专利名称：一种脱毒工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域的一种工程菌，特别是涉及一种脱毒工程菌及其应用。
近几十年来，化学农药一直是园林农业中控制病虫草、鼠害的主要手段，其品种和销量逐年增加。化学农药在控制病虫草鼠害提高产量的同时，也破坏了生态，污染了环境，每年50万余吨的农药用量的70％将流入江河土壤，而且有的农药消解速度慢，空气中农药浓度将维持一个相当长的时间，并由于其残留对水域、食品的污染直接危害了人体健康以及动物的安全，污染的地表水又直接污染着地下水，正如伟大导师恩格斯教导的那样“人类正在承受着大自然所给予的报复”。而为确保粮食丰收，农药又是必不可少的，因此，脱毒、净化水资源，综合治理水环境污染刻不容缓，势在必行。
脱毒工程菌可用于降解被有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂污染的水源、土壤。国外有人已鉴定出耐药昆虫中与脱毒有关的酶类，然后从蚜虫中分离出控制该酶合成的基因，并将其克隆转入细菌中进行大规模培养，用于污水处理。但因其基因片段很小，故在细菌中的表达效率很低而没有应用价值。
本发明目的在于构建一种载有杀虫药剂解毒酶的高脱毒能力的重组质粒，并用这种质粒处理被有机磷、氨基甲酸酯、有机氯类酯化合物污染的水源和土壤，以期有效地治理水环境污染，拯救保护人类和人类赖以生存的地球。
本发明提供的脱毒工程菌如下从对杀虫药剂抗性的蚊虫中分离得到扩增500-800倍的酯酶基因，即酯酶Bl,1.3Kb片段(序列见附图3)，并将其克隆到pRL-439质粒中，构建pRL-B1重组质粒，再用新构建的pRL-B1重组质粒转化大肠杆菌(E,Coli HB101)，并在大肠杆菌中大量表达，制得带有含该重组体的酯酶基因的细菌，即为对有机磷，氨基甲酸酯，有机氯类酯化合物有降解作用一种脱毒工程菌。
其具体制备方法(参照附图1)构建重组体pRL-B1质粒DNA1、煮沸法制备pRL-439质粒DNA(由PWol提供，Ref.Gene,68:119-138,1988)取2ml在37℃振荡培养过夜的含质粒pRL-439的E.Coli HB 101菌液，离心收集菌体，加入700μl溶菌酶缓冲液，吹打混匀后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。离心后吸去沉淀，上清用等体积酚，酚/仿，仿各抽提一次，离心收集上清，加入1/10体积3M NaAc，等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟。离心后用70％乙醇洗涤DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pRL-439质粒DNA。2、pRL-439质粒DNA酶解片段的分离回收pRL-439质粒DNA用适量的E.coR1酶解完全后，在0.7％琼脂糖低溶点胶上电泳分离，于长波紫外灯下切下含2.7kb的DNA片段的琼脂糖低溶点胶，切碎后装入Eppendorf管中，在65-70℃水浴温5-10分钟，分别加入等体积酚，酚/仿，仿抽提，离心后收集上清，加入1/10体积3MNaAc，二倍体积无水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，适量TE溶解即为2.7kb的pRL-439kb DNA片段。3、煮沸法制备pUC-19B1质粒DNA(B1 in GenBank data base.accession no:M32328)取2ml在37℃振荡培养过夜的含质粒pUC-19的E.Coli HB 101菌液，离心收集菌体，加入700μl溶菌酶缓冲液，吹打混匀后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。离心后吸去沉淀，上清用等体积酚，酚/仿，仿各抽提一次，离心收集上清，加入1/10体积3M NaAc，等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟。离心后用70％乙醇洗涤DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pUC-19质粒DNA。4、pUC-19质粒DNA酶解片段的分离回收pUC-19质粒DNA用适量的E.coR1酶解完全后，在0.7％琼脂糖低溶点胶上电泳分离，于长波紫外灯下切下含1.3kb的DNA片段的琼脂糖低溶点胶，切碎后装入Eppendorf管中，在65-70℃水浴温5-10分钟，分别加入等体积酚，酚/仿，仿抽提，离心后收集上清，加入1/10体积3M NaAc，二倍体积无水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，适量TE溶解即为1.3kb DNA片段。5、pRL-439DNA脱磷反应70μl反应体系，加入pRL-439(2.7kb片段)15μl，10X缓冲液7μl，双蒸水42μl,6μl CIP(Alkaline phosphatase)。在37℃温育30分钟后，75℃温育10分钟。等体积酚/仿，仿各抽提一次，离心收集上清，加入1/10体积3MNaAc，等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟。离心后用70％乙醇洗涤DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即为脱磷后的pRL-439DNA。6、连接反应10μl反应体系中，加入1xT4 DNA连接酶缓冲液，0.5μ(1.5U)T4DNA连接酶，1μl 10X缓冲液，1μl(约200ng)载体DNA(即脱磷后的pRL-439的基因片段)，1μl酯酶基因DNA(1.3kb的B1基因片段)，6.5μl双蒸水。在14-16℃，反应16小时；即为重组体pRL-B1质粒DNA。
