一种醪液的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种醪液的制备方法为：将农作物秸秆经过汽爆预处理；在所述预处理后的产物中，加入纤维素酶和驯化后的酿酒酵母菌进行酶解和发酵，得到醪液。首先本发明采用汽爆预处理，没有添加化学物质，无需脱毒处理，简化了流程。其次，本发明采用了驯化后的酿酒酵母菌进行发酵，驯化后的酿酒酵母菌对发酵产生的抑制物具有较好的适应能力，发酵效果好。第三，本发明采用酶解和发酵同步进行，酶解产生的糖迅速被代谢产生乙醇，消除了底物糖浓度增加对纤维素酶的反馈抑制作用，简化了流程，减少了糖液损失，提高了生产效率。
【专利说明】一种醪液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纤维素乙醇生产领域，特别涉及醪液的制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着石油资源的逐渐枯竭和环境的日益恶化，大力推广使用可再生能源技术已成 为许多国家能源发展战略的重要组成部分，以减少对石油资源的依赖和温室气体的排放。
[0003] 纤维素乙醇技术，是一种高端的清洁能源技术，因为它可以被用来替代传统的粮 食乙醇技术，利用地球上广泛存在的纤维素质生物原料生产清洁的乙醇燃料，被寄予了很 高的期望。
[0004] 纤维素乙醇是指以纤维素生物质为原料生产的乙醇。纤维素生物质是由纤维素 (30-50% )，半纤维素（20-40% )，和木质素（15-30% )组成的复杂材料，其可以为农作物 秸杆、林业加工废料、甘蔗渣等废弃物。
[0005] 在纤维素乙醇的生产过程中，品质较高的醪液是重要中间产物。将醪液经过蒸馏 脱水即可得到乙醇。
[0006] 醪液的生产方法为：（1)以纤维素生物质为原料，按照酸法水解、碱法水解或添加 化学药剂爆破法进行预处理；（2)经预处理后的原料通过纤维素酶使其中的纤维素及半纤 维素转化为可发酵的酶解糖液；(3)酶解糖液经过固液分离、脱毒，去除预处理中添加的 酸、碱或化学药剂；(4)加入酿酒酵母，通过酿酒酵母菌使酶解糖液中的单糖发酵生产出含 有乙醇的成熟醪液。
[0007] 在现有的醪液的生产方法中，酶解和发酵分两个阶段进行，酶解反应因为产物抑 制作用而使反应速度降低，反应进行不完全，降低了酶解效率；而且生产周期长，降低了生 产效率；酶解糖液需要进行固液分离机脱毒处理，工艺复杂，糖液部分损失。
【发明内容】
[0008] 本发明解决的技术问题在于提供一种醪液的制备方法，酶解及发酵同步进行，生 产周期短，生产效率高。
[0009] 本发明公开了一种醪液的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (A)将农作物秸杆经过汽爆预处理；
[0011] (B)在所述预处理后的产物中，加入纤维素酶和驯化后的酿酒酵母菌进行酶解和 发酵，得到醪液；
[0012] 所述酿酒酵母菌的驯化方法为：
[0013] 将活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒 母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（80?90) : (10?20);
[0014] 将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒 母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（60?70) : (30?40);以后 每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ;
[0015] 所述酶解糖液的制备方法为：
[0016] 在所述汽爆预处理后的产物中添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液。
[0017] 优选的，所述玉米糖化醪的制备方法为：
[0018] 将玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分钟；然后加入糖化酶， 50?60 °C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
[0019] 优选的，所述步骤（A)中，所述汽爆预处理的蒸汽压力为L 2?I. 8Mpa。
[0020] 优选的，所述步骤（A)中，汽爆预处理的时间为8?15分钟。
[0021] 优选的，所述步骤（B)中，所述纤维素酶的添加量为预处理产物绝干质量的1? 1. 5%〇
[0022] 优选的，所述步骤（B)中，所述酶解的PH值为4. 8?5. 2。
[0023] 优选的，所述步骤（B)中，所述酿酒酵母菌的添加量为预处理产物绝干质量的5? 10%〇
[0024] 优选的，所述步骤（B)中，所述酶解和发酵的时间为60?72小时。
[0025] 优选的，所述步骤（B)中，所述酶解和发酵的温度为25?35°C。
[0026] 与现有技术相比，首先本发明采用汽爆预处理，没有添加化学物质，无需脱毒处 理，简化了流程。其次，本发明采用了驯化后的酿酒酵母菌进行发酵，驯化后的酿酒酵母菌 对发酵产生的抑制物具有较好的适应能力，发酵效果好。第三，本发明采用酶解和发酵同步 进行，酶解产生的糖迅速被代谢产生乙醇，消除了底物糖浓度增加对纤维素酶的反馈抑制 作用，简化了流程，减少了糖液损失，提高了生产效率。
【具体实施方式】
[0027] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是 应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的 限制。
[0028] 本发明实施例公开了一种醪液的制备方法，包括以下步骤：
[0029] (A)将农作物秸杆经过汽爆预处理；
[0030] (B)在所述预处理后的产物中，加入纤维素酶和驯化后的酿酒酵母菌进行酶解和 发酵，得到醪液；
[0031] 所述酿酒酵母菌的驯化方法为：
