用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用，属于生物【技术领域】。用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80。本发明还提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用所述组合物处理1-6h。本发明用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率。本发明制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了107.5TCID50。
【专利说明】用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物 及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（porcinecircovirus，PCV)是迄今发现的最小的病毒，无囊膜、基因 组为单股环状DNA。猪圆环病毒分PCVl和PCV2(猪圆环病毒2型）两个血清型，其中，PCVl 对猪没有致病性。上世纪90年代初，从断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS)中分离PCV2， PCV2自出现起即被认为是危害世界养猪业重要的病原。现已证明PCV2还可以造成育肥猪 皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy sdrome, F1DNShPCV^相关性繁殖 障碍、猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC)和先天性震颤 (congenital tremors, CT)等疾病。现将PCV2所引起的各种疾病统称为猪圆环相关性疾病 (PCVAD)。
[0003] 随着商品化PCV2疫苗的成功使用，PCVAD得到有效控制。无论在商业化的养殖场， 还是在实验条件下，商品化的PCV2疫苗均能有效保护PCV2的感染。由于PCV2在PK-15细 胞系复制效率较低，因此市售疫苗抗原采用在PK-15细胞接毒后多次传代的方法不断提高 病毒滴度，并伴随使用刺激剂。即便如此，大部分PCV2疫苗灭活前疫苗抗原含量也仅仅能 达到10 6_°TCID5(l/mL左右。这严重制约了疫苗的产量，并使疫苗的价格显著上升，为研制高 效、经济的PCV2疫苗带来了障碍。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高 猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率。
[0005] 本发明的另一目的是提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养， 每晕升病毒液的滴度就达到了 i〇7_5tcid5(i。
[0006] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0007] 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β -环糊精和吐 温-80。
[0008] 优选的技术方案中，所述组合物中甲基-β -环糊精的浓度为I. 0-4g/L，吐温-80 的体积浓度为〇. 5-5ml/L。
[0009] 优选的技术方案中，所述组合物还含有MEM培养基。
[0010] 一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采 用权利要求1-3之一所述组合物处理l_6h。
[0011] 优选的技术方案中，所述宿主细胞为PK-15细胞。
[0012] 优选的技术方案中，所述宿主细胞采用所述组合物处理后，弃去所述组合物，接种 猪圆环病毒2型，进行病毒的细胞培养。
[0013] 优选的技术方案中，所述猪圆环病毒2型的传代次数为4-6次，每代培养时间为 40-80小时。
[0014] 优选的技术方案中，所述传代比例为1:2-4。
[0015] 本发明用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2 型对PK-15细胞的感染效率，价格低廉。
[0016] 本发明制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴 度就达到了 IO7 5TCID5tl。该方法显著降低了人力和疫苗成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1.不同刺激物刺激PK-15细胞后PCV2DBN-SX07株感染效率间接免疫荧光图 片.其中A :阴性对照孔的间接免疫荧光图片；B :阳性对照孔的间接免疫荧光图片；C :刺激 物Bl处理孔的间接免疫荧光图片；D :刺激物B2处理孔的间接免疫荧光图片；E :刺激物B3 处理孔的间接免疫荧光图片；F :刺激物Al处理孔的间接免疫荧光图片；G :刺激物A2处理 孔的间接免疫荧光图片；H :刺激物A3处理孔的间接免疫荧光图片；I :刺激物Cl处理孔的 间接免疫荧光图片J :刺激物C2处理孔的间接免疫荧光图片；K :刺激物C3处理孔的间接 免疫荧光图片。
[0018] 图2.实施例3中各方法获得的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫 荧光图片。Control为未刺激PK-15细胞后接毒第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间 接免疫荧光图片；Al、A2或A3分别为刺激物Al、A2或A3刺激PK-15细胞后制备的第3代 和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；B1、B2或B3分别为刺激物B1、B2或B3 刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；C1、C2 和C3分别为刺激物C1、C2、C3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性 细胞间接免疫荧光图片。
【具体实施方式】：
[0019] 本发明组合物能够提高PCV2感染效率，本发明中以PCV2DBN-SX07株为例。 PCV2DBN-SX07株（Genbank NO. :FJ660968)公开于猪圆环病毒2型毒株分离鉴定和体外增 殖特性研究[J]，王贵华等，中国畜牧兽医2012年第39卷第一期，17?22。
[0020] D-氣基甸萄糖、吐温-80 (Tween-80)和甲基环糊精 (Methyl-beta-cyclodextrin，缩写 MPCD)购自 CRODA 和 Sigma。
[0021] MEM培养基购自Gibco。
[0022] PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液）：是含有137mM氯化钠、2. 7mM氯化钾、IOmM磷酸二氢 钠和2mM磷酸二氢钾的水溶液。
[0023] PBST缓冲液：含0· 5%。（体积浓度）Tween-20的PBS缓冲液。
[0024] PK-15 细胞系（ATCC, American Type Culture Collection)，接毒前在含血清 MEM 培养基中逐步传代克隆以去除PCVl污染。
[0025] MOI (multiplicity ofinfection):感染复数。
[0026] 实施例1本发明组合物提高PCV2对PK-15细胞的感染效率
[0027] 1.刺激物的筛选
[0028] 在MEM培养基中添加不同浓度Tween_8O、M0⑶配制刺激物，考察这两种物质单独 或者共同刺激PK-15细胞，对PCV2病毒感染效率的影响，刺激物中T Ween-80、Mi3 CD的含量 如表1所示。
[0029] 表1刺激物中Tween-80、Mβ CD的含量
【权利要求】
1. 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-0 -环糊精和吐 温-80。
2. 根据权利要求1所述用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，其特征在于所述 组合物中甲基-0 -环糊精的浓度为1. 〇_4g/L，吐温-80的体积浓度为0. 5-5ml/L。
3. 根据权利要求1或2所述用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，其特征在于 所述组合物还含有MEM培养基。
4. 一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于宿主细胞在接种猪圆环病毒2 型之前，采用权利要求1-3之一所述组合物处理l_6h。
5. 根据权利要求4所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主细胞 为PK-15细胞。
6. 根据权利要求5所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主细胞 采用权利要求1-3之一所述组合物处理后，弃去所述组合物，接种猪圆环病毒2型，进行病 毒的细胞培养。
7. 根据权利要求6所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述猪圆环病 毒2型的传代次数为4-6次，每代培养时间为40-80小时。
8. 根据权利要求7所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述传代比例 为 1:2-4。
【文档编号】C12N7/00GK104404002SQ201410766884
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】华涛, 侯继波, 张雪花, 冯磊, 陈丽, 吴培培, 张道华, 唐波 申请人:江苏省农业科学院