鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白及其制备方法和应用的制作方法

鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白及其制备方法和应用，鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其制备方法是将含有重组表达载体的大肠杆菌Rossetta在含有Amp的LB液体培养基中培养过夜，然后取菌液转接入新鲜的含Amp的LB液体培养基中，培养至OD600为0.4时，加入IPTG诱导培养，得含鸭瘟病毒UL15基因exonI重组蛋白的培养液，所得重组蛋白具有免疫活性，能够与鸭瘟病毒抗体特异性结合，可作为鸭瘟病毒抗体的检测试剂；还可以作为抗原制备多克隆抗体，为鸭瘟病毒的检测奠定了基础。
【专利说明】鸭瘟病毒UL15基因 exon I重组蛋白及其制备方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白，还涉及 该重组蛋白的制备方法和应用。

【背景技术】
[0002] 鸭癌（Duck Plague，DP)是由疱疫病毒科中的鸭癌病毒（Duck plague virus，DPV) 引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病。该病可导致商 品水禽产蛋量下降及死亡，对野生水禽也有不同的致死率。近年来，随着养鸭业生产向集约 化、规模化的方向发展，鸭瘟作为威胁养鸭业最严重的接触性传染病之一，造成了巨大的经 济损失。
[0003] 临床和实验室试验证实鸭瘟病毒弱毒疫苗是预防控制鸭瘟病毒的有效生物制剂， 而对鸭瘟病毒特异性抗体的监测是评价鸭瘟病毒弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程 序的关键。目前对于检测鸭瘟病毒抗体的方法多数是基于鸭瘟病毒全病毒作为抗原的检测 方法，但是这种方法易散毒，并且抗原制备较为复杂且纯度不够理想，这些都使这种方法不 具有推广性。另外对于鸭瘟病毒的检测研究也需要特异性的抗体。近年来不同的鸭瘟病毒 毒株相继被报道如CHv株、2085株、VAC株、Clone-03株、C-KCE株，这些毒株中部分基因存 在明显差异。那么我们又如何可以快速准确并简便的检测到不同毒株的鸭瘟病毒，使其不 因为毒株的不同而造成检测方法的麻烦，那么就需要选取在不同毒株间都相对保守并特异 的蛋白进行其抗体的制备，从而用来检测鸭瘟病毒。因此研究和应用在鸭瘟病毒间保守的 UL15基因原核表达产物对于鸭瘟病毒的预防和控制具有重要的理论和临床意义。


【发明内容】

[0004] 有鉴于此,本发明的目的之一在于提供鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白；本发 明的目的之二在于提供鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的制备方法，本发明的目的之三 在于提供鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的应用；本发明 的目的之四在于提供鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白在制备抗鸭瘟病毒多克隆抗体的 抗原中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白，所述鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0007] 优选的，编码所述鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 2、所述鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：将含有重 组表达载体的大肠杆菌Rossetta在含有Amp的LB液体培养基中培养过夜，然后取菌液按 体积比为1 :50?1 :100接入含Amp的LB液体培养基中，培养至0D600为0. 4?0. 6时，力口 入IPTG至终浓度为0. 2?I. 2mmol/L，在温度为25?37°C条件下诱导培养2?6小时，收 集培养菌液，培养菌液中含有鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白；
[0009] 所述重组表达载体为将SEQ ID NO. 3所示核酸序列通过BamHI和XhoI连接原核 表达质粒PPAL7而得。
[0010] 优选的，所述IPTG的终浓度为0? 2mmol/L。
[0011] 优选的，诱导培养为在37°C条件下诱导培养4小时。
