本发明涉及一种食品添加剂领域，具体的说是一种蛋白修饰植物甾醇脂质体粉末的制备方法。
背景技术：
植物甾醇，是存在于植物体内的具有类胆固醇结构的功能性脂质，是植物体内甾醇类化合物的统称。植物甾醇在常温下为白色结晶粉末或颗粒，无臭无味，熔点可达130～170℃，不溶于水、强酸和强碱，可溶于多种有机溶剂，如丙酮、无水乙醇、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。
1953年，pollak发现可以通过摄入植物甾醇来治疗高胆固醇症，从此开启了植物甾醇在降胆固醇应用的研究。lees等发现每天摄入植物甾醇含量达到3g就能达到最好的降胆固醇效果，可以降低约12％的胆固醇，并通过后续临床试验得到了证实。乳化后的植物甾醇降胆固醇功效更佳，richard发现1g植物甾醇经300mg卵磷脂乳化后其降血脂功效为1g游离植物甾醇的3倍之多，可达到36.7％。
目前，国内外出现的植物甾醇产品多种多样，考虑到天然植物甾醇溶解性差，熔点高，口感差等问题，常对其改性后再添加到食品中，但改性过程往往耗时、耗力，且转化率较低，生产成本高。也有通过制备o/w乳液、纳米粒、环糊精包埋等手段提高植物甾醇在水中的溶解性，但仍难以达到较高的包埋率和荷载率，在水中溶解度不高，且稳定性、复溶性差，添加的一些合成乳化剂存在安全隐患。
美国专利7,678,405公开了一种植物甾醇o/w乳液的制备方法，以黄原胶、卡拉胶、蔗糖酯、琼脂和聚甘油酯等复合乳化剂，添加玉米油、大豆油、菜籽油等食用油做油相制备植物甾醇o/w乳液，所选用植物甾醇大多以酯化形式存在，只含有少量游离植物甾醇。美国专利6,113,972发明了一种植物甾醇-蛋白复合物的制备方法，以蛋白为壁材，并辅以单甘酯和卵磷脂等乳化剂，将植物甾醇溶入油中，制备稳定的植物甾醇-蛋白微胶囊。中国专利101991160a将植物甾醇溶于油相中，在加热条件下以蔗糖脂肪酸酯、辛癸酸甘油酯和聚甘油脂肪酸酯等乳化植物甾醇，制备植物甾醇水性饮料。上述方法在制备过程中需要添加油相提高植物甾醇溶解量，但油的过量摄入也会造成血脂含量升高，并不能达到理想的降脂效果。
脂质体作为一种药物载体，可用于包埋各种水溶性或油溶性物质。在脂质体制备过程中，常添加胆固醇改善磷脂膜结构，提高脂质体稳定性。植物甾醇与胆固醇结构相似，已被证实可取代胆固醇用于脂质体的制备，且可以降低人体内胆固醇含量。脂质体可以制成乳液和粉末两种形式，相对乳液而言，粉末不仅更方便保存和运输，而且不受添加对象状态(液态或固态)影响，可自由的在各种水性食品中，在糕点、糖果、饼干和麦片等非水性食品中亦可添加，因此制备粉体具有更好的市场前景。脂质体干燥常采用冷冻干燥，需添加大量冻干保护剂，来提高脂质体的复溶性，显著降低了载药量。
中国专利105410934a中以3种常见水溶性蛋白(大豆分离蛋白、乳清浓缩蛋白和酪蛋白酸钠)为乳化剂，将植物甾醇溶于正己烷中，通过乳化蒸发法制备水溶性蛋白-植物甾醇纳米颗粒。该方法操作简单，提高了纳米颗粒的复溶性。但该技术方案是以水溶性蛋白疏水基团直接包埋植物甾醇，在干燥过程中由于冻融作用会破坏纳米粒结构，包埋率降低；同时纳米粒中植物甾醇溶解度受水溶性蛋白溶解度限制，在水中的溶解度仍较低。彭捷采用反溶剂沉淀法制备植物甾醇纳米粒，分别以大豆7s球蛋白和酪蛋白包埋植物甾醇，所得纳米粒溶解度均在1mg/ml以下，蔗糖酯包埋所得纳米粒中植物甾醇溶解度达到1.17mg/ml，但粒径在2μm以上；温娟利用羟丙基环糊精对植物甾醇进行包埋，包合物中植物甾醇的溶解度可达到0.466mg/ml。植物甾醇溶解度受包被壁材影响较大，因此选择合适的乳化剂或壁材对获得一种复溶性好，溶解度高的植物甾醇制剂尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的为了解决上述技术问题，提供一种工艺简单、来源广泛，生产成本低、控制简便的蛋白修饰植物甾醇脂质体粉末的制备方法，生产的产品粒径小，复溶性好、溶解度高，具有优异的降血脂效果。
技术方案包括如下步骤：
(1)卵磷脂与植物甾醇按照2～6:1(w/w)的比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为0.5％～4％(w/v)，室温搅拌溶解，制备有机相；
(2)将大豆分离蛋白加入到去离子水中，使大豆分离蛋白浓度为0.5％～4％(w/v)，室温搅拌溶解水化后制备水相；
(3)按照体积比1：1～10的比例将有机相缓慢注入水相中，并高速分散混匀；然后多次高压均质后得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥或喷雾干燥，得到冻干粉或喷干粉。
所述的植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇中的至少一种。
所述卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
所述室温搅拌溶解后调节ph至7.0，4℃水化过夜制得水相。
步骤(3)中所述高速分散时间为1～5min，转速为8000～15000r/min。
步骤(3)中所述高压均质压力为40～100mpa，均质次数为2～8次。
