专利名称：微生物方法
背景技术：
白三烯(leukotriene)构成一组由生命系统中花生四烯酸产生的，在局部起作用的激素。主要的白三烯是白三烯B4(缩写为LTB4)，LTC4，LTD4和LTE4。这些白三烯的生物合成，是从5-脂肪氧合酶对花生四烯酸作用生成被称为白三烯A4(LTA4)的环氧化物开始，然后再通过后续的酶促反应步骤，转变成其它的白三烯。有关白三烯生物合成及其代谢的进一步详情，可参阅《白三烯和脂肪氧合酶》(J.Rokach编辑，E1sevier，阿姆斯特丹(1989))。在Rokach的这本书中，还论述了白三烯在生命系统中的作用和它们与各种病症的关系。
在美国专利5,270,324中，报导了一种喹啉类型的白三烯拮抗剂，其中的一组是具有式(I)结构的化合物
其中Ra、Rb特别是氢或卤素；Rc可能是CO2Rd，CORd或C(Re)2-OH；Rd可能是氢或低级烷基，Re也可能是低级烷基；而ALK是例如环丙基-1，1-(双)亚甲基，异丙基等等。
在欧洲已公开申请604114中，这种白三烯拮抗剂被进一步公开，其中的一组是具有式(II)结构的化合物
其中的Ra、Rb、Rc和ALK是如上所述的基团。
以下式(III)的(S)-羟基化合物，是合成式(I)和(II)化合物过程中的中间体。式(III)结构的化合物可以通过使用手性还原剂如二异蒎莰氯甲硼烷，从相应的具有如下式(IV)结构的酮来制备。手性化学还原作用通常需要使用昂贵的手性还原剂；因此，有必要寻找另一种比化学方法更经济和/或更方便的方法来制备式(III)结构的手性化合物。
发明概述本发明提供了一种使苯基烷基酮还原成相应的(S)-羟基衍生物的立体有择方法，它包括使该苯烷基酮与具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌(Microbacterium)MB5614，或者其突变体或变异体相接触。本发明还提供了微杆菌MB5614(ATCC55557)，或者其突变体或变异体的生物学纯培养物。发明详述一方面，本发明提供了一种用于使苯烷基酮还原成相应的(S)-羟基衍生物的立体有择方法，它包括使该苯烷基酮与具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌MB5614，或者其突变体或变异体相接触。
更具体地说，本发明提供了一种制备式(III)化合物的方法，
它包括使式(IV)的化合物与具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌MB5614，或者其突变体或变异体相接触；
其中A是-CH＝CH-S-或-CH＝CH-CH＝CH-CH-；R1和R2独立地是氢或卤素；R3是CO2R6，COR6或C(R7)2-O-R8；R6是氢或低级烷基，R7是低级烷基，R8是氢或羟基保护基。
在一个优选的实施方案中，A是-CH＝CH-CH＝CH-，R1和R2中的一个是氢，另一个是卤素，R3是CO2R6。
在一个更优选的实施方案中，A是-CH＝CH-CH＝CH-，R1和R2中的一个是氢，另一个是氯，R3是CO2CH3。
本发明的另一方面，是提供了具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌MB5614，或者其突变体或变异体的生物学纯培养物。缩写和定义在本申请中，除非另有特殊说明，下列缩写和定义都是适用的。
FAB-MS＝快速原子轰击质谱测定法HPLC ＝高压液相色谱法
MES＝N-吗啉代乙烷磺酸MSG＝谷氨酸单钠NMR＝核磁共振法TLC＝薄层色谱法UV ＝紫外线“烷基”包括直链、分枝和环状结构及其组合。