[0012] 更优选的，诱导培养后还包括纯化步骤，将诱导表达的菌液离心，收集菌体，菌体 用pH8. 0的20mmolTris-HCl悬浮；置-20°c过夜后按lmg/mL加溶菌酶，4°C搅拌30min，冰 浴下超声波间歇破碎菌体，然后离心收集包涵体，收集的包涵体用含lOmmol/L PBS、2mol/L 尿素和质量分数为〇. 2%的Triton X-100的洗液重复洗涤5-10次，洗涤后离心收集沉淀， 最后沉淀用含lOmmol/L PBS和8mol/L尿素溶液溶解沉淀；得纯化的鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白。
[0013] 优选的，纯化后还包括复性步骤：将纯化好的鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋 白加入复性稀释缓冲液，然后装入透析袋中依次置于尿素浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、 2mol/L、lmol/L和0mol/L的复性透析缓冲液中进行复性，每12小时更换一次透析液，再 用PBS缓冲液进行透析复性，最后用超滤管进行超滤得复性的鸭瘟病毒UL15基因exonl 重组蛋白；所述复性稀释缓冲液含 50mmol/L Tris-base、lmmol/L EDTA> lOOmmol/L NaCl> 0. 25mol/L L-精氨酸、0. lmmol/L氧化型谷胱甘肽、lmmol/L还原型谷胱甘肽和5%甘油（V/ V);所述复性透析缓冲液含含有 50mmol/L Tris_base、0. 5mol/L EDTA、150mmol/L NaCl 和 0.6mol/L L-精氨酸。
[0014] 最优选的，所述离心是在4°C、10000r/min条件下离心10min。
[0015] 3、所述鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获剂中的应用。
[0016] 4、所述鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白在制备抗鸭瘟病毒多克隆抗体的抗原 中的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明公开了鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白，该 蛋白是选取鸭瘟病毒中保守的UL15基因的exonl部分编码的蛋白进行表达，分子量约为 48kDa。通过基因工程技术，将鸭瘟病毒UL15基因exonl与原核表达载体pPAL7连接，转化 大肠杆菌Rossetta表达系统进行诱导，该方法适于工业化大规模生产，能够实现产品的标 准化。将表达获得的产品经Western blot进行鉴定后，其表面具有与天然蛋白相似的免疫 反应活性，可以与鸭瘟病毒抗体进行特异性结合，作为检测鸭瘟病毒抗体的检测抗原，并且 由于该抗原非全病毒，用其检测时无散毒危险。此外鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白进 行纯化后可以作为抗原免疫小鼠，获得了鼠抗UL15exonI重组蛋白多克隆抗体,该抗体可 以作为检测鸭瘟病毒的检测抗体，用于鸭瘟病毒的检测，用其检测鸭瘟病毒具有特异性强、 无交叉反应等优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为鸭瘟病毒UL15基因exonl的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为DNA Marker ;2为鸭瘟病毒UL15基因exonl的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性 DNA条带。
[0020] 图2为pMD18-T_UL15exonI质粒PCR及酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为 DNA Marker ;2为鸭瘟病毒UL15基因exonl的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特 异性DNA条带；3为重组质粒pMD18-T-UL15exonI用BamH I和Xho I双酶切，酶切产物经 琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。
[0021] 图3为pPAL7-UL15ex〇nI质粒的PCR及双酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中1 为DNA Marker ;2为鸭瘟病毒UL15基因exon I的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得 的特异性DNA条带；3为重组表达质粒pPAL7-UL15exonI用BamH I和Xho I双酶切，酶切 产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。
