本发明属于生物技术发酵领域，具体涉及一种以饲用酶协同凝结芽孢杆菌生产高效蛋白饲料的方法。
背景技术：
：动物对大分子蛋白的吸收明显没有对小分子多肽和氨基酸的吸收好,同时植物性蛋白原料存在有多种抗营养因子,如脲酶、胰蛋白酶抑制剂、植酸、凝集素、脂肪氧化酶和大豆抗原蛋白等，影响营养成分的消化、吸收和代谢，对动物体的健康和生产性能产生不良影响，从而制约了植物蛋白在禽蓄饲养中更有效的应用。目前生产高效生物蛋白饲料的方法主要包括蛋白酶酶解和微生物降解。采用酶解蛋白饲料具有许多物理、化学改性无可比拟的优点，首先它可以在不降低营养价值的前提下改善蛋白质的功能特性。酶解蛋白产物主要是肽而不是氨基酸，如小肽铁、抗菌肽、免疫增强肽等等，这些肽类物质的消化率经实践证明，比氨基酸的消化吸收更快更好更完全，从而显著增加了豆粕的消化利用率，并可保护维生素效价。其次酶反应的条件温和，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。但是酶解豆粕存在一系列的限制因素，首先蛋白质水解过程中若没有微生物的参与改造，所产生的小肽类很多带有苦味，适口性不佳，尤其是大规模生产中，降低和脱除水解过程中的苦味和臭味需要很高的成本。其次固体酶解饲料蛋白，酶量添加量大，生产成本高。乳酸菌固体发酵蛋白饲料原料,可在发酵过程中增加蛋白质的消化率、提高游离氨基酸的含量,从而改善豆粕营养价值,同时,绝大多数乳酸菌能调节动物肠道功能紊乱和维系内源微生态平衡。然而传统的乳酸菌不能生成芽孢,对高温、强酸、强碱及胆盐的耐受性较差，经制粒、膨化等加工过程制备成微生态饲料并饲喂动物后能到达肠道的活菌数相对较少。凝结芽孢杆菌属于硬壁门肠道乳酸菌,是一类可产芽孢的特殊乳酸菌。除了具有传统乳酸菌可调节动物肠道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢状态对环境具有相当的抗逆性,对高温、胃酸和胆盐都有一定的耐受能力。1992年该菌种被美国食品与药品管理局(fda)和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全菌株名单中。近年来，利用微生物发酵法和酶解法去除豆粕中的抗营养因子及抑制剂，提高豆粕的营养价值方面的研究比较深，也取得了一些较好的成果。但是在利用菌、酶协同作用，提高植物蛋白(豆粕为主)营养价值及利用率的研究报道较少。饲用酶协同凝结芽孢杆菌生产高效蛋白饲料的方法，目前未见有关报道。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种一种以饲用酶协同凝结芽孢杆菌生产高效蛋白饲料的方法。具体是一种凝结芽孢杆菌协同饲用复合酶生产高效蛋白饲料的方法。本发明利用凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)为饲用芽孢乳酸菌，除了具有传统乳酸菌可调节动物肠道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢状态对环境具有相当的抗逆性，对高温、胃酸和胆盐都有一定的耐受能力，通过生物发酵植物蛋白原料，提高饲料干燥后的有机酸和芽孢乳酸菌数。同时本发明利用复合蛋白酶在酶解法生产的饲用肽，其肽含量和可溶性蛋白含量高，产品的营养性好，免疫活性强。利用凝结芽孢杆菌发酵过程将酶解产生的苦味肽基团进行重新组合与修饰，饲料苦味进一步降低。本发明把微生物发酵生产和酶解过程有机地结合在一起，降低了生产成本，提高饲料的利用率和饲料品质。