专利名称：抗人mp52的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的鼠抗人MP52单克隆抗体。具体来讲，本发明涉及与二聚体型人MP-52结合，不与单体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体。
另外，本发明还涉及能产生上述鼠抗人MP52单克隆抗体的杂交瘤及其利用。
背景技术：
人MP52作为属于TGF-β超家族的骨生成因子于1994年分离了其cDNA(Biochem.Biophy.Res.Comm.Vol.204,No.2,1994)。人MP52被认为是N末端具有丙氨酸的由120个氨基酸残基组成的蛋白质，其氨基酸序列记载于WO93/16099,WO95/04819中。通过多种动物实验明确MP52和其他的骨生成因子一样与骨生成有关。但是，骨生成时MP52是被什么直接诱导产生，以什么样的机制达到骨生成现在还有很多不清楚的地方，报道也很少。
另外，MP52在小鼠和人中只是N-末端的一个氨基酸不同，其基因在种间高度保守，因此，从小鼠得到抗人MP52抗体不容易。得到鼠单克隆抗体的报道已经记载于WO93/16099。
发明内容
本发明的目的是提供与二聚体型人MP-52结合，不与单体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体。
试图依靠基因工程学的方法制造人MP52。将整合了编码人MP52cDNA的宿主细胞进行培养而得到人MP52后进行纯化时，使用与人MP-52特异结合的单克隆抗体是一种有效的方法。即，将特异结合于人MP-52的单克隆抗体负载于载体上，并使之与粗纯化的人MP52接触并与人MP52结合，然后再分离人MP52。在这种情况下，分离具有活性的二聚体型人MP-52时，使用特异与二聚体型人MP-52结合的鼠抗人MP-52单克隆抗体有利是显而易见的。
这种抗人MP52单克隆抗体可以应用在人MP52的定量中。人MP52的定量对于MP52诱导因子的确定、骨生成的机制分析是有用的。这种情况下二聚体型MP52在机体内有可能被分解代谢为无活性的单体型或及其片段。通过使用特异地结合于二聚体型MP52的单克隆抗体可以只检测出有活性的二聚体型MP52。
本发明进一步提供，与人MP52生物活性部位结合的抗体。即，提供阻碍人MP 52与其受体结合的抗人MP52鼠单克隆抗体。该抗体特异地识别人MP52的高级结构，并与人MP52活性部位结合而抑制其活性。因为该抗体特异地识别人MP52的活性部位，所以如果存在没有活性的MP52即使是二聚体型MP52该抗体也不识别，这对其分离和定量是很有利的。
本发明中的鼠抗人单克隆抗体根据众所周知的单克隆抗体的制备方法按如下步骤制备。
(1)以人MP52为免疫原长期致敏小鼠，(2)将致敏小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，(3)从得到的杂交瘤细胞中筛选产生抗人MP52单克隆抗体的杂交瘤细胞，(4)对所需的产生单克隆抗体的杂交瘤进行克隆，(5)克隆化的细胞通过大量培养产生抗体或将克隆化的细胞移植到小鼠腹腔中而产生抗体，(6)分离纯化培养上清中的抗体或腹水中的抗体。
更详细说明上述步骤。
步骤(1)免疫致敏小鼠的制备是，先将人MP52溶解于10mM盐酸溶液中，再与弗氏完全佐剂(CFA)混合并乳化后以四个月四次的频度腹腔注射数次。MP52的含量以10～100μg合适。再过约一个月以后将含有10～100μg人MP52的溶液用弗氏非完全佐剂(IFA)同样乳化后腹腔注射。这样与佐剂一起致敏的小鼠经过1～2个月以后皮下注射不含任何佐剂的人MP5210～100μg，并且在细胞融合数日前再尾静脉注射10～100μg人MP52。
已尝试利用整合了编码人MP52的cDNA的表达载体，以CHO细胞等动物细胞以及大肠杆菌等细菌为宿主产生人MP52的方法。发明人尝试分别以CHO细胞产生的人MP52(以下简称CHO-MP52)[产生人MP52的动物细胞株MC-2于1995年6月21日在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)进行了国际保藏，保藏编号为FERM BP-5142]或大肠杆菌产生的人MP52(以下简称rhMP52)[人MP52的表达载体于1995年4月14日在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)进行了国际保藏，保藏编号为FERM BP-5499]单独作为致敏原生成单克隆抗体。但是得到的抗体全都是IgM，且特异性低。但发明人以CHO-MP52和rhMP52两者同时为致敏原时成功地得到特异性高的单克隆抗体。
步骤(2)的细胞融合是，先将步骤(1)中充分免疫致敏的小鼠脾脏取出，按常规方法制备脾细胞悬浮液。然后将得到的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的混合物用温的聚乙二醇进行融合处理。融合处理后，将细胞混合物利用添加胎牛血清(FCS)、HAT[次黄嘌呤(H)，氨基喋呤(A)，胸苷(T)]的培养基去除非融合细胞。然后以低浓度(1个孔中增殖1个克隆的浓度)注入到96孔培养皿中，一周后提取证实细胞增殖的孔中的上清。
步骤(3)的上清中产生的抗人MP52抗体的分析可以利用96孔中包被作为免疫原的人MP52的培养板按通常的ELISA法进行。为了选择不与单体型人MP52结合而与二聚体型人MP52结合的抗人MP52抗体，组合了使用1)未处理(非还原)二聚体型人MP52(D-rhMP52)和2)还原化单体型人MP52(M-rhM52)的两种ELISA。这时，还原状态的单体分子在包被培养板中时容易形成二聚体分子，所以用于包被的单体型按常用方法磺化处理使之不能再形成二聚体。另外，与单体型人MP52和二聚体型人MP52的反应性通过Western印迹法证实了其特异性。结果得到强烈地与M-rhMP52或D-rhMP52的任何一个反应的单克隆抗体和与两者反应的单克隆抗体。
单克隆抗体的特异性可以通过Western印迹法确认。即rhMP52在非还原状态下(D-rhMP)和还原状态下(M-rhMP)进行SDS-PAGE，然后按标准方法转移到硝化纤维素膜上。转移后的硝化纤维素膜与含单克隆抗体的培养上清反应后用HRPO标记的兔抗鼠免疫球蛋白检测。其结果与ELISA法的第一次筛选结果一致。
另外，在ELISA法中使用人MP52类似物TGF-β2和BMP-2作为抗原也可以证实特异性。得到的所有单克隆抗体均未与这些类似物产生交叉反应。
步骤(4)中克隆操作是按有限稀释法注入，使一个孔中有0.5个细胞。
步骤(5)是按众所周知的方法进行。被克隆化的杂交瘤用通常的培养基培养而从培养上清中得到抗体，相对于此，将杂交瘤移植到小鼠腹腔内后可以回收数百倍到数千倍浓度的抗体。
步骤(6)可以按众所周知的方法进行。可以应用使用蛋白A或蛋白G的亲合色谱。
本发明中单克隆抗体的性质可以总结如下(1)该抗体与二聚体型MP52结合。
(2)该抗体不与单体型MP52结合。
(3)该抗体的H-链亚型为γ。
(4)该抗体不与其他的属于TGF-β基因超家族的骨生成因子交叉反应，尤其是具有类似氨基酸序列的TGF-β和BMP-2。
