高纯度天然胶原纤维及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度天然胶原纤维及其制备方法，其特点是以新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱为原料，通过预处理、浸水、超临界二氧化碳流体脱脂、浸碱、第一次酶处理、浸酸、第二次酶处理、盐析、离心纯化等工艺，得到高纯度天然胶原纤维。通过该方法得到的高纯度天然胶原纤维，是天然胶原分子的聚集体，除拥有胶原的四级结构和保留有胶原本身的生物活性外，还具有更多的天然组织中胶原空间结构特征，可更大程度地仿生天然组织结构，与胶原材料相比，本发明所制备的天然胶原纤维具有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能，结构更为稳定且易于保存，又能激活细胞的特性基团表达、维持细胞正常的特性表达，有利于细胞的黏附、生长与增殖，可用于制备止血材料、组织工程支架材料、医用整形美容材料等。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了高纯度天然胶原纤维及其制备方法，属生物医用材料制备领域。 高纯度天然胶原纤维及其制备方法
【背景技术】
[0002] 胶原是组成结缔组织(如皮肤、肌腱、骨骼等）的主要结构蛋白，在哺乳动物中约占 总蛋白质总量的三分之一。胶原作为生物体主要的细胞外间质，起着维持组织器官和皮肤 的形态和诱导修复各种损伤组织等作用。胶原具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒 性、弱抗原性，又能激活细胞特性基团的表达，有利于细胞的黏附、生长、增殖、分化，因而被 大量用于医用生物材料研制和医学临床治疗。在食品、美容化妆品、保健品、造纸及发酵中 也有着举足轻重的地位。但已发现胶原应用于医用生物材料，还存在着力学机械性能差、生 物降解性差以及结构稳定性低等问题，这严重地制约了胶原的应用。胶原纤维是胶原分子 的聚集体，Schmitt等曾提出，胶原分子不仅侧向聚集，而且轴向延伸，侧向聚集的平行排列 的胶原分子并不是齐头齐尾，而是相互前后错开一定的距离，交错距离就是周期性明暗横 纹的间距，大约为67nm，这种特殊的横纹是区分胶原跟胶原纤维最有力的证据（詹怀宇，纤 维化学与物理[M]·科学出版社，2005 :383)。 胶原纤维除拥有胶原的四级结构外，保留有天然胶原更多的空间结构特征，因而其具 有更为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能。同时胶原纤维也继承了胶原的极佳的 生物活性，因而在医学领域的应用前景十分诱人。另外，由于胶原纤维分子量更大，空间 结构更复杂，当制成海绵时，遇到体液时，不易流失、变形和降解，稳定性更高（刘新华，但 年华，胡杨，肖世维，但卫华.牛肌腱胶原纤维提取条件优化及其结构表征[J]功能材料， 2012,43:136-139) 〇
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种高纯度天然胶原纤维，该材料 既具有良好的生物可降解性能、生物相容性、吸湿/保湿性和力学性能，分子量巨大，结构 稳定易于保存，又能激活细胞特性基团的表达，有利于细胞的黏附、生长、增殖、分化，促进 创面愈合和修复，是制备生物医用材料的理想原料。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： (1) 预处理：取新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱，手工清除动物肌腱或跟腱表面的肌肉、 边缘软骨、血管和筋膜组织等杂质，接着将其倒入粉碎机中粉碎成为40?100目的颗粒，室 温下将动物肌腱或跟腱颗粒转入转鼓中分别用生理盐水和 75%乙醇转动漂洗30?90min， 再用双蒸水反复漂洗干净； (2) 浸水：取100重量份的动物肌腱或跟腱颗粒装入转鼓,室温下向转鼓中加入1〇〇? 300体积份的蒸馏水，加入0. 