一种利用鲜果渣液体深层发酵制备高蛋白果渣的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于苹果渣废物利用和生物饲料领域，具体涉及一种利用鲜果渣液体深层 发酵制备高蛋白果渣的方法。
【背景技术】
[0002] 我国水果产量和种植面积均居世界前列，每年产生苹果渣近千万吨。苹果渣中所 含水分较高，可溶性营养物的含量较高，容易造成微生物的滋生，如若不及时处理，就会腐 败变质，不仅造成了资源的严重浪费，更会对环境造成危害。目前，苹果渣的利用主要分为 非发酵利用和发酵利用两个方面。
[0003] 非发酵利用的方法有：鲜食、干制饲料、分离提取有效成分等。鲜苹果渣由于其适 口性差、易霉变、蛋白质含量低等原因不能直接作饲料，所以需与其他饲料进行配比；干制 后虽解决了易霉变等问题，但在饲料中复配时仍然存在蛋白含量低等缺点；分离提取又会 产生大量二次残渣。
[0004] 发酵利用的方法分为自然发酵和接种发酵。自然发酵适口性较差、易滋生有害 菌。接种发酵又分为两个大的方面：1.利用微生物发酵生产酒精、沼气、柠檬酸、苹果醋等； 2.接种益生菌生产蛋白质饲料。其中，利用微生物发酵生产酒精、沼气、柠檬酸、苹果醋等， 又会伴随着大量二次残渣的出现，形成对环境的二次污染。而接种益生菌生产蛋白饲料是 一种能够将苹果渣达到完全的利用、无环境二次污染、成本较低且具有高附加值的利用方 法，现就这一方面进行以下概述：
[0005] 目前，利用接种益生菌生产蛋白饲料对苹果渣进行开发利用的研宄成果来看，发 酵方式大多为固态发酵，浅盘液体发酵也有报道。武运，李焕荣等人利用固态发酵法对苹果 渣生产菌体饲料蛋白进行了研宄。高卫卫利用产朊假丝酵母，对苹果渣进行固体发酵。而 固态发酵也有其局限性，不利于工业化生产：1.菌种限于耐低水活性的微生物，菌种选择 性少。2.发酵速度慢，周期较长。3.占地面积过大，规模受限。4.工艺参数难测准和控制。 5.批量产出的产品少，工艺操作消耗劳力多，强度大。6.由于自动化程度差，过程中大多环 节需要认为操作，易污染杂菌。张宗舟，巩晓芳等发表的专利中利用苹果渣液体培养基进行 浅盘培养，发酵2-7天，取菌膜烘干供饲料添加所用。浅盘液体发酵的局限性在于：1.发酵 占地面积大，规模受限。2.由于发酵过程中需要翻盘，人力消耗大。3.批量产出产品少。 4.需要露天培养，更易污染杂菌。5.仅靠观察菌膜厚度判断发酵效果，工艺参数难测准和 控制。徐抗震，宋纪蓉等利用液固态进行发酵，即菌种一次活化之后，将多菌种混合小规模 液态发酵，再接入到固态培养基中进行固态发酵，此方法利用的液体发酵仅限于菌种二次 活化以利于多菌种相互适应，在后期仍需固态发酵。另外，田杏芳，王连民则着手于利用苹 果渣等配成的混合培养基生产发酵饲料，在发酵过程中不添加外源含氮物，在于利用培养 基增菌，即将培养基中的蛋白质转换为菌体，着重益生菌发酵饲料的保健作用，不涉及蛋白 质含量的大量增加。宁瑛的研宄成果原理与之类似。这些研宄所用的发酵方法也是固态发 酵，或添加少量水成半固态，在发酵过程中的弊端与以上类似。
[0006] 综上所述，现有的发酵方法弊端较多，受诸多不确定因素影响，发酵时间长，消耗 大，最大的问题的是难以实现大规模工业化生产。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用鲜果渣液体 深层发酵制备高蛋白果渣的方法，该方法发酵速度快、周期短，过程易控制，产量高，利于工 业化生产。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0009] 一种利用鲜果渣液体深层发酵制备高蛋白果渣的方法，包括以下步骤：
[0010] 1)菌种一级活化
[0011] 向Yro培养基中接入0. 5%~1 %的酿酒酵母或产朊假丝酵母，灭菌后，培养活化 至活菌数大于IO8CfuAiL ;
[0012] 2)菌种二级活化
[0013] 按1000 :(2. 5~4) :(0.7~L 5)的质量比，取苹果渣浆料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的质量比，取苹果渣浆料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0014] 混匀、灭菌后，按3%~5%的接种量接入经一级活化的酿酒酵母或产朊假丝酵 母，然后发酵培养至活菌数大于IO 8CfuAiL ;
[0015] 3)菌种三级活化
[0016] 按1000 :(2. 5~4) :(0.7~L 5)的质量比，取苹果渣浆料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的质量比，取苹果渣浆料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0017] 混匀后经超高温瞬时灭菌后，按5%~10%的接种量接入经二级活化的酿酒酵母 或产朊假丝酵母，然后发酵培养至活菌数大于IO 8CfuAiL ;
[0018] 4)液体深层发酵