[0032] 将活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒 母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（80?90) : (10?20);
[0033] 将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒 母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（60?70) : (30?40);以后 每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ;
[0034] 所述酶解糖液的制备方法为：
[0035] 在所述汽爆预处理后的产物中添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液。
[0036] 在本发明中，制备的醪液为纤维素乙醇的中间产物，将所述醪液经过蒸馏脱水即 可得到纤维素乙醇。
[0037] 按照本发明，首先将农作物秸杆经过汽爆预处理，所述汽爆预处理的蒸汽压力优 选为I. 2?I. 8MPa，汽爆预处理的时间优选为8?15分钟。汽爆预处理的温度优选为180? 200°C。具有细胞结构的植物原料在高压、高温介质下汽相蒸煮，半纤维素和木质素产生一 些酸性物质，使半纤维素降解成可溶性糖，同时复合胞间层的木质素软化和部分降解，从而 削弱了纤维间的粘结。然后突然减压，介质和物料共同作用完成物理的能量释放过程。物料 内的汽相介质喷出瞬间急速膨胀，同时物料内的高温液态水迅速暴沸形成闪蒸，对外作功， 使物料从胞间层解离成单个纤维细胞。汽爆预处理后的产物更易于酶解和发酵。
[0038] 得到所述预处理后的产物后，加入纤维素酶和酿酒酵母菌进行酶解和发酵，得到 醪液。本发明对于纤维素酶的来源没有特殊限制，市售产品即可。所述纤维素酶的添加量 优选为预处理产物绝干质量的1?1. 5%。本发明采用的酿酒酵母菌为驯化后的酵母菌，所 述酿酒酵母菌的添加量优选为预处理产物绝干质量的5?10%。所述酿酒酵母菌的驯化方 法为：
[0039] 将活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒 母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（80?90) : (10?20);
[0040] 将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒 母；在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（60?70) : (30?40);以后 每一代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70%。
[0041] 在制备酿酒酵母菌的过程中，首先对酿酒酵母菌进行活化。所述酿酒酵母菌优选 为安琪酿酒干酵母。所述活化的方法优选为：将酿酒酵母菌液体培养基中进行活化，所述活 化的温度为35?40°C，活化时间为0. 5?1. 5小时。本发明对于液体培养基的组成没有特 殊限制，选用本领域技术人员熟知的活化培养基即可。
[0042] 得到活化后的菌种后，将所述活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混 合物中进行培养，得到小酒母。所述玉米糖化醪制备方法优选为：
[0043] 将玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分钟；然后加入糖化酶， 50?60 °C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
[0044] 所述酶解糖液的制备方法为：
[0045] 在所述汽爆预处理后的产物中添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液。
[0046] 在所述制备酶解糖液的过程中，所述纤维素酶的添加量优选为预处理产物绝干质 量的1?1. 5 %，更优选为1. 2 %?1. 3 %。所述酶解时的PH值优选为4. 0?5. 0,更优选 为 4. 3 ?4. 8。
[0047] 按照本发明，培养小酒母的过程中，所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为 (80?90) : (10?20)，优选为90 :10,85:15或88:12。所述混合物中，优选的还可以加入 营养盐，如0. 075%的磷酸二铵，0. 075 %的尿素和0. 05%的硫酸镁。所述培养的温度优选 为25?35°C，更优选为28?32°C。所述培养时间优选为8?12小时，更优选为9?10 小时。所述培养的PH值优选为4. 0?5. 0,更优选为4. 3?4. 8。
[0048] 按照本发明，得到所述小酒母后，将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合 物中进行多代扩大培养，得到大酒母。所述混合物中，优选的还可以加入营养盐，如0.075% 的磷酸二铵，0. 075%的尿素和0. 05%的硫酸镁。所述多代指两代及两代以上。在扩大培养 中使用的酶解糖液与所述培养小酒母过程中使用的酶解糖液相同。在第一代扩大培养中， 玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（60?70) : (30?40)，优选为70:30 ;然后在以后每一 代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70%。本 发明对每一代扩大培养中，酶解糖液的增加量没有特殊限制，可以根据本领域技术人员的 经验适当调节。优选的，每一代扩大培养中，酶解糖液的增加量为玉米糖化醪和酶解糖液重 质量的10%，直至所述混合物中的酶解糖液质量为85%?95%。所述扩大培养的代数优 选为2?10代。驯化后的酵母菌适应汽爆预处理产物的复杂环境，可以代谢五碳糖和六碳 糖，不用经过脱毒即可直接进行乙醇发酵，而且保持较高的乙醇生产能力。
