)
[0053] 阴性对照样 3-颜带实蝇 B. (B. ) cilifer (Hendel)
[0054] 阴性对照样 4_ 镑实妮 Β· (Β· ) rubigina (Wang&Zhao)
[0055] 阴性对照样 5-瑞丽果实蝇 Β· (B. )ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.
[0056] 阴性对照样 6_ 瘤胚实蝇 B. (B. ) tuberculata(Bezzi)
[0057] 阴性对照样 7_ 杨桃实妮 Β· (B. ) carambolae Drew&Hancock
[0058] 阴性对照样 8_ 普通果实妮 B. (Zeugodacus) caudate (Fabricius)
[0059] 阴性对照样 9_ 瓜实蝇 B. (Z. ) cucurbitae (Coquillett)
[0060] 阴性对照样11-南瓜实蝇B. (Z. ) tau (Walker)
[0061] 阴性对照样 12-具条实蝇 B. (Z. ) scutellata(Hendel)
[0062] 阴性对照样 13-近黑颜实蝇 Β· (Z. ) parater (Zhao&Lin)
[0063] 阴性对照样 14-黑膝实蝇 Β· (Z. ) scutellaris (Bezzi)
[0064] 阴性对照样 15-漠寡鬃实妮、B. (Asiadacus)modica(Hardy)
[0065] 阴性对照样 16-何氏华实妮 B. (Sinodacus)hochii (Zia)
[0066] 阴性对照样 I7-麥实妮 Carpomya vesuviana Costa
[0067] 阴性对照样 18-瓜棍腹实妮 Dacus (Callantra) longicornis Wiedemann
[0068] 阴性对照样 19-腿端黑实妮 B. atrifemur Drew&Hancock
[0069] 阴性对照样 20-黑颜实蝇 B. diaphora Coquillett
[0070] 阴性对照样 21-五指山实妮 Β· (Β· ) wuzhishana Lin et Yang, sp. nov
[0071] 选取阳性对照样为：阳性对照样10-成虫形态的辣椒实蝇；
[0072] (3)DNA提取：分别对阴性对照样1-9、11_21，以及阳性对照样10提取DNA。其中， DNA提取方法为试剂盒提取方法。
[0073] (4) SS-PCR扩增：分别以所提取的阴性对照样1-9和11-21，以及阳性对照样10的 DNA为模板，使用辣椒实蝇的种特异性引物对对各个样品的DNA进行SS-PCR扩增。
[0074] SS-PCR 反应体系组成为：2XEasyTaq PCR SuperMix 12. 5ul，模板 DNA 2ul，上游 引物lul，下游引物lul，最后用双蒸水将反应体系补至25ul。
[0075] SS-PCR反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性40s ;退火温度55°C，30s ;72°C延 伸1. Omin ;25个循环，最后72°C延伸8min停止反应。
[0076] (5)电泳检测：提取步骤（4)的扩增产物5ul ;用含DNA染色剂的1. 5%的琼脂糖凝 胶多功能电泳仪上，对各扩增产物120V电泳30min ;利用凝胶成像分析仪观察电泳后的检 测结果图。检测结果如图1所示，其中，M:50bp DNALadder，l :番石榴实蝇，2 :桔小实蝇，3 : 颜带实蝇，4 :锈实蝇，5 :瑞丽果实蝇，6 :瘤胫实蝇，7 :杨桃实蝇，8 :普通果实蝇，9 :瓜实蝇， 10 :成虫形态的辣椒实蝇，11 :南瓜实蝇，12 :具条实蝇，13 :近黑颜实蝇，14 :黑膝实蝇，15 : 滇寡鬃实蝇，16 :何氏华实蝇，17 :枣实蝇，18 :瓜棍腹实蝇，19 :腿端黑实蝇，20 :黑颜实蝇， 21 :五指山实蝇。
[0077] 从检测结果图可以看出，阴性对照样1-9和11-21均没有出现378bp的特征条带。 而阳性对照样10出现378bp的特征条带。
[0078] 基于同样的检测方法，仅改变阳性对照样10,将阳性对照样10分别替换为：幼虫 形态的辣椒实蝇、卵形态的辣椒实蝇、蛹形态的辣椒实蝇、辣椒实蝇的头部位、辣椒实蝇的 胸部位、腹部位、辣椒实蝇的翅部位和辣椒实蝇的足部位，进行上述的鉴定试验，所得到的 电泳检测图均与图1相同。
