一种脂肪酶与其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种脂肪酶基因及其编码的脂肪酶蛋白，与该蛋白因具有水解油酯的性质而在工业化生产和药物合成领域的潜在应用。本发明以深海热液口来源样品Fosmid文库进行454测序后得到的Fosmid文库基因信息片段的注释信息为研究材料，从宏基因组文库筛选到对应脂肪酶的克隆子，并对该Fosmid克隆子进行鸟枪法结合引物步移法测序，得到一个编码脂肪酶的ORF，其基因序列如序列表中<1>序列所示。将脂肪酶目的基因插入载体pET-32a(+)表达载体中，表达纯化得到该基因编码的多肽其成熟肽。其氨基酸序列如序列表中<2>序列所示。本发明的脂肪酶酶活性质研究表明，该脂肪酶具有较好的脂肪酶特性，在工业化生产和药物合成等许多领域具有潜在应用价值。
【专利说明】一种脂肪酶与其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种脂肪酶与其编码基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（E.C. 3. 1. 1. 3)也称为三酰基甘油水解酶，是能催化天然底物油脂水解生 成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的一类特殊酯键水解酶类，它广泛存在于原核生物（如 细菌）和真核生物（如霉菌、哺乳动物、植物等）中。研究表明，除了能够催化甘油酯类化合 物的水解和合成之外，它还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、 聚合物的合成和药物的合成等，利用某些脂肪酶的立体专一性，还可以催化化学方法难以 完成的旋光异构体的拆分和手性药物的合成。因而脂肪酶在食品和营养、日用化学工业、油 脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等 许多领域得到广泛应用。近年来人们还用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石 油，使之快速降解为适合微生物的营养成分，随着酶工程的不断发展，脂肪酶的应用研究正 日益丰富，利用其进行新应用领域的开发也正成为研究热点。
[0003] 作为一种生物催化剂，周围环境（温度、pH、有机试剂等）对酶的活性影响很大，很 多酶在一些比较苛刻的反映条件下（高温、低温或者强酸碱环境）均会失去活性，这就限制 了其应用范围。为了适应更苛刻的工业生产环境需求，需要我们在尊重生物多样性的前提 条件下，不断在环境中进行新的淀粉酶来源的探索。
[0004] 深海热液口烟囱是通过来自地壳的熔浆与海水相互作用而形成的特殊的地质结 构，该环境被认为与地球早期环境相似，为特异微生物群落的形成和演化提供了良好的环 境和物质基础，使得群落显示出独特的极端环境耐受力，蕴藏了大量的生物活性物质。热液 口微生物中具有很多特殊的基因和酶，在现代工业、医药、环保、材料、生物工程和国防等领 域具有广阔的开发应用前景。又因其与地球上生命形成初期的环境又十分相似，因此热液 口又被喻为是研究生命起源与进化的天然实验室。近年来宏基因组学技术体系的建立使从 不可培养微生物样品中直接获得酶资源成为可能。
[0005] 宏基因组学又叫环境基因组学或群体基因组学，是指特定环境中全部生物遗传物 质的总和，利用现代基因组技术直接研究自然生态环境中的有机群落，而不需要分离、培养 单一种类的微生物。宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，然后根 据不同环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。其中主要包括以下几个 关键因素：DNA提取质量、克隆载体的选择、宿主菌的选择。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种来源于深海热液口的淀粉酶基因脂肪酶F_93_0RF6 蛋白。
[0007] 本发明的另一目的在于提供该？_93_01^6蛋白的生产方法。
[0008] 本发明还有一个目的在于提供上述F_93_0RF6基因编码的脂肪酶在工业化生产 和药物合成等许多领域的应用。
[0009] 本发明公开了一种脂肪酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO. 1所示。
[0010] 进一步地，本发明公开了用于所述的脂肪酶基因特异性扩增的引物，包括以下两 条序列：
[0011] 上游引物见序列表中SEQIDNo. 3 ;
[0012] 下游引物见序列表中SEQIDNo. 4 ;
[0013] 进一步地，本发明还公开了所述的脂肪酶基因编码的脂肪酶，其氨基酸序列序列 表SEQIDN0. 2 所示。
[0014] 进一步地，本发明还公开了一种重组表达载体，所述的表达载体含有权利要求1 所述核苷酸片段。
[0015] 进一步地，所述的重组表达载体，其具体为pET-32a(+)M-F_93
[0016] 进一步地，本发明还公开了一种表达工程菌，其携带有上述的表达载体。
[0017] 进一步地，所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。
