专利名称：一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及人碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblast growth factor，简称bFGF)的基因工程制备方法，以及重组人bFGF本身或含有bFGF的制剂作为治疗冠心病及心肌梗塞的药物或保健品。
成纤维细胞生长因子是广泛存在于多种组织中的一类多肽生长因子，1974年由Gospodarwicz从牛脑垂体中发现，由于它对成纤维细胞有明显的促分裂作用，故命名为成纤维细胞生长因子，以酸性和碱性两种形式存在。1985年，人们完成了牛bFGF的氨基酸序列分析工作，在随后的两年中，文献陆续报导了牛和人的各种组织来源的bFGF氨基酸序列，并实现了它的基因克隆和表达。近年来有文献报导bFGF表达水平不断提高(Knoerzer，Gene，7521-30.1989；Squires，J Biol Chem，26316297-163021988)，由于得到了大量纯品，大大促进了其生物功能研究。目前的研究表明，它除了对成纤维细胞有很强的促分裂作用外，对多种来自中胚层的细胞，尤具是血管内皮细胞有很强的促分裂作用，是所知的最活跃的促血管形成生长因子。是近年来研究最活跃的领域之一。
碱性成纤维细胞生长因子bFGF是具有重要的应用开发前景的细胞因子之一，本发明的目的是通过改造5′端基因，使从中国人外周血中克隆的bFGF基因在大肠杆菌中获高效表达，并利用快速简便的工艺，得到大量的符合标准的临床用药，最终用于冠心病和心肌梗塞的治疗。估计bFGF对下列疾病具有潜在的临床应用价值1、通过bFGF的创伤愈合和组织修复作用，可以用于烧伤、烫伤、慢性溃疡、褥疮和严重的软组织挫裂伤的治疗；
2、通过bFGF的神经营养作用，可以用于中枢及外周神经损伤、脑外伤后遗症、脊柱手术后、老年性痴呆、缺血性脑病、神经性耳聋和视神经变性等神经系统疾病的治疗；3、通过bFGF促血管形成和心肌营养作用，可以用于慢性心肌缺血(冠心病)、急慢性心肌梗塞和冠状动脉搭桥术后再狭窄的治疗。
由于bFGF的以上实用价值，国外已有数家制药公司和厂家在研制生产bFGF的新方法和新工艺。
本发明采用下述技术方案(1)鉴于遗传密码有兼并性和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明专门设计合成了人bFGF基因5′端含大肠杆菌偏爱密码子的DNA片段，它可以在不改变产物人bFGF的氨基酸组成与排列顺序的基础上，提高bFGF基因在大肠杆菌中的表达水平。其步骤首先在5′和3′端引物引导下，自中国人外周血单个核细胞总RNA中扩增出特异的人bFGF cDNA片段。将PCR扩增产物插入国内已广泛采用的高效表达载体pBV220中，构建成bFGF表达质粒pBbFGF。它能在大肠杆菌HB101和DH5α中高表达，使bFGF占菌体总蛋白的15％左右，表达率经100次以上传代不降低。
(2)通过发酵工程菌，用M9作为基础培养基，适当增加碳源和氮源，通过优化溶氧、搅拌速度、发酵pH值等工艺参数，最终培养物0D600值可达6左右，生物量为每升培养物6～8g，产物表达率在12.8～16.5％之间。产物表达量可达每升培养物80～100mg。
(3)在此基础上建立了纯化工艺，其中包括菌体的破碎和产物抽提、肝素亲和层析纯化、凝胶排阻层析精制。本工艺由于纯化产物来自于可溶性的表达上清，因此产物比活性较高，结构单一。引入肝素亲和层析主要是利用了它的高选择性，进一步的凝胶排阻层析可以去除少量杂质蛋白和热原。每升发酵产物可得人bFGF纯品近40mg，回收率50％左右，纯度＞96％，比活性可达1×10°U/mg水平，明显高出文献报导水平。运用30L发酵罐一批可得到数万人份的bFGF制剂。
(4)纯品加入人血清白蛋白、甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂后，用微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥成粉状成品。注射用水溶解后应用，可用于外伤、神经损伤和心肌缺血性疾病的治疗。