[0079] 因此，通过本比较例，一方面，本发明提供的种特异性引物对，在实验涉及的实蝇 种类范围内，能够特异性的鉴定辣椒实蝇，具有较强的特异性；另一方面，由于辣椒实蝇的 各个虫态甚至残体均出现378bp的特征条带，说明本发明提供的种特异性引物对，可以快 速、准确、特异性地检测出辣椒实蝇的各个虫态甚至残体，具有检测范围大的优点。
[0080] 比较例二
[0081] 本比较例与比较例一唯一的不同在于：
[0082] SS-PCR反应条件为：93°C预变性4min ;95°C变性45s ;退火温度50°C，25s ;72°C延 伸1. 5min ;20个循环，最后72°C延伸7min停止反应。
[0083] 试验结果与比较例一相同，S卩：阴性对照样1-20均没有出现378bp的特征条带。 而阳性对照样1-8均出现378bp的特征条带。
[0084] 比较例三
[0085] 本比较例与比较例一唯一的不同在于：
[0086] SS-PCR反应条件为：95°C预变性6min ;93°C变性35s ;退火温度60°C，35s ;72°C延 伸0. 5min ;30个循环，最后72°C延伸lOmin停止反应。
[0087] 试验结果与比较例一相同，S卩：阴性对照样1-20均没有出现378bp的特征条带。 而阳性对照样1-8均出现378bp的特征条带。
[0088] 比较例四
[0089] 采用以下8种样品：样品1和样品2均为饲养后获得的成虫；样品3和样品4均 为幼虫；样品5和样品6均为卵；样品7和样品8均为饲养后获得的蛹；其中，样品1、2、7、 8为通过饲养得到的对应虫态；样品3、4、5、6为检疫监管机构截获的样品；
[0090] 分别从样品1-样品8提取DNA ;然后，采用与比较例一相同的SS-PCR扩增和电泳 检测方法，检测结果为：样品1、样品3、样品5和样品7均出现378bp的特征条带；而样品2、 样品4、样品6和样品8均没有出现378bp的特征条带。因为，采用本发明提供的鉴定方法， 鉴定结论为：样品1为辣椒实蝇的成虫、样品3为辣椒实蝇的幼虫、样品5为辣椒实蝇的卵、 样品7为辣椒实蝇的蛹。而样品2、样品4、样品6和样品8均不为辣椒实蝇的不同虫态。
[0091] 将样品饲养为成虫，然后观察成虫的形态，得出以下结论：样品3、样品5和样品7 饲养得到的成虫均为辣椒实蝇。而样品4饲养得到的成虫为南瓜实蝇；样品6饲养得到的 成虫为黑膝实蝇；样品8饲养得到的成虫为具条实蝇。因此，通过成虫饲养，验证了本发明 提供的基于种特异性引物对鉴定方法的准确性和可靠性。
[0092] 由此可见，本发明提供的鉴定方法，不受虫态的限制。
[0093] 比较例五
[0094] 采用比较例一的鉴定方法，仅改变试验材料种类，进行种特异性验证。得到如图2 所示的电泳检测图，其中，M :50bp DNA Ladder，1-24代表被检测样品的种类，具体为：
[0095] 1 :泰国辣椒实蝇（1);
[0096] 2 :泰国辣椒实蝇（2);
[0097] 3 :老挝辣椒实蝇（1);
[0098] 4 :老挝辣椒实蝇⑵；
[0099] 5 :老挝辣椒实蝇⑶；
[0100] 6 :马来西亚辣椒实蝇（1);
[0101] 7 :马来西亚辣椒实蝇（2);
[0102] 8 :马来西亚辣椒实蝇（3);
[0103] 9:印度辣椒实蝇（1);
[0104] 10:印度辣椒实蝇⑵；
[0105] 11:日本辣椒实蝇（1);
[0106] 12 :日本辣椒实蝇（2);
[0107] 13 :日本辣椒实蝇（3);
[0108] 14 :桔小实蝇；
[0109] 15 :颜带实蝇；
[0110] 16:番石榴实蝇；
[0111] 17:锈实蝇；
[0112] 18:瑞丽果实蝇；
[0113] 19 :杨桃实蝇；
[0114] 20:普通果实蝇；
[0115] 21:瓜实蝇；
[0116] 22:南瓜实蝇；
[0117] 23:具条实蝇；
[0118] 24:空白对照（ddH20)。
[0119] 其中，上述样品名称中，括号中数字的含义代表该样品被截获的批次；如：11 :日 本辣椒实蝇（1)，代表第1批次截获的日本辣椒实蝇；12 :日本辣椒实蝇（2)，代表第2批次 截获的日本辣椒实蝇；13 :日本辣椒实蝇（3)，代表第3批次截获的日本辣椒实蝇。