[0018] 本发明公开了一种脂肪酶基因？_93_01^6,其核苷酸片段的序列具体为序列表SEQ IDNO. 1 所示。
[0019] 具体地，本发明通过对深海热液口 4143-1宏基因组数据分析发现，共有6条拼接 序列与脂肪酶基因有较高的同源性，以这些宏基因组序列信息设计引物，对2880个克隆子 进行两步法筛选，最后筛选得Fosmid克隆子F_93。
[0020] 本发明对在蛋白活性实验显示活性的Fosmid克隆子F_93进行鸟枪法结合引物 步移法测序。通过0RF预测软件0RFfinder进行预测发现，该克隆子共包含16个0RF。其 中0RF6与a/P脂肪水解酶类似，其氨基酸序列如序列表中〈2>序列所示。具有典型的 FamilyIV的脂肪酶一级结构的特征。
[0021] 本发明设计了特异性引物，将扩增的F_93_0RF6基因克隆到大肠杆菌表达载体 pET-32a(+)，构建重组表达载体pET-32a(+)M-F_93,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)。将 转化的工程菌培养，IPTG诱导该F_93_0RF6蛋白表达，该F_93_0RF6蛋白是通过表达载体 pET-32a(+)M-F_93在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的。菌液离心收集菌体，进行超声 破碎，离心取上清采用亲和层析进行纯化，得到所述的目的F_93_0RF6蛋白。
[0022] 为直观的看到F_93_0RF6蛋白的酶活作用，本发明进行了脂肪酶水解作用的验 证。并对本发明的脂肪酶？_93_0?1?6蛋白进行了初步的活性性质的研究。
[0023] 相对于现有技术，本发明的F_93_0RF6脂肪酶蛋白37°C条件下，比活力为22. 13U/ mg，最适温度为30°C左右，10°C-40°C之间有较明显的酶活（60%以上），在偏碱性条件下 (pH7. 5-9. 0)酶活相对较高，最适pH为8. 0为，碱性脂肪酶。该酶的特异性底物为短碳链长 度的甘油酯，具有应用工业化生产和药物合成等许多领域的潜力。
[0024] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为添加酶切位点后F_93_0RF6基因片段的PCR产物电泳结果。
[0026] 1、2 :F_93_0RF6 基因PCR产物；M:DL2000bp的DNA分子量标准。
[0027] 图2为重组表达质粒pET-32a(+)M_F_93的构建图
[0028] 图3为脂肪酶的表达和纯化电泳图。
[0029]M:蛋白分子量标准；1:诱导前总细菌蛋白；2 :IPTG诱导后总细菌蛋白；
[0030] 3 :IPTG诱导后总细菌蛋白超声沉淀；4 :IPTG诱导后超声上清总细菌蛋白；
[0031] 5:纯化后的融合蛋白BL21 (DE3)-pET32a-93;
[0032]图 4 为融合蛋白BL21 (DE3)-pET32a_93westernblot纯化验证结果。
[0033]M:蛋白分子量标准；1、2:纯化后的融合蛋白BL21 (DE3)-pET32a-93;
[0034] 图5为不同稀释倍数的纯化酶液作用三丁酸甘油酯平板的水解圈，其中50mM Tris溶液作阴性对照
[0035] 图6为对硝基苯酚标准曲线。
[0036] 图7为pH对脂肪酶活性的影响。
[0037] 图8为温度对脂肪酶活性的影响。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] -：含脂肪酶序列克隆子的筛选
[0040]先将深海热液口宏基因组序列与NCBInon-redundantdatabase进行信息比对， 查找出与脂肪酶基因相似的信息；再根据注释信息查找对应的序列信息，设计特异性引物， 从文库中筛选对应的克隆子。为了提高筛选效率，我们将参与454测序的2880克隆分为30 组，即每个96孔板制备成一个混合质粒样品，另外再制备一个由2880个克隆混合而成的质 粒样品作为筛选时的阳性对照，就这样先以那30个混合样作为PCR扩增模板进行第一轮筛 选，找到该基因序列所对应的混合样编号，再以对应编号的96孔板为模板做第二轮筛选， 即可找到文库中对应的克隆子。
[0041]PCR筛选异性引物为：
【权利要求】
1. 一种脂肪酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2. 用于权利要求1所述的脂肪酶基因特异性扩增的引物，包括以下两条序列： 上游引物见序列表中SEQ ID No. 3 ; 下游引物见序列表中SEQ ID No. 4。
3. 权利要求1所述的脂肪酶基因编码的脂肪酶，其氨基酸序列序列表SEQ ID NO. 2所 /_J、i 〇
4. 一种重组表达载体，所述的表达载体含有权利要求1所述核苷酸片段。
5. 权利要求4所述的重组表达载体，其具体为pET-32a(+)M-F_93。
6. -种表达工程菌，其携带有权利要求3所述的表达载体。
7. 权利要求6所述的表达工程菌，其具体为转化的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。
【文档编号】C12N15/11GK104328132SQ201410450136
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】徐安龙, 王磊, 任政华, 吴珊, 陈尚武, 邹琼, 付永贵 申请人:中山大学