“低级烷基”意指1-7个碳原子的烷基。低级烷基包括例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲-和叔-丁基，戊基，己基，庚基，环丙基，环丁基，环戊基甲基，环己基，等等。
“卤素”包括氟，氯，溴和碘。
“羟基保护基”可以是例如醚，如甲氧基甲基，四氢吡喃基，乙氧基乙基，三氯乙基，叔丁基，烯丙基，苄基，三甲基甲硅烷基乙基，二苯基甲基，和三苯基甲基；也可能是甲硅烷基醚，如三甲基甲硅烷基，二甲基异丙基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基；还可能是酯，如甲酰基，三氯乙酰基，苯甲酰基和三氟乙酰基；还可能是碳酸酯，如三氯乙基，苄基和烯丙基。其他适合的羟保护基可以在标准参考文献中找到，比如《有机合成中的保护基)》Green和Wuts编辑，1991，John Wiley&Sons公司，纽约。应用式(III)的化合物是制备式(I)和(II)的白三烯拮抗剂的中间体；用这种中间体制备这些白三烯拮抗剂的方法已在如下专利中公开了美国专利5,270,324和欧洲已公开申请604114，以及正在共同申请中的美国申请序列号08/174,931。式(I)和(II)的化合物可用作抗气喘剂，抗过敏反应剂，抗炎症剂和细胞保护性治疗剂。基质(substrate)的制备在本发明用于酮的微生物手性还原方法中，微杆菌的基质、式(IV)的化合物，可按照本专业人员熟悉的方法制备。制备其中A是-CH＝CH-CH＝CH-的式(IV)化合物的方法，在美国专利5,270,324中公开了；制备其中A是-S-CH＝CH-的式(IV)化合物的方法，在欧洲已公开申请604114中公开了。微生物描述微杆菌MB5614是从土壤样品中分离出的，此土壤样品取自一个公园(圣罗萨纪念公园，Guanacaste Pr..哥斯达黎加)的场地。在采样之前，此场地已经过48小时焚烧。该培养物的样品已据布达佩斯协议，以如下形式保存美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，保藏号ATCC55557，以及Merck微生物资源培养物保藏中心，Rahway，NJ，保藏号MB5614。
在下列文献中，对这种微生物进行了如下的分析研究生长和一般培养特征的观察Cure和Keddie，1969，需氧杆菌的形态学测定方法，Board和Lovelock(编辑)环境的取样和微生物监测，学术出版社，伦敦，pp.123-135。碳源利用的研究Kamagata和Suzuki，1986，Sneath，P.H.，N.S.Mair，M.F.Sharpe，和J.G.Holt(编辑)伯杰氏系统细菌学手册V.II.pp.1314。其它生理学测定Jones，1975，杆形菌及其相关菌的数字分类学研究，普通微生物学杂志，8752-96。用如下所述方法进行的细胞壁分析Lechevalier和Lechevalier，1980，放线菌纲的化学分类学，Dietz，A.和D.W.Thayer(编辑)放线菌分类学。工业微生物学协会，Arlington，VA.pp.225-291，以及Uchida和Aida，1984，一种改进的用于酰基型细菌细胞壁简易鉴定的甘醇酸酯测定法，普通及应用微生物学杂志，30131-134。用如下方法进行的甲基萘醌分析Hiraishi等，1992，用二维薄层色谱法对细菌醌的快速检测，应用微生物学通讯14170-173。用如下方法进行的脂肪酸分析Miller和Berger，1985，惠普应用简讯，pp.228-241，惠普公司，Palo Alto.CA。