[0120] 由图2可以看出，样品1-13,为来自不同国家不同批准的辣椒实蝇，其均出现了 378bp的特征条带；而对于其他种类的实蝇，即样品14-24,均没有出现378bp的特征条带。
[0121] 通过本比较例，进一步验证了本发明上游引物FL680和下游引物RL1057的种特异 性。
[0122] 比较例六
[0123] 采用比较例二的鉴定方法，仅改变试验材料种类，进行种特异性验证。得到如图3 所示的电泳检测图，其中，M :50bp DNA Ladder，1-9代表被检测样品的种类，具体为：
[0124] 1-幼虫形态的泰国辣椒实蝇；
[0125] 2-卵形态的泰国辣椒实蝇；
[0126] 3-蛹形态的泰国辣椒实蝇；
[0127] 4-泰国辣椒实蝇的头部位；
[0128] 5-泰国辣椒实蝇的翅部位；
[0129] 6-幼虫形态的马来西亚辣椒实蝇；
[0130] 7-卵形态的马来西亚辣椒实蝇；
[0131] 8-蛹形态的马来西亚辣椒实蝇；
[0132] 9:空白对照 ddH20。
[0133] 由图3可以看出，样品1-8,为来自不同国家不同虫态的辣椒实蝇，其均出现了 378bp的特征条带。
[0134] 通过本比较例，进一步验证了本发明上游引物FL680和下游引物RL1057的种特异 性。
[0135] 试验例一
[0136] 本试验例用于检测SS-PCR扩增反应的灵敏度。
[0137] 选择条带最亮的DNA模板，利用核酸蛋白分析仪测得DNA模板浓度为25. 21ng/ul， 将其按10'1〇_2、1〇_3倍梯度稀释，然后在比较例一其他检测条件均不变的条件下，将DNA 模板浓度采用 25. 21*10〇ng/ul、25. 21*10-1叩/111、25· 21*l(T2ng/ul、25· 21*l(T3ng/ul 进行 对照试验；电泳检测结果如图4所示，其中：M :50bp DNA Ladder ;
[0138] 1 :25. 21*10°ng/ul的DNA模板浓度检测条件
[0139] 2 :25. 的DNA模板浓度检测条件
[0140] 3 :25. 21*10_2ng/ul的DNA模板浓度检测条件
[0141] 4 :25. 21*10_3ng/ul的DNA模板浓度检测条件
[0142] 5:空白对照 ddH20
[0143] 从图4可以看出，DNA模板浓度的最低检测率值为25. 21*10_2ng/ul ;最适DNA模 板浓度为25. 21*10-1叫/111。
[0144] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种用于快速鉴定辣椒实蝇的种特异性引物对，其特征在于，包括上游引物FL680 和下游引物RL1057 ; 所述上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 所述下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2. -种用于快速鉴定辣椒实蝇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SS-PCR反应试 剂和引物；所述引物包括： 上游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示； 下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 根据权利要求2所述的用于快速鉴定辣椒实蝇的试剂盒，其特征在于，所述SS-PCR 反应试剂包括：双蒸水 8. 5ul、2XEasyTaq PCR SuperMix 12. 5ul、上游引物 FL680 lul、下 游引物 RL1057 lul。