利用本发明中单克隆抗体纯化人MP52可以根据常规的方法进行。将本发明中单克隆抗体吸附在如Sephadex(Pharmacia制)等吸附剂上。将粗纯化的人MP52溶液通过吸附剂的表面，从而人MP52被吸附上。然后将被吸附的人MP52用合适的洗脱剂按常规方法处理，以得到高纯度的人MP52。
利用纯化的单克隆抗体(aMP-1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,18,20,21,22，共20种。)和各种HRPO标记的单克隆抗体的夹心ELISA法可以将抗体分型。
其结果，确定有10种抗体识别rhMP52分子上的表位。将这些分类为TypeA,B,C,D,E,F,G,H和J。
已知大鼠成骨细胞株ROB/C26具有人MP52受体，培养基中添加人MP52时碱性磷酸酶(ALP)的活性增加。在该培养基中添加得到的单克隆抗体，如果ALP的活性受抑制就可以确定抑制了人MP52的生物活性。
结果确定aMP-4,5,8,11,20和21具有抑制活性。其中aMP-4和aMP-5为特异地与D-rhMP52反应的抗体，实质上是在生理条件下抑制MP52与MP52受体结合的单克隆抗体。
利用本发明中单克隆抗体定量人MP52可以通过众所周知的ELISA法等方法进行。本说明书中记载着其具体的实例。人MP52的定量可以以42.4pg/ml的敏感度进行。
附图简述
图1是参考例1(2)中得到的rhMP52的表达载体(pKOT245)质粒图。
图2是CHO-MP52表达载体pMSS99(5.0Kb)质粒图。pMSS99中CHO-MP52DNA碱基序列是序列表中序列号4表示的从第576到第2279核苷酸。
图3是用Western印迹法分析抗单体型(A)和二聚体型(B)rhMP52单克隆抗体反应性的解析图。
图4是调查单克隆抗体的异同性(分型)时的图。例如，示出的为包被aMP-1和aMP-4时的情况。
图5表示利用单克隆抗体定量MP52的曲线。
实施发明的最佳方式下面举参考例和实施例说明本发明。
参考例1.rhMP52的制备1．载体的构建(1)rhMP52成熟区的分离人MP52cDNA是以WO93/16099中记载的含有cDNA的质粒载体(pSK52s)为模板，利用聚合酶链反应(PCR)方法扩增的。
为增加起始密码子ATG周围的AT含量，按照提高目标蛋白质产率的方法[M.Nobuhara等的报告(Agric.Biol.Chem.,52(6),1331～1338,1988)]置换了成熟型MP52基因一部分的DNA。
置换按PCR方法进行，使用含有序列号2中突变的上游PCR引物。PCR引物的DNA序列使用作为上游引物的序列号2的DNA和作为下游引物的序列号3的DNA。
PCR是，在同一试管中添加模板DNA(10ng)、上游及下游PCR引物各50pmol,dNTP(0.2mmol)和MgCl2(1.5mmol)与Taq DNA聚合酶(5U)一起进行反应。
进行30循环的PCR。每个循环由变性(94℃,1分钟)，引物退火(55℃,1分钟)，引物延伸(72℃,2分钟)组成(以下PCR均在这样的条件下进行)。
PCR反应的生成物通过在1.5％低熔点琼脂糖凝胶(FMC)中电泳而分离到相当于序列号1氨基酸序列的约360bp组成的DNA(将此作为片段1)。
(2)本发明中蛋白质的大肠杆菌表达载体的构建为了提高质粒的复制数量，将pRB复制起点换成pUC复制起点。将市售的大肠杆菌表达载体pKK223-3(从Pharmacia Biotech公司购入)的tac启动子区域用限制酶SspⅠ和EcoRⅠ进行酶切消化，再用绿豆核酸酶(宝酒造株式会社，产品编号2420A)处理，用T4DNA连接酶(宝酒造株式会社，产品编号2011A)使之与片段1的起始密码子结合。将pKK223-3的rrnBT1T2终止子区域用限制酶SalⅠ和SspⅠ进行酶切消化，使之与用SalⅠ酶切消化的片段1的终止密码子结合。然后将之结合到pUC18的SmaⅠ位点，构建了生产本发明中蛋白质的表达载体[pKOT245(保藏编号FERM BP-5499)](图1)。pKOT245的DNA的长度是3.7kb。使用Pharmacia ALF DNA测序仪对所制备的该蛋白质表达载体进行了分析，确定了其碱基序列。
(3)转化转化是按照Kushner等人介绍的氯化铷方法[GeneticEngineering,p.17,Elsevier(1978)]进行的。即，根据上述操作方法，将pKOT245转化到宿主大肠杆菌W3110M中，使其成为能够生产本发明蛋白的大肠杆菌。
2．培养(1)培养将表达本发明蛋白的大肠杆菌用修饰SOC培养基(Bacto胰蛋白酶化酪蛋白胨20g/L,Bacto酵母提取物5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化镁·6H2O2.03g/L，葡萄糖3.6g/L)预备培养，再向5L生产用培养基(Bacto胰蛋白酶化酪蛋白胨5g/L，柠檬酸4.3g/L，磷酸氢二钾4.675g/L，磷酸二氢钾1.275g/L，氯化钠0.865g/L，硫酸铁·7H2O100mg/L，硫酸铜·5H2O1mg/L，硫酸锰·nH2O0.5mg/L，氯化钙·2H2O2mg/L，四硼酸钠·10H2O0.225mg/L,(NH4)6Mo7O240.1mg/L，硫酸锌·7H2O2.25mg/L，氯化钴6H2O6mg/L，硫酸镁·7H2O2.2g/L，盐酸硫胺素5.0mg/L，葡萄糖3g/L)中加入细菌悬浊液100ml，在10L的培养箱中一边通气搅拌一边培养。达到对数增殖前期(OD550=5.0)时，向培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，使其最终浓度为1mM，再一直培养到OD550达到150。在培养过程中，温度保持在32℃，通过添加氨水，使pH控制在7.15。为了防止溶解氧浓度的降低，通过加快搅拌速度使空气饱和度达到50％，由此控制溶解氧浓度。另外，为了获得较高的细菌密度(以溶解氧浓度的急剧升高为指标)，向培养基中加入50％葡萄糖溶液，使其中葡萄糖的浓度达到0.2％。
(2)大肠杆菌包涵体的制备将通过以上方法得到的培养液离心，回收细菌，用含有10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.3)制成细菌悬浊液，用组织匀浆器(APV Gaulin公司制造)破碎细菌，再次离心后回收含有包涵体的沉淀物。
3．纯化(1)大肠杆菌包涵体的溶解将大肠杆菌包涵体用1％Triton X-100洗涤3次，于4℃离心30分钟(3000×g)，将得到的沉淀物于20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、8M尿素、10mM DTT和1mM EDTA溶液中经超声波处理使之溶解。