[0049] 按照本发明，预处理产物加入纤维素酶和驯化后的酿酒酵母菌后酶解和发酵同步 进行，得到醪液。本发明采用酶解和发酵同步进行，酶解产生的糖迅速被代谢产生乙醇，消 除了底物糖浓度增加对纤维素酶的反馈抑制作用，简化了流程，减少了糖液损失，提高了生 产效率。所述酶解和发酵的时间优选为60?72小时，更优选为65?70小时。所述酶解 的PH值优选为4. 8?5. 2。所述酶解和发酵的温度优选为25?35°C。
[0050] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的醪液的制备方法进行说 明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0051] 实施例1
[0052] (1)酿酒酵母菌驯化：
[0053] 配置活化培养基：将2%葡萄糖20ml，0. 375克磷酸二铵，0. 375克尿素，0. 25克硫 酸镁混合，加水至500ml。
[0054] 制备酶解糖液：将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 4MPa下维持10分钟，得到 预处理产物；迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1. 2% 添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4. 8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0055] 在所述活化培养基中添加干酵母0. 5g，摇匀后置38°C水浴锅活化1小时。
[0056] 将20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和IOml酶解糖液中，置于30°C水 浴锅中，通风培养10小时，得到小酒母。
[0057] 将150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0058] 将150ml第一代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母。所述第二代大酒 母即可用于发酵。
[0059] 采用所述第三代大酒母进行发酵：用IOOOml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4. 8,按 5%的接种量，即25g成熟第二代大酒母接入，置培养箱厌氧发酵多50小时。在50小时后， 葡萄糖全部被代谢，乙醇浓度为62. Og/L，乙醇产率为0. 48g/g，达到理论值得92%。五碳 糖代谢60%，乙醇浓度0. 71g/L，乙醇产率为0. 05g/g。
[0060] 在相同条件下，用1000ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4. 8,按5%的接种量，即 25g活化后的酿酒酵母接入，置培养箱厌氧发酵72小时。五碳糖代谢40%，乙醇产率只有 0. 36g/g，糖占理论产率的70. 1 %。
[0061] (2)将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 4MPa下维持10分钟，得到预处理产 物；
[0062] 按照所述预处理产物绝干质量的1. 2%加入纤维素酶，按照预处理产物绝干质量 的10%加入驯化后的第二代大酒母，酶解发酵72小时，得到醪液。
[0063] 重复了 6个批次，每个批次做两罐。发酵结果参见表1。
[0064] 实施例2
[0065] (1)酿酒酵母菌驯化：
[0066] 配置活化培养基：将2%葡萄糖20ml，0. 375克磷酸二铵，0. 375克尿素，0. 25克硫 酸镁混合，加水至500ml。
[0067] 制备酶解糖液：将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 5MPa下维持12分钟，得到 预处理产物；迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1. 2% 添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4. 8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0068] 在所述活化培养基中添加安琪酿酒干酵母0. 5g，摇匀后置36°C水浴锅活化1. 2小 时。
[0069] 将20克所述活化的酵母加入到85ml玉米糖化醪和15ml酶解糖液中，调整PH为 4. 5,置于28°C水浴锅中，通风培养12小时，得到小酒母。
[0070] 将150ml成熟的小酒母加入到280ml玉米糖化醪和120ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0071] 将150ml第一代大酒母加入到200ml玉米糖化醪和200ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母；
[0072] 将150ml第二代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第三代大酒母；所述第三代大酒 母即可用于发酵。
[0073] 采用所述第三代大酒母进行发酵：用IOOOml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4. 8,按 5%的接种量，即25g成熟第三代大酒母接入，置培养箱厌氧发酵多50小时。在50小时后， 葡萄糖全部被代谢，乙醇浓度为62. lg/L，乙醇产率为0. 46g/g，达到理论值得90%。五碳 糖代谢60%，乙醇浓度0. 71g/L，乙醇产率为0. 05g/g。