治疗实验性兔急性心肌梗塞，给予1.4μg/kg/次人bFGF 6次，疗程10天，可使兔心梗面积和梗塞心肌重量较对照组减少50.9％和53.8％，明显优于阳性对照药物硝酸甘油，明显改善了心功能和血流动力学指标，组织学也显示梗塞区血管增生活跃。结果表明发生心肌梗塞后早期应用bFGF，可以促进急性心肌梗塞的心肌愈合，改善心肌梗塞的预后。人bFGF对心肌缺血/再灌注损伤大鼠的实验结果提示应用后可增加冠脉流量，冠脉流出液中蛋白、酶和其它反映心肌损伤的指标明显降低。
本发明运用重组DNA技术，在不改变编码氨基酸的前提下，改变基因5′端部分核苷酸，从而提高了产物的表达，且产物以高活性可溶性形式存在。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。本产品用于实验性心肌缺血疾病的治疗，能得到显著的疗效。
本发明用下述实例进行说明实施例1、PCR引物设计及人bFGFF基因扩增人bFGF蛋白质分子由146个氨基酸基构成，其中N末端8个氨基酸序列是Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly，由于原基因5′端序列GC含量太高，不利于在原核系统中表达，因此本设计首要思想是降低5′端GC含量，设计后的5′端引物序列是
5 EcoRIAGGAATTC ATG CCA GCT TTG CCC GAG GAT GGT GGT A3′端引物序列为5 BamHI双终止ATGGATCC TCA TCA GCT CTT AGC AG A CAT TGG采用固相亚磷酸三酯法合成上述两条寡聚脱氧核糖核苷酸，制备胶电泳分离纯化。
采用微量异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自中国人外周血单个核细胞中纯化总RNA，使A260/A280比值＞1.8，取10μl(约4.5μg)总RNA，加40pmol5′端引物，70℃热变性5min，室温冷却使其自然降温，待降至室温后，42℃水浴中依次加入下列样品反转录反应体系10×反转录缓冲液3μlRNA酶抑制剂 20U40nM焦磷酸钠3μlAMV逆转录酶 15U(1μl)dNTP(各2.5mM) 2μl加无RNA酶水至 30μl上述混合物42℃水浴反应60min，加H2O 70μl 70℃作用5min灭活反转录酶，该反应物可作为PCR扩增的起始模板，取反转录产物20μl，加入下列成分10×PCR缓冲液 10μldNTP(各2.5mM) 16μl5′和3′两侧引物各40pmol加H2O至99.5μl
上述混合物94℃，3min后加入0.5μl Tap DNA聚合酶2.5U，混匀，94℃变性反应40秒、58℃退火40秒、72℃延伸反应60秒，进行30个循环的扩增反应后延伸6min，取反应物进行电泳鉴定观察到0.46kb的单一条带，符合完整的人bFGF基因的长度，并且能与标记的5′端引物杂交。
实施例2、人bFGF基因在大肠杆菌中的表达及序列分析用限制性内切酶EeoRI和BamHI双酶切0.46kb的PCR扩增产物和表达载体质粒pBV220，经琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收0.46kb和3.66kb的DNA片段。两片段等摩尔混合，T4 DNA连接酶12～16℃连接反应过夜，连接物转化入CaCl2处理的E.coli大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素筛选培养。挑选单个菌落，制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，含有人bFGFF基因片段并且插入方向正确者，命名为pBbFGF，相应的工程菌命名为pBbFGF/DH5α。
含有以上表达质粒的工程菌经过扩增培养、温度诱导，在17kb左右多出一条蛋白条带。该蛋白能与人bFGF单克隆抗体呈显特异反应。
在测序引物引导下，分别自两测对插入的人bFGF基因片段进行DNA序列分析，肯定了所扩增的PCB产物符合设计构想，其编码的氨基酸序列与人bFGF序列相同(测得的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见