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种以饲用酶协同凝结芽孢杆菌生产高效蛋白饲料的方法，包含如下步骤：各组分按质量百分比计：(1)制备凝结芽孢杆菌种子液；(2)凝结芽孢杆菌液体培养：液体培养基配方：酵母粉：15～30g/l，蛋白胨：0～10g/l，氯化钠：1～5g/l，麦芽糖：6～10g/l，淀粉：10～20g/l，硫酸镁：0.8～1.2g/l，硫酸锰：0.1～0.3g/l，磷酸氢二钠：1～5g/l，磷酸二氢钠：0～5g/l，初始ph值：6.8～7.4；培养时发酵罐装液量20～60％，种子液量1～3％，转速120～200r/min，通气量0.5～0.7m3/h，35～39℃培养15～20h；(3)凝结芽孢杆菌固态培养：物料与步骤(2)得到菌液按照1：0.8～1：1.2搅拌均匀，装入灭菌罐中，封口，36～42℃培养2～3天；所述的物料为豆粕：麸皮＝1:9；(4)将步骤(3)所得培养料0.4～1.0％、碱性蛋白酶(≥80u/mg)不低于0.2％、中性蛋白酶(≥70u/mg)不低于0.4％、酸性蛋白酶(≥150u/mg)不低于0.08％、料水比为1：0.6～1：1，均匀混合，得到豆粕混合物；所述的料水比中的料为豆粕：麸皮＝9.8：0.2～9.4：0.6；(5)将步骤(4)中得到的豆粕混合物直接装填在发酵罐中发酵，密封防止水分散发；(6)密封好后进行协同37～42℃酶解发酵，发酵时间3～5天；(7)得到的酶解发酵好的发酵豆粕，可直接饲喂畜禽。(8)按照步骤(7)所得发酵豆粕，在50～60℃条件下烘干至水分含量为10％，即得高效蛋白饲料。为了更好地实现本发明，步骤(1)中所述的凝结芽孢杆菌种子液，通过如下步骤制备得到：挑取凝结芽孢杆菌斜面1环，接种到装有lb液体培养基中，摇床37℃，180r/min培养6h，制成凝结芽孢杆菌种子液。步骤(1)中所述的凝结芽孢杆菌优选为凝结芽孢杆菌gim1.646、凝结芽孢杆菌gim1.421、凝结芽孢杆菌gw1.0042或凝结芽孢杆菌活菌片等；更优选为凝结芽孢杆菌gim1.646、凝结芽孢杆菌gim1.421或凝结芽孢杆菌gw1.0042。步骤(1)中所述的培养的温度优选为37℃；步骤(2)中所述的培养的温度优选为37℃；步骤(2)中所述的液体培养基配方：酵母粉：25g/l，蛋白胨：5g/l，氯化钠：2g/l，麦芽糖：6g/l，淀粉：20g/l，硫酸镁：1.2g/l，硫酸锰：0.3g/l，磷酸氢二钠：3g/l，磷酸二氢钠：5g/l，初始ph值：7.2；步骤(2)中所述的发酵罐装液量60％，种子液接种量1％，转速120r/min，空气流量0.6m2/h，37℃培养15h；步骤(3)中所述的物料与菌液按照1：1，搅拌均匀，装入灭菌罐中，封口，37℃培养3天；步骤(4)考虑经济成本及成品品质，选择固体培养料0.8％、碱性蛋白酶(80u/mg)0.2％、中性蛋白酶(70u/mg)0.4％、酸性蛋白酶(150u/mg)0.08％、料(豆粕：麸皮＝9.6：0.4)水比：1：0.8；步骤(6)中所述的发酵温度39℃，发酵时间4天；步骤(8)中所述的在55℃条件下烘干至水分含量为10％。一种高效蛋白饲料，是通过上述制备方法得到；所述的干燥后高效蛋白饲料形成较浓郁的酸香味；ph在3.2～4.5，有机酸含量2.8％以上；酸溶性蛋白较发酵前提高6.5倍以上，可溶性蛋白质相对分子量在500以内占60％以上；尿素酶活性低于0.073u/g，棉子糖含量低于0.42％，水苏糖低于0.035％；凝结芽孢乳酸菌数达5×109cfu/g以上。