[0022] 图4为重组表达质粒pPAL7_UL15exonI表达的鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋 白的SDS-PAGE电泳图；其中1为蛋白Marker ;2为重组表达质粒pPAL7-UL15exonI用IPTG 诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果；3为空载 体PPAL7用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳 的结果；4为重组表达质粒pPAL7-UL15e X〇nI用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离 心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果；5为空载体pPAL7用IPTG诱导，得到的菌液进 行超声波破碎、离心后所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果。
[0023] 图5为不同IPTG浓度下含有重组质粒pPAL7_UL15exon I的宿主菌Rossetta表 达鸭瘟病毒UL15exon I重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中1为蛋白Marker ;2为IPTG的 终浓度为Ommol/L ;3为IPTG的终浓度为0. 2mmol/L ;4为IPTG的终浓度为0. 4mmol/L ;5 为IPTG的终浓度为0. 6mmol/L ;6为IPTG的终浓度为0. 8mmol/L ;7为IPTG的终浓度为 I. Ommol/L ;8 为 IPTG 的终浓度为 I. 2mmol/L。
[0024] 图6为不同温度下含有重组质粒pPAL7_UL15exonI的宿主菌Rossetta表达鸭瘟 病毒UL15基因exon I重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中1为蛋白Marker ;2为诱导温度 为37°C ;3为诱导温度为30°C ;4为诱导温度为25°C。
[0025] 图7为不同诱导时间下含有重组质粒pPAL7_UL15exon I的宿主菌Rossetta表达 鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中1为蛋白质Marker ;2为诱导 Oh ;3为诱导2h ;4为诱导4h ;5为诱导6h ;6为诱导过夜。
[0026] 图8为尿素洗涤纯化后的鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白SDS-PAGE电泳图； 1为蛋白Marker ;2为未纯化的鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白；2为纯化后的鸭瘟病 毒UL15基因exonl重组蛋白。
[0027] 图9为鸭抗鸭瘟血清与鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的western-blot图； 1为鸭抗鸭瘟IgG与鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白的反应条带，2为蛋白Marker。
[0028] 图10为鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白鼠抗多克隆抗体的效价检测结果图； 中间孔为鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白液，周边孔为血清，稀释的比例依次为：未稀 释、1 :2、1 :4、1 :8、1 :16、1 :32。
[0029] 图11为鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白鼠抗多克隆抗体对鸭瘟病毒的检测 结果图；其中a、b、c为感染鸭瘟病毒12h的细胞飞片，d、e、f为感染鸭瘟病毒24h的细胞 飞片，g、h、i为感染鸭瘟病毒48h的细胞飞片，j、k、1为未感染鸭瘟病毒的阴性对照。

【具体实施方式】
[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0031] 本发明中部分氨基酸相应的缩写如下：
[0032] 谷酰胺gin Q ;甘氨酸gly G ;丝氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;苏氨酸thr T ;缴氨酸 val V ;异亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸tyr Y ;苯丙氨酸phe F ;组氨酸his H ;脯氨 酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸trp W ;赖氨酸Iys K ;半 胱氨酸cys C;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D。