细胞形态学。非运动的，革兰氏阳性，棒状的多形性杆菌(1.14×0.38μm)。在生长周期中发生初级分枝，但不产生菌丝体。不存在明显的杆状-球状生长周期。不产生内生孢子。培养和生理学特征。嗜温性的，在28℃和37℃下生长。耐热性好，60℃加热30分钟后的仍然存活。严格需氧菌，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性。虽然也可以进行发酵代谢，但主要是呼吸代谢。从下列碳水化合物代谢产酸纤维二糖，果糖，半乳糖，D-葡萄糖，甘油，甘露糖，麦芽糖，D-核糖，蔗糖，海藻糖，和D-木糖，不能从下列碳水化合物代谢产酸阿拉伯糖，肌醇，乳糖，蜜二糖，D-棉子糖，鼠李糖，可溶性淀粉，D-山梨醇，L-山梨糖，或L-木糖。对明胶有微弱的水解液化作用，但不水解壳多糖，淀粉，酪蛋白，尿素，或纤维素。复合性营养，能在蛋白胨基本培养基中生长。生长还可能需要B-复合维生素和氨基酸。在蛋白胨基本培养基上，菌落直径1-3mm，黄色，透明，隆起，并具有光滑的边缘。菌落表面有闪光，呈粘液状结构。不产生扩散性色素。
细胞壁化学。细胞壁中的二氨基酸是赖氨酸。还存在甘氨酸，丙氨酸和谷氨酸。细胞壁类型很可能是B1α。主要的细胞壁糖是鼠李糖，还存在低浓度的甘露糖，核糖和一种尚未鉴定的糖(R半乳糖＝0.75)。细胞壁的聚糖部分包含羟乙酰残基。主要的甲基萘醌类是MK10和MK11。主要的脂肪酸是15∶0反异，17∶0反异，和16∶0异。
化学分类学研究揭示，MB5614属于微杆菌属细菌，但是，其生长特征和碳水化合物发酵的方式，与这个属的六个目前已知的种相比较又不一致(表1)。基于这点，我们提议这株菌是一个新种campoquemadoensis微杆菌。
表1特征 MB5614 laevaniformans imperiale乳酸微杆菌1微杆菌微杆菌1颜色 黄淡黄黄 桔红酸产自纤维二糖 + + + +D-阿拉伯糖 - - - +D-棉子糖 - - + +D-核糖 + ND - NDD-山梨醇 - ND - NDD-木糖 + - - +果糖 + + + +半乳糖 + + + +葡萄糖 + + + +甘油 + ND + ND肌醇 - - - -L-山梨糖 - - - -L-木糖 - ND - ND乳糖 - + -3 +麦芽糖 ++++甘露糖 ++++蜜二糖 -ND -ND鼠李糖 ----可溶性淀粉 -ND +ND蔗糖 +-++海藻糖 +-++水解酪蛋白 -ND -ND纤维素 ----壳多糖 -ND -ND明胶 +V+V淀粉 -++V尿素 -ND ND ND在37℃生长 +-++表1(续)特征 dextranolyticum arborescensaurum微杆菌2微杆菌2微杆菌2颜色 黄 橙黄黄酸产自纤维二糖 + ND -D-阿拉伯糖 - + -D-棉子糖 + - +D-核糖 - ND -D-山梨醇 NDND NDD-木糖 + + -果糖 + ND +半乳糖 + ND +葡萄糖 + ND +甘油 - ND -肌醇 - ND -L-山梨糖 -ND-L-木糖ND NDND乳糖 +NDND麦芽糖+ND+甘露糖+ND+蜜二糖+ND-鼠李糖-ND+可溶性淀粉-ND+蔗糖 ++ +海藻糖+± +水解酪蛋白ND NDND纤维素ND NDND壳多糖ND NDND明胶 -+ +淀粉 -- +尿素 -ND-在37℃生长-- +1数据取自Yokota等，1993.微杆菌属的二个新种的建议新的dextranolyticum微杆菌和新的aurum微杆菌，国际系统细菌学杂志，43(3)549-554；以及Collins和Keddie，1986.Sneath，P.H.，N.S.Mair，M.E.Sharpe，和J.G.Holt(编辑)伯杰氏系统细菌学手册，V.II.pp.1320-1322。2数据取自Yokota等。3Collins和Keddie报告为阳性ND未测定V可变方法描述该微杆菌属菌株可以在含有已知的细菌生长营养成分，即含有可同化的碳源和氮源，并含有任选的无机盐和其它已知生长因子的常规培养基内培养。该培养物优选地是生长在深层有氧条件下，但是，对于较少量的培养，也可采用表面培养和瓶装培养。用于培养其它细菌的一般步骤同样可用于本发明菌的培养。