步骤(4)中所述乙醇除去方式为在0.08～0.13mpa真空度下，38～45℃旋转蒸发除去。
发明人就改善植物甾醇水溶性等问题进行了深入的研究，进行了如下改进，(1)采用植物甾醇与卵磷脂的复配，利用卵磷脂的乳化作用，使植物甾醇纳米化，解决其在水中不溶的问题；(2)植物甾醇能有效降低血脂中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，升高高密度脂蛋白的作用，但对甘油三酯无效，而搭配的卵磷酯对甘油三酯有效，具有降血脂功效，从而实现本发明脂质体对甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的调控功效；(3)先将植物甾醇与卵磷脂结合为粒径较小的脂质体，再引入大豆分离蛋白，利用蛋白与卵磷脂之间存在的疏水作用与静电作用，相互结合，(不直接与植物甾醇结合)，从而进一步提高植物甾醇脂质体的稳定性，还能大大提高产品复溶性。其中，为了保证卵磷脂对植物甾醇的包埋效果和荷载率，卵磷脂与植物甾醇重量比为2～6:1(w/w)，过高会降低植物甾醇的荷载率，过低会影响植物甾醇的包埋效果，脂质体粒径偏大。所述有机溶剂为无水乙醇，有机相和水相的混合比为1：1～10，乙醇比例太小植物甾醇溶解不充分，在分散过程中易析出，过高则易引起大量蛋白变性，影响包埋效果。
所得本发明的有益效果如下：
本发明以天然植物甾醇与大豆卵磷脂为原料，以无水乙醇为溶剂，大豆分离蛋白为保护剂，采用乙醇注入法制备蛋白修饰植物甾醇脂质体，不仅提高了植物甾醇的溶解性，还搭配卵磷脂的降甘油三脂功效，实现更好的降血脂效果，并提高了脂质体的稳定性与再分散性。所选原料来源广泛、安全可靠，适合于工业化生产应用。所得产品粒径小，溶解性好、包埋率高，可作为添加剂加入到食品、药品等行业中，尤其适用于高血脂人群，有广泛的应用前景。
具体实施方式
实施例1
(1)将卵磷脂与植物甾醇按4:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为1％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按1％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：4的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在10000r/min高速分散5min；然后在80mpa下高压均质8次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.11mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥，得到冻干粉。
实施例2
(1)将卵磷脂与植物甾醇按3:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为2％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按1％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：4的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在10000r/min高速分散3min；然后在90mpa下高压均质4次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.13mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥，得到冻干粉。
实施例3
(1)将卵磷脂与植物甾醇按4:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为4％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按0.5％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：4的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在8000r/min高速分散5min；然后在80mpa下高压均质4次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.11mpa真空度下，45℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥，得到冻干粉。
实施例4
(1)将卵磷脂与植物甾醇按2:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为2％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按1％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：2的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在10000r/min高速分散5min；然后在90mpa下高压均质6次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.11mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥，得到冻干粉。