本发明的机理是：在密闭环境中，温度及初始培养ph值适宜条件下，初期蛋白生料中需氧菌利用有限氧气竞争性生长，氧气消耗后，霉菌及耗氧细菌无法生长。凝结芽孢杆菌有效利用碱性和中性蛋白酶解植物蛋白原料(豆粕)产生的酸溶性蛋白和氨基酸态氮和无氧环境成为优势菌，大量繁殖和产生有机酸(乳酸为主)，ph降低，抑制其他杂菌生长的同时，提供酸性蛋白酶酶解环境，协同组合和修饰苦味肽和提供酸溶性蛋白含量，提高干燥饲料的芽孢乳酸菌和蛋白质量。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)凝结芽孢杆菌是一种孢子型乳酸菌，具有一般乳酸菌因其有稳定好、抗逆性强、复活率高、代谢旺盛等特点。能够产生细菌素、有机酸和过氧化氢等物质抑制生料中致病菌生长，减少胺类有害物质的产生。(2)凝结芽孢杆菌产生的芽孢具有较强的抗逆性，饲料干燥过程，有效保存活菌数，动物摄入机体，能提高机体免疫和抗病能力，减少肠道疾病的发生，提高动物的健康水平。(3)碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解产生酸溶性蛋白，促进凝结芽孢杆菌的生长。凝集芽孢杆菌产酸，ph降低，提供酸性蛋白酶酶解环境，提高蛋白质水解程度。可溶性蛋白质相对分子量在500以内占60％以上，避开大豆多肽苦味最强的相对分子量500～1000d的区域。(4)菌酶协同处理豆粕，无需对豆粕进行灭菌处理，整个过程兼性厌氧和厌氧发酵，能耗小，干物质损失低。本发明的工艺流程操作简便，既适合养殖场直接生产投喂，也适合饲料厂规模化生产，同时，原料成本低，适合工业化生产。(5)本发明的发酵豆粕在发酵过程中产生大量有机酸以及有益菌，有较强的酸香味，适口性强。ph在3.2～4.5，有机酸含量2.8％以上；酸溶性蛋白较发酵前提高6.5倍以上，可溶性蛋白质相对分子量在500以内占60％以上；尿素酶活性低于0.073u/g，棉籽糖含量低于0.42％，水苏糖低于0.035％；凝结芽孢乳酸菌芽孢数达2.0×109cfu/g以上。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1按如下步骤实施：下述组分均按质量百分比计(1)不同来源凝结芽孢杆菌种子液制备：挑取凝结芽孢杆菌斜面1环，接种到装有100mllb液体培养基中250ml三角瓶中，摇床37℃，180r/min培养6h，制成种子液；(2)凝结芽孢杆菌液体培养：培养基配方：酵母粉：15g/l，氯化钠：5g/l，麦芽糖：8g/l，淀粉：15g/l，硫酸镁：0.8g/l，硫酸锰：0.2g/l，磷酸氢二钠：1g/l，磷酸二氢钠：3g/l，初始ph值：7.4。培养时发酵罐装液量40％，种子液量3％，转速160r/min，通气量0.6m3/h，培养35℃培养18h；(3)凝结芽孢杆菌固态培养：物料(豆粕：麸皮＝1:9)与步骤(2)得到菌液按照1：0.8搅拌均匀，装入灭菌罐中，封口，42℃培养2天；(4)将步骤(3)所得固体培养料0.4％、碱性蛋白酶(80u/mg)0.2％、中性蛋白酶(70u/mg)0.4％、酸性蛋白酶(150u/mg)0.08％、料(豆粕：麸皮＝9.8：0.2)水比：1：0.6，均匀混合，得到豆粕混合物；(5)将步骤(4)中得到的豆粕混合物直接装填在发酵罐中发酵，密封防止水分散发；(6)密封好后进行37℃协同酶解发酵，发酵时间5天。得到发酵好的发酵豆粕，可以直接作为饲料成品直接使用。得到的发酵豆粕干燥前作为饲料成品时的测量结果见表1。其中，酸溶性蛋白的含量依据qb/t2653-2004方法，有机酸是通过gb/t5009.39-2003方法测得，乳酸菌菌数含量依据gb4789.35-2010方法测得。