检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物的制作方法

检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物的制作方法
【专利摘要】本发明属于病毒分子生物学检测领域，本发明公开了一种检测猪细小病毒5型（Porcine parvovirus 5，PPV5）的环介导等温扩增反应引物。该方法根据猪细小病毒2型非结构蛋白NS1基因前段保守序列设计引物两对引物：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP。具体序列见SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4。根据所设计的引物建立一种检测猪细小病毒5型（PPV5）环介导等温扩增方法。该检测方法不与猪常见传染病病原发生交叉反应。本发明的检测方法现地实用性强，不需要昂贵仪器设备；准确性高，特异性强，灵敏度高。
【专利说明】检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测猪细小病毒5型(PPV5)的环介导等温扩增反应引物，属于病毒分子生物学检测领域。

【背景技术】
[0002]随着病毒宏基因组学的研究的不断深入，新发病毒的发现的报道越来越多。近年来，猪群中DNA病毒的报道越来越多，除去经典的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和猪圆环病毒(porcine circovirus type I and II, PCVl 和 PCV2),还见有猪细小病毒 2 型(porcine parvovirus type 2, PPV2)、猪细小病毒 3 型(porcine parvovirustype 3, PPV3)、猪细小病毒4型(porcine parvovirus type 4, PPV4)以及多种亚型的猪博卡病毒(porcine bocavirus, PBoV)。【参考文献:Xiao CT, Gimenez-Lirola LG, JiangYH, Halbur PG, Opriessnig T.Characterizat1n of a novel porcine parvovirustentatively designated PPV5.PLoS One, 2013, 8(6): e65312.】
猪细小病毒5型(porcine parvovirus type 5, PPV5)最早在美国报道。【参考文献:Xiao CT, Halbur PG, Opriessnig T.Complete genome sequence of a novel porcineparvovirus (PPV) provis1nally designated PPV5.2013, Genome Announc, 1:e00021 - 00012.】。目前，关于PPV5的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对猪细小病毒5型的防控有着重要意义。
[0003]目前，在对新发病毒进行分子流行病学采用的方法有PCR方法和环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)反应等方法。基于分子水平对猪细小病毒5型检测常根据病毒基因特征设计特异性引物进行PCR扩增，可及时准确的进行病原鉴别诊断，但是普通的PCR以及灵敏度更高的荧光定量PCR，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。环介导等温扩增方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度(60°C—65°C)。大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。目前，还未见针对环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)反应方法，但该属其他类型病毒如PPV1、PPV2和PPV4均已经有相应的LAMP检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。


【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
所述检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增方法的引物，是由一对外引物和一对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成。上述2对引物的序列如下:
F3:5， - GCCACACAAAAATAAACACG -3，，
B3: 5’ - TTTGTACATGGGAGCAGAT -3’，
FIP:5’ - TGCATAAAGACATTCTTTCAGTGGT-GAGCATGGAAAAGCACAG -3’，
BIP:5’ - TGGAGGTACAATAGGTGAAGCCT-CAATAACTGCTGGATCTTGTC -3’。
[0006]本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒5型快速诊断试剂中的用途。
[0007]本发明根据猪细小病毒5型基因组中NSl基因序列特征，设计特异性的LAMP引物，根据所设计的LAMP引物，建立一种检测猪细小病毒5型(PPV5)环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，本方法适用性好，准确度高，特异性强，灵敏度高。
[0008]敏感性实验表明，本发明所建立的检测方法能在60分钟内检测出43拷贝数/μ L的病毒核酸，比常规方法敏感100倍。同时，本发明中，加入一种绿色荧光染料SYBR I，该染料在反应液配制是加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。

【专利附图】

【附图说明】
[0009]图1为猪细小病毒5型LAMP特异性实验，其中1:猪细小病毒5型(PPV5)阳性DNA ；2:猪细小病毒(porcine parvovirus) DNA ;3:猪圆环病毒 2 型(Porcine circovurs type2)DNA ；4:猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudorabies)DNA ； 5:猪细小病毒5型(PPV5)阳性标准品 PPV5-NS1。
[0010]图2为猪细小病毒5型LAMP方法琼脂糖电泳实验。其中M:DL2000分子量标准；1:构建的PPV5-NS1质粒；2:猪细小病毒(porcine parvovirus) DNA ； 3:猪圆环病毒(Porcine circovurs type 2) DNA ;4:猪伪狂犬病毒(Porcine Pseudorabies) DNA。