[0033] 实施例1、鸭瘟病毒UL15基因exonl重组表达质粒的构建
[0034] (1)菌株、质粒和毒株
[0035] 质粒PMD18-T购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pPAL7购自Bio-Rad 公司（货号为：156_3002);大肠杆菌（Escherichia coli)DH5 a、大肠杆菌（Escherichia coli) Rossetta和鸭瘟病毒（DPV) CHv强毒株由四川农业大学禽病研究中心提供。
[0036] (2)试验动物
[0037] 10日龄鸭胚，鸭胚的种鸭DPV和DPV抗体均为阴性。
[0038] (3)鸭瘟病毒UL15基因exonl的克隆
[0039] 根据鸭瘟病毒UL15基因exon I的DNA序列设计一对引物，上游引物为5' -Rgat ccatcagtggcgtattatgtg-3' (SEQ ID NO. 1)，下划线表示 BamH I 酶切位点，共 25bp，5' 端 位于起始密码子前第45位；下游引物为5' -ctcgagaaagcattactcaagactcaag-3' (SEQ ID NO. 2)，下划线表示Xho I酶切位点，共28bp，5'端位于终止密码子后第36位，预期产物为 1158bp (不包括内切酶序列则为1146bp)。将设计的引物序列提交上海生工生物工程有限 公司合成，将合成的引物用灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20°C保存备用。
[0040] 鸭瘟病毒基因组DNA的提取，具体步骤如下：
[0041] a、鸭胚成纤维细胞（DEF)的制作方法：取IOd日龄健康鸭胚，分别用体积分数为 5%碘酒和体积分数为75%酒精消毒蛋壳表面，无菌条件下将胚体取出并用PBS将胚体洗 净,剪去头、翅、腿和内脏,PBS冲洗后将胚体剪成Imm 3大小的小块，加PBS适量，之后置于三 角瓶内，加细胞分散剂（体积分数为2. 5 %胰蛋白酶）150 ii L/胚，于37°C水浴中消化3min， 消化后将细胞悬液以4000r/min离心5min，倾弃上清，细胞沉淀用适量的MEM悬浮后，用6 层纱布过滤，向滤液中加入体积分数为10%小牛血清和100IU/mL双抗（青霉素和链霉素终 浓度分别为l〇〇IU/mL和IOOii g/mL)后，分装于IOOmL细胞培养瓶中，7mL/瓶，然后水平静 置于37°C细胞培养箱中进行培养；
[0042] b、鸭瘟病毒增殖：取刚刚长成致密单层的DEF，弃生长营养液，用灭菌PBS清洗细 胞表面2次后，加入DPV CHv 0. 1M0I覆盖细胞表面进行吸附，37°C吸附Ih后弃病毒液，然后 加含3%小牛血清和100几/1^双抗（青霉素和链霉素终浓度分别为100几/1^和10011 8/ mL)的MEM维持营养液，之后37°C培养；同时以未接毒的DEF对照；
[0043] c、DNA提取方法：直接从感染的DEF中提取DPV基因组DNA，具体步骤如下：（1)选 取用DPV种毒感染后细胞病变（CPE)达80 %的DEF ;⑵倾去细胞培养液，加入500 ii L的细 胞裂解液，同时加蛋白酶K至终浓度为200 ii g/mL，轻轻混匀后，37°C孵育10分钟；（3)将细 胞悬浮液倒入EP离心管中，并用500 L的饱和酚洗涤残存于细胞瓶内的裂解物，倒入离心 管中；（4)用饱和酚：氯仿（I: 1)及氯仿抽提2次，再用水饱和乙醚处理2次；（5)加1/10倍 体积3mol/L NaAC，混匀后，加入2倍体积冷无水乙醇，-20°C放置30-60分钟；（6) 13000r/ 分钟离心20分钟，沉淀用预冷的体积分数为70 %的乙醇洗涤两次；（7)真空抽干后，溶于适 量TE缓冲液中，加入I ii L RNA酶，37°C作用30分钟，-20°C保存备用。
[0044] 同时选取细胞形态正常的DEF作对照。
[0045] 然后以提取的鸭瘟病毒基因组DNA为模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示 序列为引物扩增鸭瘟病毒UL15基因exon I序列，PCR反应体系如下：ddH20 7 iiL，模板 I ii L，PrimcSTAR? Max DNA聚合酶10 ii L，引物各I ii L，用水补齐20 ii L ;PCR反应条件 为：98°C变性10sec，55°C退火15sec，72°C延伸30sec，循环数为35,然后取L PCR产 物在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度，结果如图1所示。结果显示，扩增获得 一条约1146bp的特异性DNA条带，即获得鸭瘟病毒UL15基因第一外显子exonl，命名为 UL15ex 〇nI。目的条带使用北京赛百盛基因技术有限公司DNA回收试剂盒回收，回收后取 7.51^胶回收产物加2.51^2\了 &9?〇?1^1，721：反应30111111进行加4，之后冰上放置2? 3min，然后与pMD18-T vector进行连接，在16°C的条件下连接过夜，得pMD18-UL15exon I。