图1)。
实施例3、人bFGF的发酵生产工程菌30℃过夜培养后，按10％比例接种于M9培养基中，30℃培养到0D600为1.0～1.5时，将温度升至42℃，同时补加酪蛋白水解物(1g/L)和葡萄糖(4g/L)，此时bFGF即诱导产生，4h后收集菌体。电泳鉴定bFGF表达水平，薄层扫描显示bFGF占菌体总蛋白的12.8～16.5％之间。
实施例4、工程菌的保存及稳定性工程菌加30％甘油，-20℃保存。短期保存菌种可用软琼脂LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行酶切鉴定，结果三者相同。同时三个菌扩增培养物的产物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例5、bFGF的分离纯化由于人bFGF在菌体内以可溶性形式存在，因此在菌体破碎后上清首先经过肝素亲和层析分离，然后再经过凝胶排阻层析精制，可以较快速地得到bFGF纯品。
肝素凝胶柱经20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，2mMβ-巯基乙醇，0.1M NaCl，pH7.4缓冲液平衡后上样，上样后经含0.5、1M NaCl的上述缓冲液洗脱杂蛋白后，再用含1.5M NaCl的上述缓冲液洗脱bFGF。
上述粗纯产物经超滤浓缩后再过Sephacryl S-200凝胶排阻层析柱作进一步精制，收集分子量17kd的bFGF纯品。
实施例6、bFGF产物的鉴定SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，Balb/C 3T3细胞株MTT法测定其生物活性，比活性在1×106U/mg以上。N末端蛋白质序列分析结果与体内天然蛋白相同，顺序是P.A.L.P.E.D.G.G.S.G.A.F.P.P.G.H。
实施例7、无菌过滤、分装、冻干根据蛋白含量和活性，按以下比例加辅料和稳定剂rh-bFGF每支20、50、100μg甘露醇 25mg/支人血清白蛋白1mg/支缓冲液为20mM PB，pH7.0，以上原料必须符合注射用药的要求。
无菌过滤在洁净度达到100级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。
权利要求
1.一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法，包括PCR引物设计、扩增的基因、表达质粒的构建、表达产物的纯化工艺，其特性在于(1)5′端PCR引物及扩增cDNA 5′端序列为EcoRIAGGAATTC ATG CCA GCT TTG CCC GAG GAT GGT GGT A(2)上述bFGF cDNA与含有PL.PR启动子的原核表达载体pBV220组装成高效表达质粒pBbFGF；(3)pBbFGF转化大肠杆菌，用温度诱导bFGF基因的表达，产物以可溶性形式存在工程菌内；(4)通过发酵技术扩增工程菌，用M9作基础培养液，温度诱导同时补加酪蛋白水解物、葡萄糖等营养成分；(5)发酵后破碎菌体，收集上清采用肝素亲和层析和凝胶排阻层析二步法纯化产品。
2.根据权利要求1制备的人bFGF纯品加入人血清白蛋白等稳定剂后，无菌过滤、分装、冻干后制成成品，保存于2～8℃的冷藏环境中。
3.根据权利要求1、2所述的药物制剂，可以用于治疗急性心肌梗塞等心肌缺血性疾病，冠心病的治疗和保健药品。
全文摘要
本发明涉及一种重组人碱性成纤维细胞生长因子的制备方法。本发明利用遗传密码具有兼并性的原理,设计了大肠杆菌偏爱密码子,PCR扩增的人bFGFcDNA片段与原核表达载体如pBV220组装成高效表达质粒pBbFGF,转化大肠杆菌后用温度诱导bFGF基因表达,表达最达菌体总蛋白的15%。工程菌经发酵扩增,破碎菌体上清采用肝素亲和层析和凝胶排阻层析二步法纯化产品,加保护剂后制成药用冻干制剂。该制剂可治疗急性心肌梗塞等心肌缺血性疾病,作为冠心病的治疗和保健药品。
文档编号C12N1/21GK1188151SQ9710018
公开日1998年7月22日 申请日期1997年1月17日 优先权日1997年1月17日
发明者陈玉林 申请人:北京白鹭园生物技术有限责任公司