5?2重量份的平平加，转l〇min，停30min。再加入0· 4?3 重量份的碳酸钠，间歇转动，转动lOmin，停3〇min，反复3?5次。然后控干废液，流水洗 10?20min，用离心机脱水； (3)脱脂：将脱水后的动物肌腱或跟腱颗粒放入超临界二氧化碳流体处理器中，加入 2?6重量份的十二烷基苯磺酸钠和5?10重量份的平平加，在温度1〇?35?，压力15? 30Mpa的条件下处理60?150min ; (4 )浸碱：取脱脂处理后备用的动物肌腱或跟腱颗粒重新装入转鼓，加入200?1〇〇〇体 积份的〇· 05?1M氢氧化钠溶液，浸泡软化12-36h ;用去离子水冲洗至pH为6· 〇-7. 〇,得到 中性动物肌腱或跟腱颗粒； (5) 第一次酶处理：调节转鼓温度为35?40°C，加入100?200体积份的去离子水，接 着加入0· 05?1重量份的活力单位为1:20的胰酶，转动3?他，停鼓过夜，次日转动2〇? 60min，控干废液，去离子水闷洗3?5次，流水洗10?30min ; (6) 浸酸：将上述第一次酶处理的动物肌腱或跟腱颗粒放于-40?-80?的速冻冰箱中 反复冻融3?6次，接着将反复冻融后的动物肌腱或跟腱颗粒浸渍在1000?5000体积份 的pH为2. 0?2. 5的醋酸溶液中5?10h ; (7) 第二次酶处理：将上述浸酸处理的动物肌腱或跟腱颗粒在恒温4?1(TC下用匀装 机匀浆20?30min，接着向浆液中加入〇· 5?2份复合酶，4?10°C下转动12?36h，用 碱调节pH值为6. 5?7. 5,加入最终浓度为1. Omol/L的氯化钠粉末，静置5?l〇h，接着 10000?20000rpm离心10?30min，弃上层清液，将沉淀溶于0· 1?0· 5mol/L醋酸溶液， 再次10000?20000rpm离心10?30min离心，取下层沉淀物，最后以超纯水洗漆沉淀，离 心，得到高纯度天然胶原纤维。
[0005] 本发明所得到的高纯度天然胶原纤维满足以下主要关键性能指标： 外观：白色絮状或胶状，无肉眼可见之杂质； 水分含量20% (wt); 重金属含量：< lOug/gOn/m); 羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的10% (ra / m); 聚集结构：经透射电镜或原子力显微镜检测，有明显横纹结构； 细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级； 无菌试验：无菌； 致敏试验：无迟发性超敏反应； 皮内反应试验：原发性刺激指数ΡΙΚ0. 4。
[0006] 本专利通过浸水、脱脂、浸碱三步工艺对动物肌腱或跟腱进行处理，可有效除去动 物肌腱或跟腱中的非胶原成分，增加了动物肌腱或跟腱中胶原纤维间的空隙，有利于后续 工艺中化学品的充分渗透，发明人通过大量试验发现，由于动物肌腱或跟腱组织纤维结构 紧密，不容易软化和分散，因此发明人通过将其碎成一定细度的小颗粒，并加入碱液后浸泡 处理，使得动物肌腱或跟腱组织蓬松，同样有利于后续酶的充分作用。
[0007] 高纯度天然胶原纤维有以下用途： 1. 治疗创伤、烧伤、溃疡的材料； 2. 止血材料、硬脑膜修复材料等组织修复材料； 3. 体内组织修复和整形美容材料； 4. 体外细胞培养的组织支架材料和组织引导材料。