[0046] (4) DH5 a感受态细胞的制备
[0047] 采用氯化钙法制备大肠杆菌DH5 a感受态细胞，具体步骤如下：（1)无菌挑取平板 上新鲜培养的DH5 a单克隆菌落接种于5mL LB培养液中，于37°C振荡培养过夜；（2)取ImL 上述培养液接种于IOOmL LB培养液中，37°C 200r/min振荡培养2. 5?3h，使0D600 = 0. 5 左右；⑶将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴IOmin ; (4)于4°C 4000r/ min离心8min，弃上清；（5)加IOmL冰预冷的0. lmol/L的CaCl2，温和悬起细菌沉淀，冰浴 30min ; (6)于4°C 4000r/min离心8min，弃上清，加4mL冰预冷的0. lmol/L的CaCl2再次重 悬沉淀，加入终浓度为15%的灭菌甘油，混匀后分装为200 ii L/管，-4°C冰箱中保存过夜以 提高转化效率。
[0048] (5)转化感受态细胞
[0049] 将15iiL连接体系全部取出加到200iiL DH5a感受态细胞中，冰浴30min ;再置 于42°C温浴90s，之后再冰浴2min ;然后立即加入0. 8mL LB培养基中，37°C水浴振荡培养 45min，取200 ii L涂于含Amp的培养基上，置37°C培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌 落接种于含Amp的LB液体培养基中，37°C水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。
[0050] (6)重组质粒的鉴定
[0051] 将上述抽提得到的重组质粒pMD18-UL15exonI进行PCR检测，同时以BamH I和 Xho I双酶切消化，然后米用1.0*%?规|父电泳观察结果，结果如图2所不。结果显tj^，PCR检 测和酶切得到预期的片段，表明UL15exon I成功连入pMD18-T载体中。然后将经PCR和酶 切验证正确的质粒送上海英骏生物有限公司进行测序，测序获得UL15ex 〇n I的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0052] (7)原核表达质粒pPAL7_UL15exon I的构建
[0053] 将 pMD18_UL15exon I 质粒用 BamH I 和 Xho I 双酶切，回收 UL15exon I 片段；同 时用BamH I和Xho I双酶切原核表达载体pPAL7,回收载体骨架，将回收的UL15exon I片 段和载体骨架在16°C条件下连接过夜，得pPAL7-UL15exonI重组质粒。
[0054] (8)原核表达质粒pPAL7_UL15exon I的转化
[0055] 将获得的pPAL7_UL15exonI重组质粒按照上述相同的方法转化DH5 a感受态细 胞，同时使用原核表达载体PPAL7转化DH5a感受态细胞和未转化的DH5a感受态细胞作 为对照。然后将转化细菌接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37°C水浴振摇培养过夜， 培养液用于提取重组质粒，提取的重组质粒用BamH I和Xho I双酶切鉴定该重组质粒，同 时进行PCR检测，将酶切产物和PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。 结果显示，酶切结果和PCR检测结果均与预期结果一致，表明重组原核表达质粒构建成功。
[0056] 实施例2、鸭瘟病毒UL15基因exonl的诱导表达
[0057] (1)重组质粒 pPAL7_UL15exonI 的提取
[0058] 挑取已鉴定含阳性重组质粒pPAL7_UL15exonI的DH5 a菌种划线接种于含Amp 的LB琼脂平板上，37°C培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基上，剧烈振荡培养 10?16小时，离心收集菌液，按UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒 的提取与纯化。
[0059] (2)重组质粒pPAL7_UL15exonI转化表达菌
[0060] 采用氯化钙法制备大肠杆菌Rossetta感受态细胞，并将上述提取的重组质粒 pPAL7-UL15exonI转化到表达宿主菌大肠杆菌Rossetta中，并用含Amp的LB培养基筛选阳 性克隆。
[0061] (3)重组质粒pPAL7_UL15exonI的诱导表达及可溶性分析