用于培养微杆菌的营养培养基应该含有适当的可同化碳源，如葡萄糖，果糖，蔗糖和纤维二糖。氯化铵，硫酸铵，尿素，硝酸铵，硝酸钠，谷氨酸钠等可作为氮源单独使用，或者与如下有机氮源结合使用蛋白胨，肉膏，酵母膏，玉米浆，大豆粉，棉籽粉等。如果有必要，还可以加入营养性无机盐，用于供给如下成分钠，钾，钙，铵，磷，硫酸盐，氯化物，溴化物，碳酸盐，锌，镁，锰，钴，铁等。
该微杆菌可以在任何适宜生长的温度下生长，如25℃-40℃，而通常是在27-32℃的温度范围内培养。如果在发酵罐内进行发酵培养，最好用来自斜面培养物或冷冻干燥培养物的营养接种物，接种在营养肉汤内。按此方法得到活性接种物之后，再利用无菌操作，转移到发酵罐的发酵培养基内。对发酵罐提供搅拌振荡，通气可通过对振荡的培养基注入空气或氧气来实现。
在本发明方法的一个实施方案中，酮基质(IV)被置于液体营养培养基内，与在其中培养的微杆菌相接触。可以在任何时间将该酮基质加入微杆菌培养物中，但优选地是当微生物达到足够的生物量时加入该基质。生物量浓度易于被监测，例如可用分光光度计，测定培养样品在波长660nm的光吸收度。通常是在接种后大约3-5天达到最大生物量。生物转化过程可以用常规的方法进行监测，例如可先用HPLC技术，接着用分光光谱技术。在加入基质后大约3-4天，立体有择还原产物的浓度达到最大值。酮基质变成相应的(S)-羟基化合物的生物转化过程可连续地进行，例如可持续达500个小时，间断地加入酮基质。这样产生的目的(S)-羟基化合物，可通过任何适当的回收和分离方法从发酵液体培养基中回收，这些方法包括萃取，沉淀，层析，和其它常规技术。
在本发明方法的另一个实施方案中，使酮基质与静止状态的微杆菌接触。这里所说的静止状态，是指微生物在不含生长支持因子的缓冲溶液中，不能活跃地生长，但仍具有所需要的功能。静止的微杆菌细胞，可通过收获生长的微杆菌细胞来制备，例如可用离心的方法收集细胞；被收集的细胞还可以冷冻干燥后，贮存于-80℃备用。静止细胞是在适当的缓冲溶液，如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液(pH6-8)中，以细胞悬液的形式被应用。将酮基质加入到细胞悬液中，此混合物在20-40℃的温度下培育，引起还原作用。任选地可对细胞悬液加入葡萄糖，以促进生物转化的效率。通过物理学方法吸附或富集在载体上的固定化细胞，也可以用于手性还原过程。用常规的方法可以使细胞固定化，例如以下文献中所报导的方法Karsten，G.和Simon，H.，应用微生物技术，1993，38441-446，以及其中引用的参考文献。
应该理解，对于生物转化作用，本发明不限于上述的特殊细菌，还应包括保留着酮还原能力的这种细菌的变异体和突变体。这种变异体和突变体，可以借助各种处理方法从亲本产生，例如X-射线照射，UV-照射，以及用化学诱变剂，如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理。