(2)单体的纯化将上述溶液于4℃离心30分钟(20000×g)，收集上清。将回收的上清通过事先用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、6M尿素和1mM EDTA溶液平衡的SP-Sepharose FF层析柱(Pharmacia公司)，再用同种溶液清洗，最后用含有0.5M食盐的同种溶液洗脱。向洗脱液中加入Na2SO3和Na2S4O6，使之最终浓度分别为111mM和13mM，于4℃反应15小时，使之磺化。将磺化溶液通过事先用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、6M尿素、0.2M食盐和1mM EDTA溶液平衡的Sephacryl S-200层析柱(Pharmacia公司)，进行凝胶过滤，得到了单一的磺化的本发明蛋白单体。
(3)重折叠向磺化的本发明蛋白单体溶液中加入9倍量的50mM钠-甘氨酸缓冲液(pH9.8)、1M氯化钠、30mM CHAPS、5mM EDTA、2mM GSH(还原型谷胱甘肽)和1mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)溶液，于4℃搅拌3日，进行了重折叠。
(4)二聚体纯化将重折叠的样品通过事先用0.051TFA、25％乙腈平衡的反相HPLC的RESOURCE RPC层析柱(Pharmacia公司)。用0.05％TFA、25～45％乙腈进行梯度洗脱。洗脱液用紫外分光光度计在280nm监测。将MP-52二聚体组分回收，冷冻干燥后保存。将回收的MP-52二聚体组分通过事先用20mM Tris-磷酸缓冲液(pH8.0)、8M尿素、1M食盐溶液平衡的Sephacryl S-200层析柱进行凝胶过滤之后，在上述同样条件下通过反相HPLC的RESOURCE RPC层析柱，得到了纯化的本发明蛋白二聚体组分。
(5)纯化的本发明蛋白物理化学性质的测定(甲)氨基端氨基酸序列分析用氨基酸测序仪(476A型，Applied Biosystems公司)对上述方法得到的纯化的本发明蛋白的氨基端氨基酸序列进行了分析，确认了序列表序列号1所表示的从氨基端到第30号的氨基酸序列。
(乙)氨基酸组成分析用氨基酸分析仪(PICO TAG Systems,Waters公司)对上述方法得到的纯化的本发明蛋白的氨基酸组成进行了分析，结果如表1所示。表中的数字表示的是每1单体蛋白质含有的氨基酸残基数目。
表1氨基酸实际数目预期数目Asx 11.5 12Glx 10.9 11Ser 8.4 9Gly 4.3 4
His4.04Arg7.77Thr5.46Ala7.37Pro10.2 10Tyr2.93Val5.77Met5.141/2Cys 2.67Ile4.96Leu10.0 10Phe4.04Lys5.96Typ- 2序列长度119-不能测定。
(丙)电泳分析在非还原条件下，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对上述方法得到的纯化蛋白质的分子量进行了测定，结果是大约28KDa。
根据上述(甲)、(乙)、(丙)显示的结果可以认定，本发明中的蛋白质是由119个从氨基端Pro开始的氨基酸残基组成的。
参考例2CHO-MP52的生产(1)CHO-MP52表达载体的构建将Biopharm GmbH公司Hoetten博士提供的含有人MP52基因的pSK52s载体用HindⅢ消化处理，通过从0.8％低融点琼脂糖凝胶中提取，分离出含有人MP52基因的DNA片段，使之与BehringwerkeAG公司Gerd Zettlmeissl博士提供的pABstop载体上的HindⅢ位点连接。通过确定DNA碱基序列和限制酶消化，确认了图2所显示的CHO-MP52表达载体pMSS99(5.0kb)的结构。pMSS99的CHO-MP52DNA碱基序列是序列表中序列号4的第576至第2279号核苷酸。
(2)产生CHO-MP52的CHO克隆的确立应用磷酸钙DNA共转染法，向Behringwerke AG公司GerdZettlmeissl博士提供的CHO-DUKX-B11细胞，即CHO细胞的突变细胞株转染pMSS99和pSVOAdhfr(后者也同样是由Zettlmeissl博士提供的)。然后，根据使用氨甲蝶呤(MTX)的基因扩增技术，确立了CHO-MP52的高产细胞株。
将10μg pMSS99和2μg pSVOAdhfr用1ml 25mM HEPES-140mM氯化钠-0.75mM磷酸氢二钠(pH7.05)溶解，然后与50μl 2.5M氯化钙混合。将得到的沉淀物覆盖于直径10cm平皿中的CHO-DUKX-B11细胞，于室温下静置30分钟。然后向培养细胞中加入8ml胎牛血清(FBS)浓度为10％的含有核糖和脱氧核糖核苷的MEM ALPHA培养基(MEMα+)，在二氧化碳培养箱中培养4～6小时。将细胞用10％甘油于室温下处理3分钟后，用含有10％胎牛血清的MEMα+培养基培养2天。接着将细胞置于透析胎牛血清浓度为10％的不含核糖和脱氧核糖核苷的MEM ALPHA培养基(MEMα-)中，选择出转化体。分离转化克隆，通过下述Western印迹分析法测定了CHO-MP52的表达。
再通过增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度，逐步选择产生CHO-MP52的克隆，依照pSVOAdhfr基因使MP52基因扩增。在400nM氨甲蝶呤时，得到了若干个产生1～3μg CHO-MP52/106细胞/24小时的克隆。
(3)培养上清中CHO-MP52的检测应用下述Western印迹分析法，鉴定了克隆的CHO-MP52表达在还原条件下，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(15～25％聚丙烯酰胺梯度凝胶，第一化学公司)分离培养上清(1～15μl)，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上(PVDF膜，Clear Blot Membrane-P,ATTO)。将此膜用Block Ace(大日本制药)封闭1小时，用Tris缓冲液(TBS)冲洗，然后用10μg/ml经Block Ace稀释10倍的鸡抗CHO-MP52抗体处理，过夜。将此膜用含有0.1％Tween20的TBS(TTBS)漂洗后，用经Block Ace稀释10倍的兔抗鸡IgG-ALP复合物(Sigma-A9171)处理。将此膜用TTBS漂洗，使之与碱性磷酸酶复合物底物试剂盒(BIO-RAD)反应，从而使相当于MP52的条带显现出来。
(4)产生CHO-MP52的CHO细胞系的培养将具有最高CHO-MP52产率的CHO细胞系MC-2(保藏编号FERMBP-5142)放在加有10％胎牛血清、400nM氨甲蝶呤、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEMα-培养基的培养瓶内培养增殖。待MC-2细胞达到汇合之后，用不含胎牛血清的MEMα-清洗，然后用不含胎牛血清的添加了10mM HEPES(pH7.3)、10KIU抑蛋白酶肽、1mM丁酸钠、6μg/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、18μg/ml乙醇胺、9μg/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DME/F12培养基培养。1周内每日收集条件培养基。