[0062] 将含有重组质粒和含有PPAL7空载质粒的大肠杆菌Rossetta，分别接种于5mL含 Amp的LB液体培养基，37°C培养过夜，次日取菌液按体积比为1:50的比例接入200ml含Amp 的LB液体培养基中，剧烈振荡培养至0D600 = 0. 4时，分别加入IPTG至终浓度为0. 2_〇1/ L诱导培养，收集含有重组质粒和含有PPAL7空载质粒的菌液，分别按下步骤处理：4°C， lOOOOr/min离心 lOmin，菌体沉淀用 20mL 20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20°C过夜后， 加溶菌酶至终浓度为lmg/mL，4°C搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（600w，3〇 sec/ 次，10次），4°C，10000r/min离心IOmin,取上清备用；沉淀用适量的8mol/L的尿素溶液 (10mm 〇l/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀，低温保存备用。分别取适量的上清和尿素溶液 溶解的沉淀，向其中加入40 ii L超纯水和10 ii L IOX SDS上样缓冲液，KKTC水浴加热变性 lOmin，进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后观察，结果如图4所示，含 重组表达质粒pPAL7-UL15eX〇nI的表达菌株在48kDa处有目的蛋白，而含pPAL7空载体的 表达菌株未见目的条带表达。且表达的重组蛋白主要存在于沉淀中，表明重组表达蛋白在 菌体中以不溶的包涵体形式存在。
[0063] (4)重组质粒pPAL7_UL15exonI表达条件的优化
[0064] a.诱导剂IPTG的浓度优化
[0065] 取含重组质粒pPAL7_UL15exonI的表达宿主菌大肠杆菌Rossetta,接种于5mL含 Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按体积比为1:50转接种于6份200ml 含Amp的LB液体培养基中，37 °C培养培养至0D600值约0. 4?0. 6时，于6份培养基中分 别加入 IPTG 至终浓度为 0mmol/L、0. 2mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L> I. Ommol/L> I. 2mmol/ L，于37°C诱导4h后，然后按上述方法对样品进行处理，处理后用12%的SDS-PAGE电泳检 测，结果如图5所示。结果显示，IPTG浓度为Ommol/L时无特异性蛋白条带；当IPTG浓度 为0. 2mmol/L时出现特异性蛋白条带，但是随IPTG浓度的增高，蛋白的表达量没有继续增 力口。因此，考虑到节约试剂材料，选择0. 2mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。
[0066] b.温度条件优化
[0067] 取含重组质粒pPAL7_UL15exonI的表达宿主菌大肠杆菌Rossetta,接种于5mL含 Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按体积比为1:50转接种于3份200ml 含Amp的LB液体培养基中，37°C培养培养至0D600值约0. 4时，于3份培养基中加入IPTG 至终浓度为〇. 2mmol/L，然后分别置于25°C、30°C和37°C诱导2h，按上述方法对样品进行 处理，处理后用12%的SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示。结果显示，当IPTG终浓度为 0. 2mmol/L时，当温度在25°C和30°C时，重组蛋白表达量较少，而当稳定为37°C时重组表达 量最多。因此，选择温度37°C作为最佳诱导温度。
[0068] c.诱导时间优化
[0069] 取含重组质粒pPAL7_UL15exonI的表达宿主菌大肠杆菌Rossetta,接种于5mL含 Amp的LB液体培养基中，37°C振摇培养过夜。次日按体积比为1 :50转接种于7份200ml含 Amp的LB液体培养基中，继续培养至0D600值约0. 4时，加入IPTG至终浓度为0. 2mmol/L， 然后于37°C条件下分别诱导0h、2h、3h、4h、5h、6h和过夜，按上述方法对样品进行处理，处 理后用12%的SDS-PAGE电泳检测，结果如图7所示。结果显示，在诱导4h时重组蛋白的表 达量相对较高，2h和6h的表达量略低于4h的表达量，而在过夜诱导后的条带中没有明显的 目的条带。因此，选择4h作为最佳诱导时间。
[0070] (5)鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白的大量制备与纯化