下述实施例将对本发明作更充分的说明，而不应认为是以任何方式对本发明的范围进行限制。实施例1 微杆菌MB5614菌种培养物将在SG培养基(其组成成分将在下述实施例4中提供)中冷冻的微杆菌MB5614菌种1.5ml小瓶，在室温下融化，然后转入加有50ml KE培养基的250ml锥形瓶内，KE培养基由下列成分组成(每升培养基的含量)10g糊精5g pH亚当胺(ardamine)5g E型NZ胺3g 牛肉膏1g 右旋糖0.37g K2HPO40.05g MgSO4·7H2O加去离子水使体积为1升用NaOH调pH7.10.5g CaCO3将培养瓶置于有轨摇床上，在28℃培育24小时，摇振速度220rpm。然后，从培养瓶内取1.0ml等分量培养物，接种到加有500ml KE培养基的2.0升锥形瓶内。将此2.0升培养瓶置于有轨摇床上，28℃培育24小时，摇振速度220rpm。实施例2 甲基2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉)乙烯基)苯基)-3-氧代丙基)苯甲酸酯(以下称为酮酯)转变成甲基2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉)乙烯基)苯基)-3(S)-羟基丙基)苯甲酸酯(以下称为羟基酯)的生物转化(方法A)将实施例1的菌种培养物2ml等分量转移到250ml的隔离培养瓶内，培养瓶中加有50ml生物转化培养基，其组成如下(每升培养基的含量)20g葡萄糖5g 大豆粉5g 酵母膏5g NaCl9.8g N-吗啉代乙烷磺酸(MES)用去离子水配成1升体积，pH调至7.0将溶于丙酮(0.5ml)的酮酯(5mg)溶液加入到该培养基内，此培养瓶置于在摇床上，在黑暗中27℃培育，振摇速度220rpm。用如下方法监测生物转化过程在不同的时间间隔，从培养瓶内取出1ml样品，与1ml异丙醇混合。将此混合物旋转混匀后再离心，从上清液中取出等分量用HPLC法测定(Whatman Partisil 10 ODS-3分析柱；洗脱液线性梯度的乙腈水溶液(55％-95％，30分钟内)，流速1ml/分钟，柱温45℃)。实施例3 羟基酯的分离和质量鉴定培育48小时之后，将4个培养瓶中的生物转化液体培养基合并(总量200ml)，调整pH至6.0。将该液体培养基离心(速度3700rpm，20分钟)，回收上清液。然后将沉淀物悬浮于150ml甲醇中，在黑暗中搅拌30分钟。将此悬浮液如上离心，再回收上清液。将沉淀物再提取一次，得到的上清液同前面回收的上清液合并。
将此合并提取液与等体积二氯甲烷混合，剧烈振摇后回收二氯甲烷相，并减压干燥。将此干燥残留物在半预制硅胶板上点样，硅胶板在二氯甲烷溶液系统中展开。在紫外灯下测定展开后的TLC板，将比基质具有较低Rf值的主要UV-吸收带定位。刮去该区域内的硅胶，用二氯甲烷作彻底的抽提。将该提取物减压浓缩，并过滤。
将过滤的提取物，通过几次对半预制的Whatman Partisil 10ODS-3(9.4mm×25cm)柱加样作进一步纯化。对该柱用与分析柱相类似的条件进行展开，只是流速不同，为3ml/分钟(见实施例2)。将经HPLC纯化的分合并并用二氯甲烷彻底抽提。用Na2SO4干燥二氯甲烷抽提物，再在氮气下浓缩至完全干燥，得到最后的干燥产物3.5mg(对基质的产物的直接HPLC定量表明，据收获的时间不同，转化率为30-40％)。NMR和FAB-MS色谱分析证明产物是甲基2-(3(S)-3-(2-(7-氯-2-喹啉)乙烯基)苯基)-3-羟基)丙基)苯甲酸酯，HPLC纯化级分在Chiralcel OD柱上的手性色谱分析(洗脱液90％己烷/异丙醇，流速2ml/分钟，保留时间(S)-羟基酯17.9分钟，(R)-羟基酯19.8分钟)表明存在95％的过量对映体。实施例4 酮酯转变成羟基酯的生物转化(方法B)将实施例1的菌种培养物10ml等分量接种到2.0升锥形培养瓶内，瓶中加有500ml生产培养基(SG培养基)，该培养基组成如下(每升培养基的含量)0.5gFeCl3·6H2O30g 右旋糖20g 谷氨酸单钠(MSG)9.8gMES5g 酵母膏5g NaCl加去离子水至1升(pH7.0用NaOH调整)将此培养瓶置于有轨摇床上，在28℃培育，振摇速度200rpm。