(5)CHO-MP52的纯化将CHO培养上清与0.1体积的0.2M磷酸缓冲液(pH6.0)混合，通过事先用50mM氯化钠、20mM磷酸缓冲液(pH6.0)平衡的POROSHS层析柱(10ml,PerSeptive Biosystems公司)。将蛋白质用0.05～2M线性梯度氯化钠洗脱，用20只10ml试管收集蛋白质组分。此方法洗脱的MP52有3种类型的单体，经过还原条件下SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确定这些单体的表观分子量分别是52、40和14KD。这些单体形成了3种类型的同型二聚体(104KD,80KD和28KD)和3种类型的异型二聚体(92KD:40KD～52KD,66KD:14KD～52KD和54KD:14KD～40KD)，将这些二聚体都命名为CHO-MP52。但28KD的同型二聚体作为MP52的成熟型同型二聚体已经得到了公认(WO95/04819)，因此被排除在CHO-MP52之外。因而，将104KD同型二聚体和80KD同型二聚体从上述蛋白质组分中分离出来，测定了其氨基端氨基酸序列及其生物活性。
将第5至第9组分合并到一起，浓缩大约10倍。将浓缩物加样到事先用含有1M氯化钠的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)平衡的Superdex200pg层析柱(1.6I.D.×600cm,Pharmacia公司)。按0.5ml/分钟的流速进行洗脱。分别将含有104kD同型二聚体的组分和含有80KD同型二聚体的组分合并到一起。将各组分上样于反相HPLC层析柱(RESOURCE RPC,3ml,Pharmacia公司)，用35～40％的乙腈洗脱这些蛋白质。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上的蛋白质条带的密度，测定了分离出来的CHO-MP52的浓度。
使用脉冲液气相测序仪(Applied Biosystems476型)，分别对80KD同型二聚体和104KD同型二聚体进行了氨基端氨基酸序列分析。结果如图2所示。
表2HMW MP52 氨基端氨基酸80KD Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu ProAla Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys104KDAla Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly Thr80KD氨基酸序列来自序列表中序列号4的Lys121或Ala122到Arg474,104KD氨基酸序列来自Ala1到Arg474。这证明CHO细胞生产3种类型的同型二聚体，104KD、80KD和28KD，以及3种类型的异型二聚体，即92KD、66KD和54kD二聚体。
实施例1抗原的制备和免疫方法使用含有编码人MP52氨基酸序列的cDNA的质粒(pKOT245)，用大肠杆菌(保藏编号FERM BP-5499)使之表达，通过常规方法把溶解包涵体所得的单体型rhMP52氧化，构成二聚体型rhMP52(以下简称为D-rhMP52，参照参考例1)。经等电点沉淀、凝胶过滤等纯化过程，将最终浓度约为0.5mg/ml的rhMP52作为抗原用于免疫。或者用CHO细胞(保藏编号FERM BP-5142)使之表达(以下简称为CHO-MP52，参照参考例2)，作为抗原也用上述同样浓度免疫。用BALB/c小鼠进行免疫致敏，将CHO-MP52(处理过程不完全的前体占80％以上)用10mM盐酸溶液溶解，与弗氏完全佐剂(CFA)按1∶1的比例混合、乳化。分别在第0、7、16和112日，按70、20、10和52μg的剂量用乳化的抗原给小鼠腹腔注射。并且在第29日，将来自大肠杆菌的MP52(含有若干单体)18μg按同样方法混合、乳化后给小鼠腹腔注射。间隔约1个月后，将含有50μg D-rhMP52的溶液与弗氏不完全佐剂(IFA)按1∶1的比例混合、乳化，给小鼠腹腔注射。对这样连续致敏6次的小鼠，在进行末次免疫后的第42日，将60μg D-rhMP52直接注射到小鼠的皮下(不与佐剂混合)，再间隔42日后(细胞融合3日前)，通过尾静脉给小鼠注射50μgD-rhMP52。
实施例2细胞融合最终免疫3日后，从致敏小鼠体内摘取脾脏，制备脾细胞悬浊液。将得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按10∶1的比例混合，1500rpm离心，于37℃一边缓慢添加40％聚乙二醇(PEG1500)，一边使细胞混合物散开。向试管内缓慢加入1ml不含胎牛血清的RPM1640培养基(日水制药制造)，用吸管尖端轻轻搅拌。然后在6分钟的时间内将离心速度从250rpm逐渐提高到1000rpm，将得到的细胞混合物用不含胎牛血清的培养基再洗一次，最后用含有20％胎牛血清和HAT[次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(S)、胸苷(T)]的RPMI1640培养基将细胞稀释，按每孔10000个脾细胞的比例将细胞注入到96孔培养板内。
实施例3用ELISA方法进行第一次筛选对大约6000个融合细胞的生成物，按以下方法检查是否有抗人MP52单克隆抗体的产生。
1)包被检测板向检测板(NUNC,MAXISORP公司)的各孔内分别加入50μl浓度为1μg/ml的免疫时使用的D-rhMP52，和还原D-rhMP52并将其SH基磺化从而阻断ss结合而得到的单体型rhMP52(以下简称为M-rhMP52)，于室温下温育，包被1小时。
2)用含有Tween20的0.01M磷酸缓冲液(PBS,pH7.2)清洗后，向各孔内加50μl培养上清(原液)，于室温下温育1小时。
3)用上述缓冲液清洗3次后，向各孔内加入45μl浓度大约是1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白抗体(DAKO,F206)。此时所使用的稀释液是将2mg/ml的酪蛋白(casein，关东化学公司)用0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS,pH7.4)溶解后制成的。
4)于室温下温育1小时，用上述缓冲液清洗3次后，向各孔内加入50μl显色液(Chromogen-TMB,Behringwerke公司)。
5)于室温下反应约5分钟后，向各孔内加入50μl 0.5N硫酸，使显色反应停止。
6)反应停止后，30分钟内在OD450nm测定显色程度。
被命名为aMP-1至aMP-23的23个单克隆抗体之中，除了后来在克隆化过程中没能继续维持的aMP-17、aMP-19和aMP-23等3株以外，其余20个单克隆抗体的结果如图3所示。阳性阴性的判定是以阴性对照的平均数±10个标准差(OD450nm=0.05)为分界线的。aMP-1、2、3、4、5、6、7、9、12、14、15、18和aMP-22只与D-rhMP52反应，aMP-8、10、11、13、16、20和aMP-21与D-rhMP52和M-rhMP52两者都反应。因此，从特异性的观点出发，至少可以将这些抗体分成2类。
实施例4通过Western印迹法确认抗体的特异性。