得到的发酵豆粕干燥前作为饲料成品时的测量结果见表1。表1干燥前饲料成品的测量结果表1中所述凝结芽孢杆菌gim1.646、凝结芽孢杆菌gim1.421，由广东省微生物菌种保藏中心购买。表1中所述凝结芽孢杆菌gw1.0042，由广州市微生物研究所菌种库购买。表1中所述的凝结芽孢杆菌活菌片是市售产品。产品名称：爽舒宝(国药准字s20050032)。实施例2按如下步骤实施：下述组分均按质量百分比计(1)凝结芽孢杆菌(凝结芽孢杆菌gim1.646)种子液制备：挑取凝结芽孢杆菌斜面1环，接种到装有100mllb液体培养基中250ml三角瓶中，摇床37℃，180r/min培养6h，制成种子液；(2)凝结芽孢杆菌液体培养：培养基配方：酵母粉：30g/l，蛋白胨：10g/l，氯化钠：1g/l，磷酸氢二钠：5g/l，麦芽糖、淀粉、硫酸镁、硫酸锰含量设计试验(见表2)，初始ph值：6.8。培养时发酵罐装液量20％，种子液量2％，转速200r/min，通气量0.6m3/h，培养39℃培养20h；表2麦芽糖、淀粉、硫酸镁、硫酸锰含量设计试验试验编号a麦芽糖(g/l)b淀粉(g/l)c硫酸镁(g/l)d硫酸锰(g/l)11(6)1(10)1(0.8)1(0.1)21(6)2(15)2(1.0)2(0.2)31(6)3(20)3(1.2)3(0.3)42(8)1(10)2(1.0)3(0.3)52(8)2(15)3(1.2)1(0.1)62(8)3(20)1(0.8)2(0.2)73(10)1(10)3(1.2)2(0.2)83(10)2(15)1(0.8)3(0.3)93(10)3(20)2(1.0)1(0.1)(3)凝结芽孢杆菌固态培养：物料(豆粕：麸皮＝1:9)与步骤(2)得到菌液按照1：1.2搅拌均匀，装入灭菌罐中，封口，36℃培养3天；(4)将步骤(3)所得培养料1.0％、碱性蛋白酶(80u/mg)0.2％、中性蛋白酶(70u/mg)0.4％、酸性蛋白酶(150u/mg)0.08％、料(豆粕：麸皮＝9.4：0.6)水比：1：1，均匀混合，得到豆粕混合物；(5)将步骤(4)中得到的豆粕混合物直接装填在发酵罐中发酵，密封防止水分散发；(6)密封好后进行协同42℃酶解发酵，发酵时间3天；(7)得到的酶解发酵好的发酵豆粕，可直接饲喂畜禽。(8)按照步骤(7)所得发酵豆粕，在60℃条件下烘干至水分含量为10％。即得高效蛋白饲料。得到的发酵豆粕干燥后作为饲料成品时的测量结果见表3。有机酸测量见实施例1。芽孢菌数测量方法参考gb4789.2-2010，其中样品处理方法改为取25g样品置于225ml生理盐水煮沸15min。酸溶性蛋白提高倍数＝发酵后酸溶性蛋白/发酵前酸溶性蛋白，酸溶性蛋白测量方法见实施例1。尿素酶活性降低＝(发酵前尿素酶活性-发酵后尿素酶活性)/发酵前尿素酶活性×100％，尿素酶活性是通过gb/t8622-2006测得。表3干燥后饲料成品的测量结果实施例3按如下步骤实施：下述组分均按质量百分比计(1)凝结芽孢杆菌(凝结芽孢杆菌gim1.646)种子液制备：挑取凝结芽孢杆菌斜面1环，接种到装有100mllb液体培养基中250ml三角瓶中，摇床37℃，180r/min培养6h，制成种子液；(2)凝结芽孢杆菌液体培养：培养基配方：酵母粉：25g/l，蛋白胨：5g/l，氯化钠：2g/l，麦芽糖：6g/l，淀粉：20g/l，硫酸镁：1.2g/l，硫酸锰：0.3g/l，磷酸氢二钠：3g/l，磷酸二氢钠：5g/l，初始ph值：7.2。