【具体实施方式】
[0011]下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
[0012]实施例1
1.LAMP实验引物的设计
根据GenBank中登录的所有猪细小病毒5型基因序列和本研究室从我省现地猪场中检测到的猪细小病毒5型基因序列，进行分析比较，选择NSl基因前段保守区域片段(GENBANK 登录号 JX896318),利用 LAMP 引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)设计引物,包括外引物I对和内引物I对，具体序列见SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4。
[0013]2、毒株
猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。猪细小病毒5型阳性DNA由我省(福建省)现地猪场现地检测并保存。
[0014]3、病毒核酸的提取用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extract1n Kit Ver.4.0 (宝生物工程(大连)有限公司)按照说明书方法进行操作提取猪细小病毒5型阳性病料的DNA，并按照试剂盒的方法同时提取猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒基因组DNA，均放置一20°C保存备用。
[0015]4、阳性标准品的制备
以提取的PPV5病毒DNA为模板，用所设计的特异性引物(F:5 '-AGAACTTAGAAAATCCTGTAGA-3 '和 R:5' - TAGCAGGACCGTAAAACCATACA-3 '，扩增片段长度为 818 bp，扩增体系为 50 μ L，其中 Primix Taq? (Ex Taq? Vers1n) 25 μ L、上下游引物(20 μ Μ)各I μ L、DNA模板I μ L，补充灭菌去离子水至终体积50 μ L。反应条件:反应条件为94°C 5 min预变性后进入循环，循环参数为94°C 50s,55°C 35s、72°C 50s，35个循环后，72°C延伸lOmin。取PCR产物5 μ L，在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳。经胶回收试剂盒切胶回收纯化后与T载体连接，转化DH5 α感受态细胞，应用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒，并将阳性重组质粒送由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST分析表明，该阳性重组质粒符合实验预期，即作为猪细小病毒5型LAMP阳性标准品(PPV5-NS1)。将获得的阳性标准品用超微量核酸蛋白测定仪测定阳性质粒浓度，测定后计算拷贝数，置于一 20°C备用，使用前进行10倍连续稀释。
[0016]5、LAMP实验条件优化
使用Loopamp DNA扩增反应试剂盒(北京蓝谱生物科技有限公司)进行LAMP反应。每25 μ L反应体系中含有:2Χ反应液12.5 μ L、Bst DNA大片段聚合酶I μ L、F3和Β3各5pmol、FIP和BIP各40 pmol、以猪细小病毒5型阳性标准品为模板2 μ L、荧光染料I μ L，补充灭菌去离子水至终体积25yL。实验不同温度(601:、621:、641:、66°0、不同时间(30min、45min、60min)检测引物反应性能。优化后的反应条件为64°C反应45min。
[0017]6、特异性实验
取猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒提取的DNA进行LAMP反应，并重复实验操作一次。
[0018]7、敏感性实验
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，取拷贝数为4.3X 11拷贝数/ μ L至
4.3 X 16拷贝数/ μ L共6个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感度。并重复实验操作3次。
[0019]8、临床样品的检测
对本研究室收集的15份猪组织病料按照步骤3中的方法提取DNA后，进行LAMP和PCR检测。
[0020]实验结果
1、LAMP方法的特异性实验
1.1肉眼判定
猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均为阴性，而对猪细小病毒5型阳性DNA和有很好的扩增，本方法具有很好的特异性。此外，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定(见图1)。
[0021 ] 1.2琼脂糖凝胶电泳判定反应结束后，利用2%普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见加入PPV5阳性质粒大的反应管电泳后有不连续梯状电泳条带，加入猪细小病毒DNA、猪圆环病毒DNA和猪伪狂犬病毒DNA均无明显梯状电泳条带。
[0022]2、LAMP方法敏感性结果
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，确定猪细小病毒5型(PPV5)环介导等温扩增方法检测敏感度为43拷贝数/ μ L，其敏感性为普通PCR的100倍。
[0023]3、临床样品的检测
对本研究室收集的15份猪组织病料进行猪细小病毒5型LAMP检测，共有2份阳性样品，PCR检测仅有I份阳性样品，且PCR检测为阳性样品经LAMP检测方法检测也为阳性。
【权利要求】
1.一种用于检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物，其特征在于:所述的引物由I对外弓I物和I对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下:
F3:5， - GCCACACAAAAATAAACACG -3，，
B3: 5’ - TTTGTACATGGGAGCAGAT -3’，
FIP:5’ - TGCATAAAGACATTCTTTCAGTGGT-GAGCATGGAAAAGCACAG -3’，
BIP:5’ - TGGAGGTACAATAGGTGAAGCCT-CAATAACTGCTGGATCTTGTC -3’。
2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒5型快速诊断试剂中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104450976SQ201510002842
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】李家玉, 张奇, 杨晓燕, 张榕容, 胡晓努 申请人:福建农林大学