一种鸡卵清提取液细胞培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡卵清提取液细胞培养基，按照体积百分比由以下组分构成：65％-75％的DMEM/F-12 1:1培养基，5％-15％胎牛血清和15％-25％鸡卵清提取液。本发明还提供一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，本发明的鸡卵清提取液成本低，获取容易，当添加到细胞培养基中，可以更好地促进间充质干细胞(包括骨髓来源和脐带来源)生长与增殖，这样我们可以减少胎牛血清的比例到10％，再加20％的鸡卵清提取液，而间充质干细胞的生长状况会好于传统用20％的胎牛血清培养基，而节约了一半的胎牛血清，成本降低一半，而促细胞生长与增殖作用则更好。
【专利说明】
一种鸡卵清提取液细胞培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种鸡卵清提取液细胞培养基，本发明还涉及一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞[mesenchymal stem cells,MSC]是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。传统用于间充质干细胞培养的细胞培养基要添加20%的胎牛血清，才能促进间充质干细胞更好地生长，而胎牛血清价格昂贵，获取困难，多依靠进口。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种鸡卵清提取液细胞培养基，解决了现有技术中存在的细胞培养基价格昂贵的问题。
[0004]本发明的另一个目的是提供一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法。
[0005]本发明所采用的第一技术方案是，一种鸡卵清提取液细胞培养基，按照体积百分比由以下组分构成:65%-75%的DMEM/F-12 1:1培养基，5%-15%胎牛血清和15%-25%鸡卵清提取液，以上组分总量为100%。
[0006]本发明的特点还在于，
[0007]鸡卵清提取液通过以下方法获得:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C ;冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存。
[0008]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化钠，2-8mmol/L的氯化镁，90-110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇,0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1-3 μ g/mL的抑肽酶。
[0009]4-羟乙基哌嗪乙磺酸的pH为8.2。
[0010]DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0011 ] 本发明所采用的第二技术方案是，一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:
[0012]步骤1、取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C，冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存，由此得到的提取液为卵清提取液；提取液标记制备时间，分装保存于4°C ；
[0013]步骤2、按照体积百分比量取65%-75% DMEM/F-12 1:1培养基，5%-15%胎牛血清和15% -25%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基。
[0014]本发明的特点还在于，
[0015]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化钠，2-8mmol/L的氯化镁，90-110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇,0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和
1-3 μ g/mL的抑肽酶。
[0016]DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0017]本发明的有益效果是:本发明的鸡卵清提取液成本低，获取容易，当添加到细胞培养基中，可以更好地促进间充质干细胞(包括骨髓来源和脐带来源)生长与增殖，这样我们可以减少胎牛血清的比例到10%，再加20%的鸡卵清提取液，而间充质干细胞的生长状况会好于传统用20%的胎牛血清培养基，而节约了一半的胎牛血清，成本降低一半，而促细胞生长与增殖作用则更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明鸡卵清提取液细胞培养基与传统的培养基的促间充质干细胞生长与增殖的作用的对比图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0020]本发明提供一种鸡卵清提取液细胞培养基，按照体积百分比由以下组分构成:65%-75%的DMEM/F-12 1:1培养基(厂家HyClone，含2.5mM L-谷氨酰胺，15mM4_羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) )，5%-15%的胎牛血清(金牌间充质干细胞专用胎牛血清，厂家BI)，20%鸡卵清提取液(自制)，以上组分总量为100%。
[0021]鸡卵清提取液通过以下方法获得:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C ;冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存。
[0022]裂解液配方:45-55mmol/L的氯化钠(NaCl)，2-8mmol/L 的氯化镁(MgCl2)，90-11OmmoI/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)，0.05-0.15mmol/L 的苯甲基横酸氟(PMSF)和 1-3 μ g/mL 的抑妝酶(aprotinin)。
[0023]其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的pH为8.2。
[0024]传统的间充质干细胞培养基是用80% DMEM/F-12 1:1培养基，和20 %胎牛血清，胎牛血清价格昂贵，在该组分中，三种成分都是关键组分。DMEM/F-12 1:1培养基和胎牛血清是传统组分，而我们加了 15% -25%的鸡卵清提取液，是因为我们在研究中发现，15% -25%的鸡卵清提取液促进间充质干细胞增殖，而采用鸡卵清提取液，获取方便，比胎牛血清成本低，效果好。鸡卵清提取液大于25%不能很好地促进细胞增殖，小于15%也不能很好地促进细胞增殖，经过我们研究，发现15% -25%终浓度的鸡卵清提取液是最好的促间充质干细胞增殖的浓度，其中以20%为最佳。
[0025]本发明还提供一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:
[0026]步骤1、取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C，冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存，裂解液配方:45-55mm0l/L的氯化钠，
2-8mmol/L的氯化镁,90_110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸,0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和I_3 μ g/mL的抑肽酶，由此得到的提取液为卵清提取液；提取液标记制备时间，分装保存于4°C ;待用。
[0027]步骤2、按照体积百分比量取65%-75%DMEM/F-12 1:1培养基，5%-15%胎牛血清和15% -25%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基。
[0028]在制备方法中，本方法的关键的试剂是裂解液，裂解液能较好地保存鸡卵清提取液，使鸡卵清提取液不易污染，也不易降解。
[0029]本方法关键的参数是整个提取过程保证无菌，裂解液中含二硫苏糖醇(DTT)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，抑肽酶(aprotinin)，它们的作用是保持提取液中蛋白的稳定性，而且均可采用国产试剂，价格便宜，效果好。经过多次实验，证明裂解液配好后，过滤除菌，与鸡卵清按1:1比例混合后，混匀，并冻融3次后，可有效地提出鸡卵清中的有效成分，用于细胞的共培养。
[0030]实施例1