实施例5
(1)将卵磷脂与植物甾醇按6:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为2％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按0.75％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：10的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在15000r/min高速分散1min；然后在100mpa下高压均质6次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.11mpa真空度下，38℃旋转蒸发除去乙醇，在进口温度70℃，出口温度55℃，0.4mpa真空度下喷雾干燥，得到喷干粉。
实施例6
(1)将卵磷脂与植物甾醇按2:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为1％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)将大豆分离蛋白按4％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：4的比例将步骤(1)得到的植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入步骤(2)得到的蛋白溶液中，并在10000r/min高速分散3min；然后在40mpa下高压均质8次得到蛋白修饰植物甾醇脂质体；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇脂质体在0.08mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去乙醇，在进口温度70℃，出口温度55℃，0.4mpa真空度下喷雾干燥，得到喷干粉。
对比例7
(1)将卵磷脂与植物甾醇按4:1(w/w)比例加入到无水乙醇中，使植物甾醇浓度为1％(w/v)，室温搅拌溶解；
(2)按照体积比1：4的比例将植物甾醇-卵磷脂乙醇溶液缓慢注入去离子水中，并在10000r/min高速分散3min；然后在80mpa下高压均质6次得到植物甾醇脂质体；
(3)将步骤(2)所得植物甾醇脂质体在0.09mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥，得到冻干粉。
对比例8
(1)将植物甾醇按5:1(w/w)比例加入到正己烷中，45℃搅拌溶解，得到植物甾醇溶液；
(2)将大豆分离蛋白按1％(w/v)比例加入到去离子水中，室温搅拌溶解，调节ph至7.0，4℃水化过夜；
(3)按照体积比1：10的比例将植物甾醇溶液缓慢注入蛋白溶液中，并在10000r/min高速分散3min；然后在80mpa下高压均质6次得到植物甾醇纳米颗粒；
(4)将步骤(3)所得植物甾醇纳米颗粒在0.09mpa真空度下，40℃旋转蒸发除去正己烷，冷冻干燥，得到冻干粉。
马尔文粒度仪测得植物甾醇脂质体干燥前后的粒径、pdi和电位大小：脂质体稀释200倍后测定粒径，稀释20倍后测定电位；干燥粉末以1mg/ml溶解，测定电位，稀释10倍后测定粒径，结果如表1所示：
表1蛋白修饰植物甾醇脂质体干燥前后理化性质表征
气相分析植物甾醇含量：将制备的脂质体在8000g离心20min，取上清液200μl，加入200μl1mg/ml5α-胆甾烷为内标，加入10ml1mol/lkoh乙醇溶液，80℃皂化1h，加入5ml水，10ml正己烷萃取，取上清液水洗3次，氮吹，bstfa70℃衍生1h，气相分析植物甾醇含量。干燥后脂质体粉末以20mg/ml溶解，8000g离心20min，取上清液以相同方法测定植物甾醇含量。蛋白修饰植物甾醇脂质体干燥前后的包埋率及荷载率如表2所示：
表2植物甾醇脂质体包埋率与荷载率
结论：对比例7所述植物甾醇脂质体粒径为72.71nm，pdi为0.155，电位为-34.8，脂质体粒径分布均匀，稳定性好；脂质体经冷冻干燥后，复溶性差，粒径在2000nm以上，且有明显不溶物。实施例所述蛋白修饰植物甾醇脂质体较原脂质体粒径有少许增大，但稳定性与分散性均未改变；经冷冻干燥或喷雾干燥后脂质体复溶性良好，部分实施例中植物甾醇包埋率仍可达到85％以上。说明卵磷脂对植物甾醇包合效果良好；大豆分离蛋白能有效提高植物甾醇脂质体的复溶性和稳定性，改善植物甾醇的水溶性。对比例8所述方法以大豆分离蛋白制备植物甾醇纳米粒，所得产品复溶性好，但植物甾醇的溶解度仍较低；经蛋白修饰植物甾醇脂质体解决了这一问题，经冷冻干燥或喷雾干燥后的脂质体不仅复溶性得到了改善，所得产品植物甾醇的溶解度均在1.5mg/ml以上。