[0071] 将UL15exon I蛋白在最佳的诱导表达条件下进行大量的表达，于4°C、10000r/ min离心IOmin收集菌体后将菌体沉淀用20mmol Tris-HCl (pH8. 0)悬浮，置-20°C过夜 后按lmg/mL加溶菌酶，4°C搅拌30min，超声波（冰浴）间歇破碎菌体（200w，3〇 sec/次， 5?10次），4°C lOOOOr/min离心IOmin以收集包涵体。将收集到的包涵体用2mol/L尿 素溶液（10mm〇l/LPBS+2mol/L尿素+0? 2% Triton X-100)进行洗涤，约洗涤5-10次，每次 洗漆后4°C，10000r/min离心IOmin,最后的沉淀用适量的8mol/L的尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解，然后用SDS-PAGE电泳检测，结果如图8所示。结果显示，纯化样品 在45kDa条带附近有目的条带，与未纯化的样品相比，纯化的条带有且只有一条，表明本发 明的方法能够获得高纯度的目的蛋白。
[0072] 实施例3、鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白检测鸭瘟病毒抗体
[0073] (1)鸭抗鸭瘟病毒IgG的提取
[0074] 取5ml鸭抗鸭瘟病毒血清置于50ml的离心管中，加生理盐水5ml，再逐滴加入 (NH4)2SO4饱和溶液2. 5ml，使其成为20%的（NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静 置30min ;然后于4 °C、3000r/min离心20min，弃沉淀，在上清液中再加入（NH4) 2S04溶液 7.51111，使其成为50%的（順4)304溶液，充分混匀后，静置301^11;然后于41：，300017 /1^11 离心20min，弃上清，沉淀中加入5ml的生理盐水，使之溶解，再加入饱和（NH4)2SO 4溶液 2. 5ml，使其成为33. 3 %的（NH4) 2S04溶液，充分混匀后静置30min ;再在4°C，3000r/min离 心20min，弃上清，重复此步骤2-3次，最后用2. 5ml生理盐水溶解沉淀后装入透析袋，再用 生理盐水进行透析，得鸭抗鸭瘟病毒IgG。透析后以质量分数为1 %的BaCl2溶液检查透析 后的抗体溶液中是否还存在硫酸根离子。将抗体小体积分装后于_20°C保存备用，尽量避免 抗体反复冻融。
[0075] (2)鸭瘟病毒UL15基因exonl重组蛋白对鸭瘟病毒抗体的检测
[0076] 按照实验例2优选的条件表达UL15基因exonl重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳， 以UL15基因exonl重组蛋白作为鸭瘟病毒抗体捕获剂，并采用western-blot对鸭抗鸭瘟 IgG进行检测。具体操作步骤如下：将PVDF膜按照所需剪成合适的大小，于使用前浸泡于 100 %的甲醇中15s，再于双蒸水中清洗2min，使用前再将其浸于转膜缓冲液中不少5min ; 将凝胶及滤纸剪成合适大小并浸泡于转膜缓冲液中，将其按照以下顺序进行安装：将黑色 的板放置于最下一层，其上一次叠放海棉1张、湿润的滤纸3张、凝胶、PVDF膜、湿润的滤纸 3张、海棉1张；将所需的材料叠放好后，将其夹紧放入转印槽中，注意正、负极的放置。将 注满转膜缓冲转印槽置于冰水混合物中，以防止转膜过程中产热过多，起到降温的作用；转 膜的程序为90v,60min。将转印好的PVDF膜浸泡于100%的甲醇中IOs,之后于滤纸上晾干 约15min ;将鸭抗鸭瘟病毒IgG用PBS缓冲液进行I :1000倍稀释，其中加1 %的BSA，将膜 置于其中，37°C孵育Ih ;用PBS缓冲液轻轻漂洗PVDF膜，每次洗10s，共洗两次；将HRP标记 的羊抗鸭IgG用PBS缓冲液进行I :500倍稀释，不加BSA，将PVDF膜浸泡于其中，37°C孵育 Ih ;用PBS缓冲液清洗PVDF膜2次，每次IOs ;用DAB显色液对PVDF膜避光显色，结果如图 9所示。结果显示，在48kDa的条带附近有一条清晰的特异性目的条带出现，说明鸭抗鸭瘟 病毒IgG与UL15基因exon I重组蛋白反应原性良好，因此UL15基因exon I重组蛋白可 以用来作为鸭瘟病毒抗体的检测试剂。
[0077] 实施例4、鸭瘟病毒UL15基因exon I重组蛋白鼠抗多克隆抗体的制备
[0078] 按实施例2优选的条件对UL15基因exonl重组蛋白进行大量表达并纯化。将纯化 好的UL15基因exonl重组蛋白用8mol/L尿素溶解（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）后加入 复性稀释缓冲液（50mmol/L Tris-base、lmmol/L EDTA> lOOmmol/L NaCl、0. 25mol/L L-精 氨酸、0. lmmol/L氧化型谷胱甘肽、lmmol/L还原型谷胱甘肽、5%甘油）。将稀释后的蛋白 液装入处理好的透析袋中置于复性透析缓冲液（不同浓度的尿素、50mmol/L Tris-base、 0.5mol/L EDTA、150mmol/L NaCl、0.6mol/L L-精氨酸）中进行尿素梯度复性。复性透析缓 冲液中的尿素浓度由 8mol/L-6mol/L-4mol/L-2mol/L-lmol/L-〇mol/L，每 12h 更换一次透 析液，最后用PBS缓冲液进行透析复性，将复性好的蛋白液吸到超滤管中进行超滤。将超滤 后的复性蛋白与完全弗氏佐等量混合并乳化充分，对小鼠进行一免。一免过后14天将超滤 后的复性蛋白与不完全弗氏佐齐等量混合并充分乳化后对小鼠进行二免、三免。四免时使 用不加弗氏佐剂的超滤后的复性蛋白进行免疫。四免过后7天，摘取小鼠的眼球进行采血， 采血后将其在37°C放置lh，之后4°C过夜。析出血清后，4000r/min离心IOmin收集血清， 放于-20°C保存备用。具体免疫程序如表1所示：