培养时发酵罐装液量60％，种子液量1％，转速120r/min，通气量0.6m3/h，培养37℃培养15h；(3)凝结芽孢杆菌固态培养：物料(豆粕：麸皮＝1:9)与步骤(2)得到菌液按照1：1搅拌均匀，装入灭菌罐中，封口，37℃培养3天；(4)将步骤(3)所得培养料0.8％、碱性蛋白酶(80u/mg)0.2％、中性蛋白酶(70u/mg)0.4％、酸性蛋白酶(150u/mg)0.08％、料(豆粕：麸皮＝9.6：0.4)水比：1：0.8，均匀混合，得到豆粕混合物；(5)将步骤(4)中得到的豆粕混合物直接装填在发酵罐中发酵，密封防止水分散发；(6)密封好后进行协同39℃酶解发酵，发酵时间3，4，5天；(7)得到的酶解发酵好的发酵豆粕，可直接饲喂畜禽。(8)按照步骤(7)所得发酵豆粕，在55℃条件下烘干至水分含量为10％。即得高效蛋白饲料。得到的发酵豆粕干燥后作为饲料成品时的测量结果见表4、表5。有机酸测量见实施例1。凝结芽孢杆菌芽孢数测量方法、酸溶性蛋白提高倍数见实施例2。尿素酶活性是通过gb/t8622-2006测得。棉籽糖、水苏糖、可溶性蛋白质相对分子量分布图是通过gpc-sec法测得。表4二次发酵不同天数干燥前饲料成品的测量结果表5可溶性蛋白质相对分子量分布图应用实施例1本发明发酵豆粕的应用：进行大猪喂养生长性能试验。猪舍的温度与湿度：试验期间于每天10:00、14:00测定猪舍的温度与湿度，取其平均值作为猪舍当天的温度与湿度；经测定，试验期间猪舍内平均温度为30.52±2.03℃、平均湿度为69.21±2.53％。实验动物：体重约60kg的杜×长×大杂交阉公猪100头；实验动物分组：将100头猪随机分为对照组和试验组，每组5个重复，每个重复10头猪，每个重复为1栏，单栏面积为4.5m×5.0m。饲料：对照组饲喂常规日粮，添加质量分数4％生长猪复合预混料，所用日粮采用玉米-豆粕型，参照nrc(1998)猪饲养标准配制；试验组生物发酵料35％，玉米33％，糠麸或杂粮12％，豆粕或豆饼16％，生猪预混料4，生物发酵料是由实施例3制备得到的高效蛋白饲料。生长猪复合预混料购买自北京农大利生物技术有限公司，其他市场购置。每天早晚各投喂1次，直到停止采食；喂养期为30天；试验动物按栏饲养，自由饮水，其他饲养管理按常规进行。喂养期结束后，测定实验动物的生长性能指标。测定方法如下：生长性能指标测定：在试验开始和结束时禁食1夜，对逐头动物称重量，每个重复的饲料采食量单独记录，计算日增重量、日采食量、料重比。实验结果，见表6。表6发酵饲料对大猪生产性能的影响p<0.01，表明差异极显著；p<0.05，表明差异显著；p>0.05，表明差异不显著。应用实施例2本发明发酵豆粕的应用：将其直接投喂，进行肉鸡喂养试验。实验动物：aa商品肉鸡苗，1000只。实验动物分组：将1000只鸡随机分为对照组和试验组，每组5个重复，每个重复100只鸡，每个重复为1栏。饲料：试验组饲喂配方：玉米55.3％，豆粕38％，磷酸氢钙1.4％，石粉1％，食盐0.3％，油3％，添加剂1％。生物发酵料按照总量的4％添加。生物发酵料是由实施例3制备得到的高效蛋白饲料。对照组和试验组营养成分相同，饲养管理方式相同。喂养期为55天，喂养期结束后，测定实验动物的生长性能指标。见表7。表7发酵豆粕对肉鸡生长性能的影响组别平均每只质量(kg)料肉比成活率(％)对照组2.082.5794.1试验组2.432.1497.2本发明制备的高效蛋白饲料直接喂养鸡后，毛色光亮，身体状况较好，而对照组的毛色明显较差。饲养过程中饲料的转化率较高，减少了疾病的发生，具有较高的成活率。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12