1)将rhMP52(1μg/电泳泳道/0.5mm)分别在非还原条件下(作为D-rhMP52被泳动)和还原条件下(作为M-rhMP52被泳动)用15～25％的梯度凝胶(第一化学公司制造)进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后按常规方法转移到硝酸纤维素膜上(30伏，2小时)。
2)将转移的硝酸纤维素膜用含有大约3mg/ml酪蛋白的TBS缓冲液封闭20分钟以上，防止非特异性反应。
3)将带有rhMP52的硝酸纤维素膜放在含有单克隆抗体的培养上清(4μg/ml～40μg/ml)的原液中，于室温下一边振荡一边温育1小时。
4)用大量的PBS缓冲液(pH7.2)漂洗(浸泡5分钟，换液3次)。
5)使用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠免疫球蛋白抗体作为二抗，将带有rhMP52的硝酸纤维素膜放在用酪蛋白/TBS缓冲液稀释的浓度为1μg/ml的二抗溶液中，于室温下温育1小时。
6)同步骤4)一样，仔细漂洗。
7)将膜放在显色液中(TrueBlue/过氧化物酶底物，KirkegaardPerry Laboratories公司制造)浸泡10分钟，使之出现颜色反应。然后用自来水充分清洗。结果与用ELISA方法进行的第一次筛选时的结果是一致的。结果如图3所示。
实施例5单克隆抗体亚型的鉴定克隆所产生的单克隆抗体的亚型是用鼠单克隆抗体同型试剂盒(Mouse monoclonal antibody isotyping kit,Amersham公司制造，RPN29)按其说明书操作确定的。单克隆抗体的亚型如表4所示。所有单克隆抗体的L链的亚型都是K,H链的亚型是γ1或γ2a。
实施例6特异性的确认人MP52是属于TGF-β基因超家族的分子，其结构和氨基酸序列与其他TGF-β基因超家族，特别是与TGF-β2和BMP-2相类似。为了确定本发明中的单克隆抗体是否有人MP52特异性，得到了人重组体TGF-β2(rhTGFβ2)和人重组体BMP-2(rhBMP-2)，按前述实施例3的同样方法进行了ELISA测定，调查了抗体的特异性。结果如表5所示。
所有这些单克隆抗体都不与TGF-β2和BMP-2反应，由此确认了这些抗体都是MP52特异性抗体。
实施例7抗体的纯化使用Protein A或Protein G层析柱(Pharmacia公司制造)，按使用说明书介绍的方法对培养上清和小鼠腹水中的单克隆抗体进行纯化。培养上清中抗体的纯化用了Protein A层析柱，腹水中抗体的纯化用了Protein G层析柱。
实施例8用夹心ELISA法进行二次筛选(分型)1)以1μg/ml的浓度分别向96孔检测板的各孔内加入50μl纯化的单克隆抗体(aMP-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21和aMP-22共20种)进行包被(1小时，室温下)。
2)用洗涤液清洗(BEP-Ⅱ,Behringwerke公司制造，3次)之后，向各孔内加入50μl一定量的用酪蛋白/TBS稀释的D-rhMP52(30ng/ml)，于室温下温育1小时。
3)清洗后，用生物素化试剂盒(Antibody Labelling systems,Biotinylation试剂盒，American Qualex公司制造)进行测定。分别向各孔内加入生物素化的上述1)所示的单克隆抗体(该抗体用酪蛋白/TBS缓冲液稀释，浓度为1μg/ml)，使之与步骤1)包被的所有单克隆抗体发生反应。例如，对用aMP-1包被的检测板，用生物素化的全部aMP-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21和aMP-22与之反应，对用aMP-2～22包被的检测板，同样也用生物素标记的全部单克隆抗体与之反应(室温，1小时)。
4)清洗后，向各孔内加入用酪蛋白/TBS缓冲液稀释的浓度为1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(抗生物素蛋白-过氧化物酶，Sigma公司制造)，室温下温育1小时。
5)清洗后，与实施例3的第4)步同样，进行显色反应。
6)15分钟后，与实施例3的第5)、6)步同样，使显色反应停止，并测定吸光度。
二次筛选的部分结果如图4所示。理论上如果是同种单克隆抗体，所有的组合都应该得到同样的结果。但是，图4显示的例子表明，aMP-1和aMP-4是完全不同的抗体。根据这些结果，测定了全部单克隆抗体的异同性，并由此确认了对10种抗原表位的特异性不相同的单克隆抗体。如表6所示，将这些抗体分类为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J型。
实施例9单克隆抗体对D-rhMP52生物活性的抑制众所周知，大鼠成骨细胞系ROB/C26具有人MP52的受体，向培养液中加入人MP52后，碱性磷酸酶(ALP)的活性就会升高。因此，我们在加入一定量的rhMP52时，再添加纯化的全部单克隆抗体(使其最终浓度为20μg/ml)，对其是否抑制碱性磷酸酶活性的升高进行了研究。按10ng/ml的浓度向ROB/C26中加入rhMP52，培养数日后，通过细胞表面上的MP52受体传导了刺激，结果使碱性磷酸酶的活性升高。升高的碱性磷酸酶的活性可以通过与碱性磷酸酶特异性的作用底物反应而进行定量，这与ELISA显色反应时的原理是同样的(但是测定波长是OD405nm)。结果如表7所示，无抗体、单独加rhMP52时吸光度是0.158，而加入抗体后吸光度降低了。由此可以判断，与单克隆抗体共存时得到的碱性磷酸酶活性越低，抗体的抑制活性就越强。结果表明，aMP-4、5、8、11、20和aMP-21具有较强的抑制活性。其中aMP-4和aMP-5是与D-rhMP52发生特异性反应的抗体(表1)，这2种抗体与其他4种同M-rhMP52也发生反应的aMP-8、11、20和aMP-21不同，实质上是在生理条件下抑制MP52与MP52受体结合的单克隆抗体。产生单克隆抗体aMP-4和aMP-5的杂交瘤，于1997年5月9日，分别以保藏编号FERM BP-5939和FERM BP-5940向日本通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号)做了国际保藏。
实施例10用夹心ELISA法进行MP52的定量在实施例8的实验中，将单克隆抗体分成了10个种类。使用其中C型的aMP-4和D型的aMP-5建立了夹心ELISA法。具体方法是，1)以5μg/ml的浓度向96孔板的各孔内加入50μl纯化的单克隆抗体aMP-5进行包被(1小时，室温)。
2)用洗涤液清洗后，向各孔内加入50μl用酪蛋白/Tris缓冲液梯度稀释的纯化的MP52，最高浓度为1ng/ml，于室温下温育1小时。
3)用洗涤液清洗后，向各孔内加50μl浓度为1μg/ml的生物素化的aMP-4纯化抗体，于室温下反应1小时。
4)用洗涤液清洗后，向各孔内加入浓度为1μg/ml的抗生物素化的过氧化物酶(Sigma公司，A-3151)，于室温下反应1小时。
5)用洗涤液清洗后，与实施例3的第4)步同样，进行显色反应。
6)30分钟后，加入50μl 0.5N的硫酸使显色反应停止。