pRL-B1工程菌(E.coli HB101)的制备1、大肠杆菌感受态细胞的制备接种大肠杆菌HB101于LB固体培养基中，37℃培养约12小时。挑取单菌落于30ml LB培养基中，37℃培养过夜。转移1 ml菌液至50ml LB培养基中，37℃振荡培养至OD600约为0.4-0.5，离心收集菌体，重悬于25ml冰预冷的0.1M MgCL2中，冰浴约7分钟，离心收集沉淀，重悬于25ml 0.1M CaCL2中，冰浴20分钟，离心后用2ml 0.1M CaCL2悬浮沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。2、pRL-B1质粒DNA的转化取200μl大肠杆菌感受态细胞，加入上述(6)连接物，并加50μlTCM(Tris,CaCL2,MgCL2)冰上放置30分钟，42℃水浴2分钟，冰浴20-50分钟，加入37℃预热的LB培养基1.5ml,37℃振荡培养1小时，离心后用0.1mlTCM重悬沉淀，涂布于含25-50％的氨苄霉素的LB琼脂板上，37℃倒置培养过夜。在含抗生素的LB琼脂板上能生长的菌落即为阳性克隆。
pRL-B1工程菌(E.coli HB101)的表达(1)试剂磷酸缓冲液(pH7.0)含1％ Triton-x 10095％乙醇α-乙酸萘酯溶液111.6mg/ml溶于95％乙醇中β-乙酸萘酯溶液111.6mg/ml溶于95％乙醇中显色剂五份5％ SDS，二份1％固蓝B(2)实验重组质粒pRL-B1的大肠杆菌HB 101的菌液的表达鉴定取37℃振荡培养过夜含重组质粒pRL-B1的大肠杆菌HB 101的菌液，测初始OD600，然后将菌液分为三组对照组；α-乙酸萘酯组(A组)；β-乙酸萘酯组(B组)。每组都用磷酸缓冲液将细胞稀释成六个浓度梯度于六个试管中，每管体积2.5ml，对照组加5μl95％的乙醇，A组加5μlα-乙醇萘酯溶液，β组加5μlβ-乙酸萘酯溶液。每组(A、B)都用适量的磷酸缓冲液将相同浓度的药液(α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯)充分混合使之溶解；对照组加入相同量的乙醇，再加入不同量(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml)的初始OD600细胞液。37℃振荡培养1.5小时后，每管加入500μl新配制的显色剂，室温下显色反应15分钟，分别测定600nm和555nm处的OD值。A组取OD600值，B组取OD555值，分别减去相应对照组OD值，作OD-菌液浓度曲线。其OD-菌液浓度曲线的如图2所示。该曲线表明本发明提供的脱毒工程菌对α-乙酸萘酯和β-乙酸萘脂这两种有机磷酸酯类的代表药有很强的降解脱毒作用。
载体质粒pRL-439的大肠杆菌HB 101的菌液(此作为对照用)取37℃振荡培养过夜含载体质粒pRL-439的大肠杆菌HB 101的菌液，测初始OD600，然后将菌液分为三组对照组；α-乙酸萘酯组(A组)；β-乙酸萘酯组(B组)。每组都用磷酸缓冲液将细胞稀释成六个浓度梯度于六个试管中，每管体积2.5ml，对照组加5μl95％的乙醇，A组加5μlα-乙酸萘酯溶液，β组加5μlβ-乙酸萘酯溶液。每组(A、B)都用适量的磷酸缓冲液将相同浓度的药液(α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯)充分混合使之溶解；对照组加入相同量的乙醇，再加入不同量(1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml)的初始OD600细胞液。37℃振荡培养1.5小时后，每管加入500μl新配制的显色剂，室温下显色反应15分钟，分别测定600nm和555nm处的OD值。A组取OD600值，B组取OD555值，分别减去相应对照组OD值，作OD-菌液浓度曲线。其OD-菌液浓度曲线的如图2所示。该曲线表明本发明提供的脱毒工程菌对α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯这两种有机磷酸酯类的代表药有很强的降解作用。
pRL-B1工程菌脱毒功能的表达鉴定共做了三批实验，两批含重组质粒pRL-B1，一批含质粒pRL-439作为对照。
第一批菌种含重组质粒pRL-B1的大肠杆菌的HB 101菌液初始OD600-1.2000表1．pRL-B1组(一)不同细胞浓度对脱毒的影响及测定结果瓶号 1 2 3 4 5初始菌液(ml) 1.01.21.51.82.0磷酸缓冲液(ml) 1.51.31.00.70.5对照组OD6000.7618 0.9001 0.8573 1.0736 1.2679A组OD600 1.2088 2.3202 2.7945 3.6483 3.8914(A组-对照组)OD600 0.4480 1.4201 1.9372 2.5747 2.6235对照组OD5550.8565 1.0093 0.9685 1.2049 1.4055B组OD555 1.1039 2.2928 2.9039 4.5000 4.5000B组OD555(B组-对照组)OD555 0.2474 1.2835 1.9354 3.2951 3.0945第二批菌种含重组质粒pRL-B1的大肠杆菌HB 101菌液初始OD600=0.6523