[0019] 按1000 : (2. 5~7) : (0. 7~1. 5)的质量比，取苹果渣浆料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的质量比，取苹果渣浆料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0020] 混匀后经超高温瞬时灭菌后，按5%~10%的接种量接入经三级级活化的酿酒酵 母或产朊假丝酵母，然后发酵培养18~24h后活菌数达4. 0 X IO8~5. 0 X 10 8cfU/mL，制得 高蛋白果渣。
[0021] 步骤1)所述的菌种一级活化，是将Yro培养基装入0. 05~IL的发酵容器中，装 料量为20 %~30 %，在121 °C下灭菌15-20min，然后接入酿酒酵母或产朊假丝酵母后，在 25~30°C下培养12~24h。
[0022] YPD培养基的成分为：IOg酵母浸粉、IOg蛋白胨、20g葡萄糖及IL蒸馏水，调节pH 值至5~6。
[0023] 步骤2)菌种二级活化采用5~50L的发酵罐，装料量为70 %~80% ;灭菌是在 115~121°C下，处理20~30min ;且接入酿酒酵母或产朊假丝酵母后，发酵罐的通气量为 0? 5~0? 7V/V ? min，搅拌转速为200~300rpm，在25~28°C下，发酵培养20~48h，发酵 过程中pH值控制在5~6。
[0024] 步骤3)菌种三级活化采用50~100L的发酵罐，装料量为60%~70%;超高温瞬 时灭菌是在135~140°C下处理4~8s ;且接入酿酒酵母或产朊假丝酵母后，发酵罐的通气 量为0. 6~0. 9V/V .min,搅拌转速为200~300rpm，在25~28°C下，发酵培养24~48h， 发酵过程中pH值控制在5~6。
[0025] 步骤4)液体深层发酵采用500~1000L的发酵罐，装料量为60%~70%;超高温 瞬时灭菌是在135~140°C下处理6~IOs ;且接入酿酒酵母或产朊假丝酵母后，发酵罐的 通气量为〇. 8~I. 0V/V ? min，搅拌转速为200~300rpm，在26~28°C下，发酵培养18~ 24h，发酵过程中pH值控制在5~6。
[0026] 所述苹果渣浆料是按鲜苹果渣：水=120~150kg :1000L的料液比，将鲜苹果渣 和水混合后进行破碎打浆后制得。
[0027] 破碎打浆的粒度为20~60目。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0029] 本发明方法利用新鲜果渣为原料，将酿酒酵母或产朊假丝酵母菌种经三级活化后 再进行液体深层发酵，制得高蛋白果渣。本发明方法中三级活化菌种的培养基与液体深层 发酵的培养基成分相同，省去了活化菌种时配制专用培养基的成本，同时能够最大限度地 对苹果渣进行综合利用；活化好的菌体能够更好地适应生长环境，而且由于发酵罐能够控 制溶氧，所以菌种在接入发酵罐后能在短时间内达到生长的高峰，同时真蛋白含量也达到 最高峰，活菌数与真蛋白含量兼顾，有效缩短了发酵周期。本发明方法在制备过程中，由于 减少了发酵过程中的人为操作，不易污染杂菌，且发酵过程中可以随时监测各项指标，易于 控制。
【附图说明】
[0030] 图1为培养过程中活菌数的细胞生长动力学变化曲线；
[0031] 图2为培养过程中真蛋白增长动力学变化曲线。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0033] 本发明中公开的内容中：
[0034] 1.文中所述通气量范围为0. 5-1 (V/V ?min)，即指每分钟通入的无菌空气的体积： 培养液的体积=〇. 5-1。例如，设置通气量为0. 5 (V/V min)时，内装Im3培养液的发酵罐， 每分钟通入0. 5m3的无菌空气。
[0035] 2.文中所述真蛋白为干物质含量。真蛋白含量测定原理为：蛋白质在碱性条件 下，与重金属盐类发生作用，沉淀析出，析出的沉淀不溶于热水，而非蛋白氮易溶于水，用热 水洗涤沉淀，洗去非蛋白氮，剩下的沉淀物再用凯氏定氮法测定，即得真蛋白含量。
[0036] 真蛋白增长量（g/kg)=发酵后真蛋白含量（g/kg)_未发酵果渣中真蛋白含量（g/ kg) 〇
[0037] 3.通过文中所述方法进行发酵，可获得活菌数为4-5X108cfu/mL，真蛋白含量为 175-205g/kg的发酵液，发酵液可不经干燥直接饲喂，也可用通过流化床干燥机烘干、喷雾 干燥等，即得干燥饲料。
[0038] 4、本发明所用的酿酒酵母和产朊假丝酵母购自微生物研宄院
[0039] 实施例1
[0040] 一种利用鲜果渣液体深层发酵制备高蛋白果渣的方法，包括以下步骤：
[0041] 1.菌种的一级活化：将Yro培养基（酵母浸粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、pH5-6， 蒸馏水1L)分装入500mL的三角瓶中，装料量30%，在121°C下灭菌15min，接入0. 5%的酿 酒酵母，25°C培养18h。
[0042] 2.菌种的二级活化：将1000kg苹果渣浆料（按鲜苹果渣120kg :水1000L的比例， 在打浆机中进行破碎打浆，破碎粒度为60目）、3kg CO(NH2)2和0.7kg甘蔗糖蜜混匀后装入 5L的发酵罐中，装料量70 %，在115°C下灭菌20min，接入3 %的酿酒酵母，通气量为0. 5 (V/ V ? min)，搅拌转速200rpm，25°C培养20h，发酵过程中pH控制在5-6。
[0043] 3.菌种的三级活化：将1000 kg苹果渣浆料（按鲜苹果渣120kg :水1000L的比例， 在