[0074] 在相同条件下，用1000ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4. 8,按5%的接种量，即 25g活化后的酿酒酵母接入，置培养箱厌氧发酵72小时。五碳糖代谢40%，乙醇产率只有 0. 36g/g，糖占理论产率的70. 1 %。
[0075] 说明未经驯化的酵母菌对组分复杂的酶解糖液的耐受能力较差。以上数据证明， 驯化后酵母菌种的酶解糖液耐受能力、五碳糖代谢能力和乙醇产率均有明显提高，驯化后 可有效降低细胞质膜上ATP合成酶对H+膜两侧梯度变化的敏感性，这保证了酵母细胞内氧 化磷酸化仍能正常使用，使得糖酵解过程顺利进行，提高了细胞的耐受能力。
[0076] (2)将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 5MPa下维持12分钟，得到预处理产 物；
[0077] 按照所述预处理产物绝干质量的1. 3%加入纤维素酶，按照预处理产物绝干质量 的8%加入驯化后的第三代大酒母，酶解发酵60小时，得到醪液。
[0078] 重复了 6个批次，每个批次做两罐。发酵结果参见表1。
[0079] 实施例3
[0080] (1)酿酒酵母菌驯化：
[0081] 配置活化培养基：将2%葡萄糖20ml，0. 375克磷酸二铵，0. 375克尿素，0. 25克硫 酸镁混合，加水至500ml。
[0082] 制备酶解糖液：将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 6MPa下维持14分钟，得到 预处理产物；迅速减压，得到汽爆预处理产物；然后按照所述预处理产物绝干质量的1. 2% 添加纤维素酶，在常压，45°C，PH4. 8条件下进行酶解，得到酶解糖液。
[0083] 在所述活化培养基中添加干酵母0. 5g，摇匀后置38°C水浴锅活化1小时。
[0084] 将20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和IOml酶解糖液中，置于30°C水 浴锅中，通风培养10小时，得到小酒母。
[0085] 将150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第一代大酒母；
[0086] 将150ml第一代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中， 调整PH为4. 5,置于30°C水浴锅中，通风培养8小时，得到第二代大酒母。所述第二代大酒 母即可用于发酵。
[0087] (2)将1000千克农作物秸杆，在蒸汽压力I. 6MPa下维持14分钟，得到预处理产 物；
[0088] 按照所述预处理产物绝干质量的1. 4%加入纤维素酶，按照预处理产物绝干质量 的5%加入驯化后的酿酒酵母菌，酶解发酵48小时，得到醪液。
[0089] 重复了 4个批次，每个批次做两罐。发酵结果参见表1。
[0090] 表1发酵后得到的醪液的成分组成
[0091]
【权利要求】
1. 一种醪液的制备方法，包括以下步骤： (A) 将农作物秸杆经过汽爆预处理； (B) 在所述预处理后的产物中，加入纤维素酶和驯化后的酿酒酵母菌进行酶解和发酵， 得到醪液； 所述酿酒酵母菌的驯化方法为： 将活化后的酿酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行培养，得到小酒母； 所述玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（80?90) : (10?20); 将所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中进行多代扩大培养，得到大酒母； 在第一代扩大培养中，玉米糖化醪和酶解糖液的质量比为（60?70) : (30?40);以后每一 代扩大培养中，逐渐增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液质量大于70% ; 所述酶解糖液的制备方法为： 在所述汽爆预处理后的产物中添加纤维素酶进行酶解，得到酶解糖液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述玉米糖化醪的制备方法为： 将玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分钟；然后加入糖化酶，50? 60 °C反应30?40分钟，得到玉米糖化醪。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（A)中，所述汽爆预处理的 蒸汽压力为1. 2?1. 8Mpa。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（A)中，汽爆预处理的时间 为8?15分钟。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B)中，所述纤维素酶的添 加量为预处理产物绝干质量的1?1. 5%。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B)中，所述酶解的PH值为 4. 8 ?5. 2〇
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B)中，所述酿酒酵母菌的 添加量为预处理产物绝干质量的5?10%。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B)中，所述酶解和发酵的 时间为60?72小时。
9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（B)中，所述酶解和发酵的 温度为25?35 °C。
【文档编号】C12R1/865GK104498537SQ201410839975
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】生晓东, 刘玉金, 肖伟良, 李学业 申请人:松原光禾能源有限公司