4. 一种采用权利要求1所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在 于，包括以下步骤： S1，设计辣椒实蝇的种特异性引物对；其中，所述辣椒实蝇的种特异性引物对包括：上 游引物FL680的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；下游引物RL1057的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 52, 提取被鉴定生物体的DNA，并利用通用型引物LC01490和HC02198进行实蝇样本 DNA的质量检测；该通用型引物序列为： LC01490 ：GGTCAACAAATCATAAAGATATTG ； HC02198 ：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA ； 53, 以所述被鉴定生物体的DNA为模板，使用所述辣椒实蝇的种特异性引物对对所述 被鉴定生物体的DNA进行SS-PCR扩增； 54, 采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有378bp的特征 条带，如果含有，则所述被鉴定生物体为辣椒实蝇种；反之，则所述被鉴定生物体不为辣椒 实蝇种。
5. 根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，S1 中，通过以下方法设计得到辣椒实蝇的种特异性引物对： S1. 1，选用辣椒实蝇的标本，采用试剂盒法从所述辣椒实蝇的标本中提取辣椒实蝇的 基因组DNA ; 通过NCBI数据库查找辣椒实蝇已公布的登录基因序列；通过对所述目标序列和所述 已公布的登录基因序列进行比较分析，最后选定登录号为FJ903490的基因序列，下载该登 录号的FASTA格式的基因序列；利用Primer-Premier 5.0设计引物，再利用Oligo 6. 44对 所设计的引物进行评价，最后利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列， 通过筛选获得所述辣椒实蝇的种特异性引物对。
6. 根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，S2 中，所述被鉴定生物体的DNA具体为：来自卵生物形态的DNA、来自幼虫生物形态的DNA、来 自蛹生物形态的DNA、来自生物残体的DNA ; 其中，所述生物残体指头、胸、腹、翅或足。
7. 根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，S3 中，DNA模板的浓度为25. 21 X KTng/ul ; S3中，所述SS-PCR扩增的反应体系组成为：2XEasyTaq PCR SuperMixl2.5ul，模板 DNA 2ul，上游引物lul，下游引物lul，最后用双蒸水将反应体系补至25ul。
8. 根据权利要求7所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，所 述SS-PCR扩增的反应条件为：93?95°C预变性4?6min ;93?95°C变性35?45s ;退火 温度50?60°C，25?35s ;72°C延伸0· 5?L 5min ;20?30个循环，最后72°C延伸7? lOmin停止反应。
9. 根据权利要求8所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，所 述SS-PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性40s ;退火温度55°C，30s ;72°C延 伸1. Omin ;25个循环，最后72°C延伸8min停止反应。
10. 根据权利要求4所述的种特异性引物对快速鉴定辣椒实蝇的方法，其特征在于，S4 中，所述采用电泳检测SS-PCR扩增产物，判断所述SS-PCR扩增产物是否含有378bp的特征 条带，具体为： S4. 1，提取SS-PCR扩增后的5ul SS-PCR产物； S4. 2,在含DNA染色剂的1. 5%的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上，对所述5ulSS-PCR产物 120V 电泳 30min ; S4. 3,利用凝胶成像分析仪检测电泳后是否扩增出378bp的特征条带。
【文档编号】C12N15/11GK104152571SQ201410424469
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】黄振, 郭琼霞, 娄定风, 邓裕亮, 陈韶萍, 黄可辉 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心