[0079] 表1、UL15基因exonl重组蛋白免疫小鼠程序
[0080]

【权利要求】
1. 鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白，其特征在于：所述鸭瘟病毒UL15基因 exonl重 组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 根据权利要求1所述的鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白，其特征在于：编码所述 鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 权利要求1或2所述鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤：将含有重组表达载体的大肠杆菌Rossetta在含有Amp的LB液体培养基中 培养过夜，然后取菌液按体积比为1 :50?1 :100接入含Amp的LB液体培养基中，培养至 0D600为(λ 4?(λ 6时，加入IPTG至终浓度为(λ 2?L 2mmol/L，在温度为25?37°C条件 下诱导培养2?6小时，收集培养菌液，培养菌液中含有鸭瘟病毒UL15基因 exon I重组蛋 白； 所述重组表达载体为将SEQ ID NO. 3所示核酸序列通过BamHI和Xhol连接原核表达 质粒pPAL7而得。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述IPTG的终浓度为0. 2mmol/L。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：诱导培养为在37°C条件下诱导培养 4小时。
6. 根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于：诱导培养后还包括纯化步 骤， 将诱导表达的菌液离心，收集菌体，菌体用PH8. 0的20mm〇lTris-HCl悬浮；置-20°C过 夜后按lmg/mL加溶菌酶，4°C搅拌30min，冰浴下超声波间歇破碎菌体，然后离心收集包涵 体，收集的包涵体用含10mm〇l/L PBS、2mol/L尿素和质量分数为0· 2%的Triton X-100的 洗液重复洗涤5-10次，洗涤后离心收集沉淀，最后沉淀用含10mm〇l/L PBS和8mol/L尿素 溶液溶解沉淀；得纯化的鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，纯化后还包括复性步骤：将纯化好的 鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白加入复性稀释缓冲液，然后装入透析袋中依次置于尿 素浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L、lmol/L和Omol/L的复性透析缓冲液中进行复 性，每12小时更换一次透析液，再用PBS缓冲液进行透析复性，最后用超滤管进行超滤得 复性的鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白；所述复性稀释缓冲液含50mmol/L Tris-base、 lmmol/LEDTA、100mmol/L NaCl、0. 25mol/L L_ 精氛酸、0· lmmol/L 氧化型谷胱;甘肤、lmmol/ L还原型谷胱甘肽和5%甘油（V/V);所述复性透析缓冲液含含有50mmol/L Tris-base、 0. 5mol/LEDTA、150mmol/L NaCl 和 0· 6mol/L L-精氛酸。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述离心是在4°C、lOOOOr/min条件 下离心10min。
9. 权利要求1或2所述鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白在制备鸭瘟病毒抗体捕获 剂中的应用。
10. 权利要求1或2所述鸭瘟病毒UL15基因 exonl重组蛋白在制备抗鸭瘟病毒多克隆 抗体的抗原中的应用。
【文档编号】C12P21/02GK104292310SQ201410520084
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】杨乔, 程安春, 汪铭书, 孙昆峰, 贾仁勇, 朱德康, 陈舜, 刘马峰 申请人:四川农业大学