[0008] 本技术与现有技术相比，具有如下优点： (1) 本发明所制备的胶原纤维为超分子结构，是胶原分子的聚集体，除拥有胶原的四级 结构和保留有胶原本身的生物活性外，还继承了更多的天然组织中胶原空间结构特征，可 更大程度地仿生天然组织结构（见附图），相比胶原材料，本发明所制备的胶原纤维具有更 为优异的力学性能、热稳定性和生物降解性能，结构更为稳定易于保存，又能维持和激活细 胞的特性基团表达，诱导细胞的黏附、生长和增殖(见附图)，是一种理想的生物医用材料； (2) 本发明采用分步酶处理对动物肌腱或跟腱中的非胶原成分、杂细胞及胶原纤维的 端肽蛋白部分进行了清除，获得纯度更高、免疫原性更低、粗细更均匀的胶原纤维，且天然 聚集度分布更窄； (3) 本发明专利在对动物肌腱或跟腱脱脂处理时，引入超临界二氧化碳流体，经研究发 现在此条件下的动物肌腱或跟腱的脂肪、杂蛋白等非胶原组分更易被清除，脱脂时间大幅 度减少、预处理效果更明显； (4) 本发明所制备的胶原纤维的取材丰富，成本低廉，技术可靠，工艺简便，易于形成规 模化产业链。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1牛跟腱切片组织学染色图 图2本发明胶原纤维的原子力显微镜(AFM)检测图 可见，胶原纤维具有胶原聚集态的横纹特征结构，横纹间距约为67nm。
【具体实施方式】
[0010] 下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
[0011] 实施例1 (1) 预处理：取新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱，手工清除动物肌腱或跟腱表面的肌肉、 边缘软骨、血管和筋膜组织等杂质，接着将其倒入粉碎机中粉碎成为40目的颗粒，室温下 将动物肌腱或跟腱颗粒转入转鼓中分别用生理盐水和75%乙醇转动漂洗30min,再用双蒸 水反复漂洗千净； (2) 浸水：取1〇〇重量份的动物肌腱或跟腱颗粒装入转鼓，室温下向转鼓中加入100体 积份的蒸馏水，加入〇· 5重量份的平平加，转lOmin，停30min。再加入0. 4重量份的碳酸钠， 间歇转动，转动l〇min，停30min，反复3次；然后控干废液，流水洗lOmin，用离心机脱水； (3) 脱脂：将脱水后的动物肌腱或跟腱颗粒放入超临界二氧化碳流体处理器中，加入2 重量份的十二烷基苯磺酸钠和5重量份的平平加，在温度i(TC，压力15Mpa的条件下处理 60min ； (4) 浸碱：取脱脂处理后备用的动物肌腱或跟腱颗粒重新装入转鼓，加入200体积份的 0.05M氢氧化钠溶液，浸泡软化12h ;用去离子水冲洗至PH为6.0,得到中性动物肌腱或跟 腱颗粒； (5) 第一次酶处理：调节转鼓温度为35°C，加入100体积份的去离子水，接着加入〇. 05 重量份的活力单位为1: 2〇的胰酶，转动此，停鼓过夜，次日转动20min，控千废液，去离子水 闷洗3次，流水洗lOmin ; (6) 浸酸：将上述第一次酶处理的动物肌腱或跟腱颗粒放于-4(rC的速冻冰箱中反复 冻融3次，接着将反复冻融后的动物肌腱或跟腱颗粒浸渍在1000体积份的pH为2· 5的醋 酸溶液中5h ; (7) 第二次酶处理：将上述浸酸处理的动物肌腱或跟腱颗粒在恒温4?C下用匀浆机匀 浆20min，接着向浆液中加入0· 5份复合酶，4°C下转动1此，用碱调节pH值为6· 5,加入最 终浓度为1· 〇m〇l/L的氣化纳粉末，静置5h，接着l〇〇〇〇rpm离心lOmin,弃上层清液，将沉淀 溶于0. lmol/L醋酸溶液，再次lOOOOrpm离心i〇min离心，取下层沉淀物，最后以超纯水洗 涤沉淀，离心，得到高纯度天然胶原纤维。