7)反应停止后，在吸光度OD450nm测定显色程度。
这些结果如图5所示，检测极限是23.9pg/ml，定量极限是42.4pg/ml。
在这里所说的检测极限是指比不含MP52的缓冲液的背景数值显著增高的MP52的浓度，定量极限是指定量时可以信赖的MP52的最低浓度。
表3用ELISA法测定MP52抗体效价的测定结果使用的抗原单克隆抗体单体型rhMP52二聚体型rhMP52aMP-1 0.03 1.35aMP-2 0.01 1.03aMP-3 0.01 0.92aMP-4 0.01 1.58aMP-5 0.01 1.03aMP-6 0.01 0.96aMP-7 0.01 1.53aMP-8 1.89 1.98aMP-9 0.04 1.15aMP-10 1.08 1.78aMP-11 1.81 1.95aMP-12 0.02 0.33aMP-13 0.26 1.48aMP-14 0.03 1.26aMP-15 0.01 1.35aMP-16 0.06 1.58aMP-18 0.01 1.19aMP-20 1.85 2.01aMP-21 1.41 1.86aMP-22 0.01 0.88抗MP52抗血清1.83 2.23阴性对照0.01 0.01单位；OD450nm分界位；0.05
表4单克隆抗体的亚型亚型单克隆抗体H链 L链aMP-1γ1κaMP-2γ1κaMP-3γ1κaMP-4γ2a κaMP-5γ1κaMP-6γ1κaMP-7γ2a κaMP-8γ1κaMP-9γ1κaMP-10 γ1κaMP-11 γ1κaMP-12 γ1κaMP-13 γ1κaMP-14 γ2a κaMP-15 γ1κaMP-16 γ1κaMP-18 γ1κaMP-20 γ1κaMP-21 γ1κaMP-22 γ2a κ
表5单克隆抗体的特异性使用的抗原单克隆抗体 rhTGFβ2rhBMP-2aM-1 0.016 0.06aMP-20.014 0.043aMP-30.047 0.055aMP-40.046 0.048aMP-50.018 0.024aMP-60.029 0.018aMP-70.026 0.03aMP-80.034 0.032aMP-90.011 0.032aMP-10 0.019 0.028aMP-11 0.019 0.027aMP-12 0.012 0.018aMP-13 0.035 0.035aMP-14 0.022 0.024aMP-15 0.015 0.023aMP-16 0.023 0.028aMP-18 0.035 0.025aMP-20 0.025 0.018aMP-21 0.029 0.019aMP-22 0.025 0.02抗TGFβ抗体 2.2 0.025含有BMP-2抗体的抗血清1.5 1.351阴性对照 0.076 0.065单位；OD450nm分界值；阴性对照值表6单克隆抗体的分类Type 与同一抗原表位反应的单克隆抗体AaMP-1,aMP-15BaMP-2,aMP-3,aMP-6,aMP-7,aMP-18CaMP-4DaMP-5EaMP-8,aMP-11,aMP-20FaMP-9,aMP-14GaMP-10,aMP-21HaMP-12IaMP-13,aMP-16JaMP-22
表7用单克隆抗体进行碱性磷酸酶活性抑制试验添加的单克隆抗体ALP活性aMP-1 0.098aMP-2 0.125aMP-3 0.143aMP-4 0.014aMP-5 0.022aMP-6 0.142aMP-7 0.027aMP-8 0.021aMP-9 0.04aMP-10 0.045aMP-11 0.009aMP-12 0.114aMP-13 0.06aMP-14 0.079aMP-15 0.07aMP-16 0.077aMP-18 0.092aMP-20 0.016aMP-21 0.018aMP-22 0.139抗体未添加 0.158单位；OD405nm测定值；减去没有MP52时的对照值的数值工业实用性本发明的鼠抗人MP52单克隆抗体可以用来对基因工程技术所产生的人MP52进行纯化和定量。
序列表序列号1序列长度119序列类型氨基酸拓扑构型线型序列种类肽片段类型N-末端片段原始来源生物人(homo sapiens)组织类型胎儿序列特征存在位置其它信息MP52氨基酸序列的第388号到501号氨基酸序列序列CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT 48Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala5 10 15CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG 96Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp20 25 30GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG 144Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu35 40 45GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT 192Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His50 55 60GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA 240Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro65 70 75 80CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG CGA CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC 288Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe85 90 95ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC 336Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val100 105 110GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 357Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg115序列号2序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑构型线型序列种类其它核酸原始来源无生物无株系无序列特征MP52成熟型PCR上游引物序列ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC 27序列号3序列长度26序列类型核酸链型单链拓扑构型线型序列种类其它核酸原始来源无生物无株系无序列特征MP52成熟型PCR下游引物序列CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT 26序列号4序列类型对应蛋白质的核苷酸序列长度2703链型双链拓扑构型线型分子类型cDNA-mRNA原始来源生物人(homo sapiens)640-720bp信号肽1783-2142bp成熟肽组织类型胎儿序列CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG60TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA 300TCCCTCAGCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCAGG AGAAAGGGGG 360CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC 420GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG ACTGGATACA AACACACACC CGGCAGACTT 480CAAGAGTCTC AGACTGAGGA GAAAGCCTTT CCTTCTGCTG CTACTGCTGC TGCCGCTGCT 540TTTGAAAGTC CACTCCTTTC ATGGTTTTTC CTGCCAAACC AGAGGCACCT TTGCTGCTGC 600CGCTGTTCTC TTTGGTGTCA TTCAGCGGCT GGCCAGAGG ATG AGA CTC CCC AAA 654Met Arg Leu Pro Lys-25CTC CTC ACT TTC TTG CTT TGG TAC CTG GCT TGG CTG GAC CTG GAA TTC702Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe-20 -15 -10ATC TGC ACT GTG TTG GGT GCC CCT GACTTG GGC CAG AGA CCC CAG GGG 750Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly-5 1 5 10ACC AGG CCA GGA TTG GCC AAA GCA GAG GCC AAG GAG AGG CCC CCC CTG798Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu15 20 25GCC CGG AAC GTC TTC AGG CCA GGG GGT CAC AGC TAT GGT GGG GGG GCC846Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala30 35 40ACC AAT GCC AAT GCC AGG GCA AAG GGA GGC ACC GGG CAG ACA GGA GGC894Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly45 50 55CTG ACA CAG CCC AAG AAG GAT GAA CCC AAA AAG CTG CCC CCC AGA CCG942Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro60 65 70GGC GGC CCT GAA CCC AAG CCA GGA CAC CCT CCC CAA ACA AGG CAG GCT990Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala75 80 85 90ACA GCC CGG ACT GTG ACC CCA AAA GGA CAG CTT CCC GGA GGC AAG GCA 1038Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala95 100 105CCC CCA AAA GCA GGA TCT GTC CCC AGC TCC TTC CTG CTG AAG AAG GCC 1086Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala110 115 120AGG GAG CCC GGG CCC CCA CGA GAG CCC AAG GAG CCG TTT CGC CCA CCC 1134Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro125 130 135CCC ATC ACA CCC CAC GAG TAC ATG CTC TCG CTG TAC AGG ACG CTG TCC 1182Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser140 145 150GAT GCT GAC AGA AAG GGA GGC AAC AGC AGC GTG AAG TTG GAG GCT GGC 1230Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly155 160 165 170CTG GCC AAC ACC ATC ACC AGC TIT ATT GAC AAA GGG CAA GAT GAC CGA 1278Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg175 180 185GGT CCC GTG GTC AGG AAG CAG AGG TAC GTG TTT GAC ATT AGT GCC CTG 1326Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu190 195 200GAG AAG GAT GGG CTG CTG GGG GCC GAG CTG CGG ATC TTG CGG AAG AAG 1374Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys205 210 215CCC TCG GAC ACG GCC AAG CCA GCG GCC CCC GGA GGC GGG CGG GCT GCC 1422Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala220 225 230CAG CTG AAG CTG TCC AGC TGC CCC AGC GGC CGG CAG CCG GCC TCC TTG 1470Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu235 240 245 250CTG GAT GTG CGC TCC GTG CCA GGC CTG GAC GGA TCT GGC TGG GAG GTG 1518Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val255 