该生产培养物被培育5天之后，加入酮酯(250mg，溶于二甲基亚砜，形成25mg/ml的溶液)。在接种后的第8天和第9天，加入追加量酮酯(每次250mg)。通过测定培养物中酮酯和羟基酯的浓度，可监测生成羟基酯的生物转化过程。简单地说，取等分量培养物液体培养基，用二倍体积的乙酸乙酯萃取。然后将此提取物在氮气中干燥，并再悬浮于乙腈中，将此乙腈溶液在Zorbax RX-C8 HPLC柱上进行色谱分析(流动相10-90％的乙腈水溶液，用0.1％H3PO4酸化液体培养基，流速1.5ml/分钟)。保留时间(酮酯)＝5分钟，保留时间(羟基酯)＝12分钟。在这些条件下的生物转化，在接种后的第10天，产生的羟基酯大约500mg/l，反应过程中的生产速率大约100mg/天。实施例5 用微杆菌MB5614静止细胞将酮酯转变成羟基酯的生物转化使微杆菌MB5614培养物按照在实施例1和2中所述的步骤培养生长。培养物在生物转化培养基内，置于有轨摇床上，在28℃培育44小时，振摇速度220rpm，以15000rpm的速度离心120分钟收集细胞。得到的沉淀物用pH7.2的0.1M磷酸盐缓冲液洗3次，然后冷冻干燥，贮存于-80℃。
使细胞融化解冻，制成4∶5g/V缓冲液的悬浮液，然后向细胞悬浮液加入酮酯(5mg/0.5ml DMSO)。将此混合物在27℃下培育。如上所述监测生物转化过程。培育40小时之后，观测到大于50％的转化率(HPLC的测定结果)。
对细胞悬浮液加入葡萄糖(0.1M)，培养40小时之后，得到大约60％的转化率。
权利要求
1.一种制备式(III)化合物的方法，
它包括使式(IV)的化合物与具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌MB5614，或者其突变体或变异体相接触
其中A是-CH＝CH-S-或-CH＝CH-CH＝CH-CH-；R1和R2独立地是氢或卤素；R3是CO2R6，COR6或C(R7)2-O-R8；R6是氢或低级烷基；R7是低级烷基；R8是氢或羟基保护基。
2.权利要求1的方法，其中A是-CH＝CH-CH＝CH-，R1和R2中的一个是氢，另一个是卤素，而R3是CO2R6。
3.权利要求1的方法，其中A是-CH＝CH-CH＝CH-，R1和R2中的一个是氢，另一个是氯，R3是CO2CH3。
4.权利要求1的方法，其中所说的微杆菌是培养在含有可同化的碳源和氮源的水营养培养基中的。
5.权利要求1的方法，其中所说的微杆菌处于静止状态。
6.权利要求4的方法，其中所说的营养培养基还含有FeCl3。
7.权利要求4的方法，其中所说的营养培养基还含有谷氨酸单钠。
8.权利要求4的方法，其中所说的营养培养基还含有FeCl3和谷氨酸单钠。
9.一种具有ATCC55557鉴定特征的微杆菌MB5614或者其突变体或变异体的生物学纯培养物。
全文摘要
本发明提供了一种用于将苯基烷基酮立体有择还原成其相应的(S)-羟基化合物的方法。此方法是利用新的微杆菌(Microbacterum)MB 5614来实现这种手性还原作用的，本发明还提供了这种新的微生物，它已保藏于ATCC，保藏号为ATCC 55557。
文档编号C12R1/01GK1153534SQ95194254
公开日1997年7月2日 申请日期1995年7月14日 优先权日1994年7月20日
发明者M·M·沙特雷恩, 陈世上, G·M·加里蒂, B·亨布殊, C·勒贝格, A·沙菲 申请人:麦克公司