[0012] 实施例2 (1) 预处理：取新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱，手工清除动物肌腱或跟腱表面的肌肉、 边缘软骨、血管和筋膜组织等杂质，接着将其倒入粉碎机中粉碎成为6 〇目的颗粒，室温下 将动物肌腱或跟腱颗粒转入转鼓中分别用生理盐水和75%乙醇转动漂洗60min，再用双塞 水反复漂洗千净； ~ (2) 浸水：取100重量份的动物肌腱或跟腱颗粒装入转鼓，室温下向转鼓中加入15〇体 积份的蒸馏水，加入1重量份的平平加，转10min，停30min。再加入1重量份的碳酸钠，间 歇转动，转动lOmin，停 3〇min，反复4次。然后控干废液，流水洗I5min，用离心机脱水； (3) 脱脂：将脱水后的动物肌腱或跟腱颗粒放入超临界二氧化碳流体处理器中，加入4 重量份的十二烷基苯磺酸钠和6重量份的平平加，在温度20Γ，压力20Mpa的条件下处理 lOOrnin ； (4) 浸碱：取脱脂处理后备用的动物肌腱或跟腱颗粒重新装入转鼓，加入500体积份的 0. 5M氢氧化钠溶液，浸泡软化24h ;用去离子水冲洗至PH为6· 5,得到中性动物肌腱或跟腱 颗粒； (5) 第一次酶处理：调节转鼓温度为38°C，加入150体积份的去离子水，接着加入〇. 2 重量份的活力单位为1: 2〇的胰酶，转动5h，停鼓过夜，次日转动40min，控干废液，去离子水 闷洗4次，流水洗15min ; (6) 浸酸：将上述第一次酶处理的动物肌腱或跟腱颗粒放于-6(TC的速冻冰箱中反复 冻融5次，接着将反复冻融后的动物肌腱或跟腱颗粒浸溃在1〇〇〇?5000体积份的 PH为 3. 0的醋酸溶液中6h ; (7) 第二次酶处理：将上述浸酸处理的动物肌腱或跟腱颗粒在恒温下用匀浆机匀 浆25min,接着向浆液中加入1份复合酶，6°C下转动24h,用碱调节pH值为7· 0,加入最终 浓度为1· 〇m〇l/L的氯化钠粉末，静置6h，接着l5〇〇〇rpm下离心lanin,弃上层清液，将沉淀 溶于0· 4mol/L醋酸溶液，再次i5〇〇〇rpm离心l^nin离心，取下层沉淀物，最后以超纯水洗 涤沉淀，离心，得到高纯度天然胶原纤维。
[0013] 实施例3 (1)预处理：取新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱，手工清除动物肌腱或跟腱表面的肌肉、 边缘软骨、血管和筋膜组织等杂质，接着将其倒入粉碎机中粉碎成为100目的颗粒，室温下 将动物肌腱或跟腱颗粒转入转鼓中分别用生理盐水和75%乙醇转动漂洗90min,再用双塞 水反复漂洗干净； ^ (2) 浸水：取100重量份的动物肌腱或跟腱颗粒装入转鼓，室温下向转鼓中加入300体 积份的蒸馏水，加入2重量份的平平加，转lOmin，停30mi n。再加入3重量份的碳酸钠，间 歇转动，转动l〇min,停30min，反复5次；然后控干废液，流水洗2〇min，用离心机脱水； (3) 脱脂：将脱水后的动物肌腱或跟腱颗粒放入超临界二氧化碳流体处理器中，加入6 重量份的十二烷基苯磺酸钠和10重量份的平平加，在温度 35-C，压力3〇Mpa的条件下处理 150min ； (4 )浸碱：取脱脂处理后备用的动物肌腱或跟腱颗粒重新装入转鼓，加入2〇〇?1〇〇〇体 积份的〇· 〇5?1M氢氧化钠溶液，浸泡软化i2-36h ;用去离子水冲洗至pH为6. 0-7. 0,得到 中性动物肌腱或跟腱颗粒； (5) 弟一次酶处理：调节转鼓温度为40°C，加入2〇〇体积份的去离子水，接着加入1重 量份的活力单位为1: 2〇的胰酶，转动6h,停鼓过夜，次日转动6〇min，控干废液，去离子水闷 洗5次，流水洗30min ; (6) fefe :将上述弟一次酶处理的动物肌腱或跟腱颗粒放于的速冻冰箱中反复 冻融6次，接着将反复冻融后的动物肌腱或跟腱颗粒浸溃在5〇〇〇体积份的pH为4. 〇的醋 酸溶液中5?10h ; ' (7) 第二次低温酶处理：将上述浸酸处理的动物肌腱或跟腱颗粒在恒温1〇1：下用匀浆 机勻菜3〇min，接着向衆液中加入2份复合酶，l〇°C下转动36h，用碱调节pH值为 7· 5，加入 取终浓度为1· Omol/L的氯化钠粉末，静置10h，接着2〇〇〇〇rpm离心3〇min，弃上层清液，将 沉淀溶于0· 5mol/L醋酸溶液，再次2000〇rpm离心30min离心，取下层沉淀物，最后以超纯 水洗涤沉淀，离心，得到高纯度天然胶原纤维。 一