260 265TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG 1566Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu270 275 280TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT 1614Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg285 290 295GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG 1662Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu300 305 310TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG 1710Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu315 320 325 330ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG 1758Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu335 340 345TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC 1806Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly350 355 360AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG 1854Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu365 370 375CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC 1902His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro380 385 390CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG 1950Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu395 400 405 410CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG 1998Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met415 420 425AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG 2046Ash Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr430 435 440CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG 2094Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val445 450 455GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 2142Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg460 465 470TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC2195***475TGCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGCA GGAGCATCTA CACAGCTTGG2255GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC2315CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG2375CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAGTGCTTT2435CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC2495TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG2555TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA2615GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT2675TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT 270权利要求
1．与二聚体型人MP52结合，不与单体型人MP52结合的鼠抗人MP52单克隆抗体。
2．具有下列性质的鼠单克隆抗体(1)与二聚体型人MP52结合；(2)不与单体型人MP52结合；(3)H链的亚型为γ；(4)不与其他的属于TGF-β基因超家族的骨生成因子交叉反应，尤其是具有类似氨基酸序列的TGF-β和BMP-2。
3．权利要求1或2记载的鼠单克隆抗体，该抗体与人MP52的活性部位结合。
4．权利要求1至3任何一项的鼠抗人MP52单克隆抗体，该抗体为单克隆抗体aMP-4。
5．权利要求1至3任何一项的鼠抗人MP52单克隆抗体，该抗体为单克隆抗体aMP-5。
6．产生权利要求1至3任何一项的鼠抗人MP52单克隆抗体的杂交瘤。
7．权利要求6的杂交瘤，其产生单克隆抗体aMP-4或aMP-5。
8．纯化二聚体型人MP52的方法，该方法利用权利要求1至3任何一项的鼠抗人MP52单克隆抗体。
9．权利要求8的二聚体型人MP52的纯化方法，该方法利用单克隆抗体aMP-4或aMP-5。
10．二聚体型人MP52的检测方法，该方法利用权利要求1至3任何一项的鼠抗人MP52单克隆抗体。
11．权利要求10的二聚体型人MP52的检测方法，该方法利用单克隆抗体aMP-4或aMP-5。
全文摘要
可与二聚体型人MP－52结合,不与单体型人MP－52结合的鼠抗人MP－52单克隆抗体。以CHO细胞产生的人MP－52(CHO－MP52)和大肠杆菌产生的人MP－52(rhMP52)为致敏原致敏小鼠而得到上述由IgG组成的高特异性鼠单克隆抗体。上述抗体在利用基因工程技术得到的人MP52的纯化和定量中有用。
文档编号C12N15/12GK1225128SQ97196365
公开日1999年8月4日 申请日期1997年5月13日 优先权日1997年5月13日
发明者北川宽, 实川友史, 柳泽幸子, 中川启 申请人:赫斯·马里恩·鲁索株式会社