[0031]一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°c。冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存。裂解液配方:50mmol/L氯化钠，5mmol/L氯化镁，100mmol/L4-轻乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), lmmol/L 二硫苏糖醇,0.lmmol/L苯甲基磺酰氟和2 μ g/mL抑肽酶。由此得到的提取液为卵清提取液，分装保存于4°C，待用。按照体积百分比量取70% DMEM/F-121:1培养基，10%胎牛血清和20%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基。
[0032]见图1，利用上述鸡卵清提取液细胞培养基用于间充质干细胞培养，最后促间充质干细胞生长与增殖的作用比原来20%胎牛血清的培养基还要好。
[0033]我们将培养基添加20%鸡卵清提取液，在96孔板中将细胞以每孔50ul (5 X 13个细胞)加入，再加入50ul培养基(普通培养基和20%鸡卵清提取液培养基)，各加10孔，共培养4天后,加入Promega的检测增殖活性的试剂20ul/孔,3小时后490nm比色,结果取均值土标准差(η = 10)，普通培养基的OD均值为0.8±0.02，20%鸡卵清提取液培养基OD均值为1.3±0.04，结果表明20%鸡卵清提取液培养基促间充质干细胞增殖效果强于普通培养基，差别有统计学意义(*Ρ〈0.01)。
[0034]实施例2
[0035]一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按I: I加裂解液，充分搅匀，存放于4°c，冻融3次后离心，离心取上清,4°C保存,裂解液配方:45mmol/L的氯化钠，8mmol/L的氯化镁,90mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 1.5mmol/L的二硫苏糖醇,0.05mmol/L的苯甲基磺酰氟和3 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液为卵清提取液；卵清提取液标记制备时间，分装保存于4°C ;按照体积百分比量取65% DMEM/F-12 1:1培养基，15%胎牛血清和20%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基，DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
[0036]实施例3
[0037]—种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按I: I加裂解液，充分搅匀，存放于4°c，冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存,裂解液配方:55mmol/L的氯化钠，2mmol/L的氯化镁，110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 0.5mmol/L的二硫苏糖醇,0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和I μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液为卵清提取液；卵清提取液标记制备时间，分装保存于4°C ；按照体积百分比量取75% DMEM/F-12 1:1培养基，5%胎牛血清和20%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基，DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
[0038]实施例4
[0039]一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按I: I加裂解液，充分搅匀，存放于4°c，冻融3次后离心，离心取上清,4°C保存,裂解液配方:48mmol/L的氯化钠，4mmol/L的氯化镁,95mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2), 0.8mmol/L的二硫苏糖醇,0.08mmol/L的苯甲基磺酰氟和1.5 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液为卵清提取液；卵清提取液标记制备时间，分装保存于4°C ；按照体积百分比量取73% DMEM/F-12 1:1培养基，12%胎牛血清和15%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基，DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的 HEPES。
[0040]实施例5
[0041]一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，具体按照以下步骤实施:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按I: I加裂解液，充分搅匀，存放于4°c，冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存,裂解液配方:52mmol/L的氯化钠，6mmol/L的氯化镁，105mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸(pH8.2),0.12mmol/L的二硫苏糖醇,0.12mmol/L的苯甲基磺酰氟和2.5 μ g/mL的抑肽酶。由此得到的提取液为卵清提取液；卵清提取液标记制备时间，分装保存于4°C;按照体积百分比量取67% DMEM/F-12 1:1培养基，8%胎牛血清和25%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基，DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的HEPES。
【权利要求】
1.一种鸡卵清提取液细胞培养基，其特征在于，按照体积百分比由以下组分构成:65% -75%的DMEM/F-12 1:1培养基，5% -15%胎牛血清和15% -25%鸡卵清提取液，以上组分总量为100%。
2.根据权利要求1所述的鸡卵清提取液细胞培养基，其特征在于，所述鸡卵清提取液通过以下方法获得:取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C ;冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存。
3.根据权利要求2所述的鸡卵清提取液细胞培养基，其特征在于，所述裂解液配方:45_55mmol/L的氯化钠,2_8mmol/L的氯化镁,90_110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸，0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1_3 μ g/mL的抑肽酶。
4.根据权利要求3所述的鸡卵清提取液细胞培养基，其特征在于，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的PH为8.2。
5.根据权利要求1所述的鸡卵清提取液细胞培养基，其特征在于，所述DMEM/F-121:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
6.一种鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施: 步骤1、取一个鸡蛋，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1:1加裂解液，充分搅匀，存放于4°C，冻融3次后离心，离心取上清，4°C保存，由此得到的提取液为卵清提取液；提取液标记制备时间，分装保存于4°C ； 步骤2、按照体积百分比量取65% -75% DMEM/F-12 1:1培养基，5% -15%胎牛血清和15% -25%鸡卵清提取液，制备得到鸡卵清提取液细胞培养基。
7.根据权利要求6所述的鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述裂解液配方:45_55mmol/L的氯化钠,2_8mmol/L的氯化镁,90_110mmol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸，0.5-1.5mmol/L的二硫苏糖醇，0.05-0.15mmol/L的苯甲基磺酰氟和1_3 μ g/mL的抑肽酶。
8.根据权利要求6所述的鸡卵清提取液细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述DMEM/F-12 1:1培养基包括2.5mM的L-谷氨酰胺和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
【文档编号】C12N5/0775GK104342403SQ201410424441
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】阮光萍, 潘兴华, 姚翔, 刘菊芬, 王金祥 申请人:成都军区昆明总医院