【权利要求】
1. 高纯度天然胶原纤维，主要含有胶原的聚集体--胶原纤维，其关键性能指标如 下： (1) 外观：白色絮状或纤维状，无肉眼可见之杂质； (2) 水分含量：< 20% (wt); (3) 重金属含量：矣1〇 μ g/g (m/m); (4) 羟脯氨酸含量：不小于总蛋白含量的U. 5% (m / m); (5) 聚集结构：经透射电镜或原子力显微镜检测，有明显横纹结构； (6) 细胞毒性：细胞毒性反应不大于1级； (7) 无菌试验：无菌； (8) 致敏试验：无迟发性超敏反应； (9) 皮内反应试验：原发性刺激指数ΡΙΚ0. 4。
2. 高纯度天然胶原纤维及其制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1) 预处理：取新鲜可溯源的动物肌腱或跟腱，手工清除动物肌腱或跟腱表面的肌肉、 边缘软骨、血管和筋膜组织等杂质，接着将其倒入粉碎机中粉碎成为40?100目的颗粒，室 温下将动物肌腱或跟腱颗粒转入转鼓中分别用生理盐水和75%乙醇转动漂洗30?90mi n， 再用双蒸水反复漂洗干净； (2) 浸水：取100重量份的动物肌腱或跟腱颗粒装入转鼓，室温下向转鼓中加入100? 300体积份的蒸馏水，加入0· 5?2重量份的平平加，转lOmin，停30min，再加入〇. 4?3重 量份的碳酸钠，间歇转动，转动lOmin，停30min，反复3?5次，然后控干废液，流水洗1〇? 20min，用离心机脱水； (3) 脱脂：将脱水后的动物肌腱或跟腱颗粒放入超临界二氧化碳流体处理器中，加入 2?6重量份的十二烷基苯磺酸钠和5?10重量份的平平加，在温度10?35°C，压力15? 30Mpa的条件下处理60?150min ; (4) 浸碱：取脱脂处理后备用的动物肌腱或跟腱颗粒重新装入转鼓，加入200?1000体 积份的〇· 〇5?1M氢氧化钠溶液，浸泡软化12_36h ;用去离子水冲洗至pH为6. 0-7. 0,得到 中性动物肌腱或跟腱颗粒； (5) 第一次酶处理：调节转鼓温度为35?4〇°C，加入100?200体积份的去离子水，接 着加入0· 〇5?1重量份的活力单位为1: 2〇的胰酶，转动3?6h,停鼓过夜，次日转动20? 60min，控干废液，去离子水闷洗3?5次，流水洗10?30min ; (6) 浸酸：将上述步骤（5)处理后的动物肌腱或跟腱颗粒放于-40--8(TC的速冻冰箱 中反复冻融3?6次，接着将反复冻融后的动物肌腱或跟腱颗粒浸渍在1000?5000体积 份的pH为2. 0?2. 5的醋酸溶液中5?10h ; (7) 第二次酶处理：将上述浸酸处理的动物肌腱或跟腱颗粒在恒温4?1(TC下用匀浆 机匀浆20?3〇min,接着向浆液中加入〇· 5?2份复合酶，4?10°C下转动12?36h，用 碱调节pH值为6· 5?7· 5,加入最终浓度为1. 〇mol/L的氯化钠粉末，静置5?l〇h，接着 10000?2〇OOOrpm离心10?3〇min,弃上层清液，将沉淀溶于0· 1?〇· 5mol/L醋酸溶液， 再次10000?2〇OOOrpm禺心10?30min离心，取下层沉淀物，最后以超纯水洗绦沉淀，离 心，得到高纯度天然胶原纤维。
3. 权利要求2所述高纯度天然胶原纤维及其制备方法，其特征在于所述的复合酶为由 活性比为：胃蛋白酶：胰酶：真菌复合酶=1:1:1的三种蛋白酶组成。
4.权利要求2所述高纯度天然胶原纤维及其制备方法，其特征在于所述的动物肌腱或 跟腱为新鲜、可溯源的，可以为猪、牛、驴、羊等任一哺乳动物的肌腱或跟腱。
【文档编号】C12P21/06GK104189944SQ201410450387
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】但卫华, 琚海燕, 但年华, 刘新华 申请人:四川大学