表2．pRL-B1组(二)不同细胞浓度对脱毒的影响及测定结果瓶号1 2 3 4 5 6初始菌液(ml)0.81.01.21.51.82.0磷酸缓冲液(ml) 1.71.51.31.00.70.5对照组OD600 0.3071 0.3360 0.3590 0.3707 0.2834 0.3371A组OD6001.1213 1.2609 1.4065 1.5113 1.8535 2.1926(A组-对照组)OD600 0.8142 0.9249 1.0475 0.8043 0.5701 1.8555对照组OD555 0.3715 0.4116 0.4431 0.4627 0.3824 0.2899B组OD5551.8826 2.0617 2.2691 2.2518 2.8801 3.2323(B组-对照组)OD555 1.5111 1.6501 1.8260 1.7891 1.4977 2.9424第三批菌种含重组质粒pRL-439的大肠杆菌HB 101菌液初始OD600=1.4920表3．pRL-439组不同细胞浓度对脱毒的影响及测定结果瓶号 1 2 3 4 5 6初始菌液(ml) 0.81.01.21.41.61.8磷酸缓冲液(ml) 1.71.51.31.10.90.7对照组OD600 0.8806 1.0046 1.1769 1.2737 1.3611 1.4579A组OD600 1.1430 1.2897 1.4921 1.7130 1.7684 1.8951(A组-对照组)OD6000.2624 0.2851 0.3152 0.4393 0.4073 0.4372对照组OD555 1.0072 1.1494 1.3348 1.4410 1.5452 1.6362B组OD555 1.2745 1.4376 1.6069 1.7261 1.8150 1.9649(B组-对照组)OD5550.2673 0.2882 0.2721 0.2851 0.2698 0.3287由以上三组数据，作OD-菌液浓度曲线由表1、2、3及图1，我们可以看出以下两点其一，pRL-B1组的吸收显著高于pRL-439组其二，随着菌液浓度的增加，pRL-B1组的吸收增加明显，而pRL-439组曲线近于平坦。由此，我们可以判断在本次实验中pRL-B1组萘酸生成量显著，且随着菌浓度增高生成量明显增加，而pRL-439组萘酸生成量极少或没有。由于质粒pRL-B1和pRL-439的差别仅在于一个酯酶B1基因。因此，结论为萘酸的大量产生是由于脱毒酶B1基因的存在，即该B1基因的表达明显促进α(β)-乙酸萘酯的分解。由于α(β)-乙酸萘酯是有机磷、氨基酸酯和有机氯类酯化合物特征化合物，所以由此可知，新构建的重组质粒pRL-B1转化大肠杆菌后，对有机磷，氨基酸酯，有机氯类酯化合物有降解作用，是一种脱毒工程菌，该脱毒上程菌于1997年2月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其登记入册编号CGMCC NO.0290，微生物(株)Escherichia Coli pRL-B1，分类命名Escherichia Coli。重组质粒pRL-B1可表达酯酶B1，并且该酯酶表达量高，脱毒功能显著。
附图1为重组质粒pRL-B1的构建示意图。
附图2为重组质粒pRL-B1脱毒功能分析示意图。
附图3为脂酶B-I基因片段的全序列。其中横坐标表示初始菌液的体积，单位为ml。
纵坐标表示OD的吸收值。
图中-----表示(A组-对照组)OD600图中--+--表示(B组-对照组)OD555图2中的2-1表示第一批含重组质粒pRL-B1的大肠杆菌HB101(OD600=1.2000)的不同细胞浓度对脱毒的影响；2-2表示第二批含重组质粒pRL-B1的大肠杆菌HB101(OD600=0.6523)的不同细胞浓度对脱毒的影响。
2-3表示含pRL-439(对照组)的大肠杆菌HB101(OD600=1.4920)的不同浓度细胞对脱毒的影响。
权利要求
1．一种脱毒工程菌，其特征在于它是将酯酶B1基因片段转入大肠杆菌HB101菌株得到的。
2．根据权利要求1所述的一种脱毒工程菌，其特征在于它保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，其保藏登记入册编号CGMCCNo.0290，微生物(株)Escherichia Coli pRL-B1，分类命名Escherichia Coli。
3．一种权利要求1所述的脱毒工程菌的应用，其特征在于它可用于降解有机磷、氨基酸酯、有机氯酯类化合物。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域的一种脱毒工程菌:从对杀虫药剂有抗性的蚊虫中分离到的扩增500—800倍的酯酶基因,即酯酶B1,1.3Kb片段,并将其克隆到pRL－439质粒中,构建pRL－B1重组质粒,再用新构建的pRL－B1重组质粒转化大肠杆菌(E,ColiHB101),并在大肠杆菌中大量表达,制得带有含该重组体的酯酶基因的细菌,即对有机磷,氨基甲酸酯,有机氯类酯化合物有降解作用的脱毒工程菌,其酯酶表达量高,脱毒功能显著。
文档编号C12N15/55GK1211618SQ97100018
公开日1999年3月24日 申请日期1997年2月18日 优先权日1997年2月18日
发明者乔传令, 阎艳春 申请人:中国科学院动物研究所