含多羟基苯化合物的制作方法

专利名称：含多羟基苯化合物的制作方法
相关申请的交互参考依据35USC§119(e)，本申请要求优先权，美国临时申请第60/183,668号，2000年2月18日提出。
关于联邦资助研究的声明本发明的完成有部分是由国家健康协会(补助金DK41070与CA58073)所资助。因此，在本发明中美国政府可以有某种程度的权利。
背景技术：
在东方文化中，长久以来即被广泛的相信，茶在预防与处理许多疾病中具有药效。然而茶在科学及医学的评价，却是只有最近才开始。茶是否为具有医学上的疗效，在早期流行病学的研究产生不确定的迹象。绿茶被发现含有含多羟基苯化合物。因此，这些化合物或衍生物将被探究是否它们是有益于健康的。
发明概述本发明的一方面涉及一种使受治疗者减少食物吸收的方法。该方法包括给予受治疗者所需要的有效量的下式(I)化合物 A是C1-14烃、氧、硫、或氮。该烃选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、及杂芳香基。每一个所谈到的部分(moieties)是任意地被以烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代。每一个Ra、Rb、Rc及Rd各自独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、杂芳香基、芳香基烷基、杂芳香基烷基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式(II)的部份 L是-L1-L2-L3-，L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R’)-、-CO-、-N(R’)-CO-、-CO-N(R’)-、-N(R’)-SO2-、-SO2-N(R’)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或删除。每一个L1及L2各自独立地代表-(CR’＝CR”)n-、-(C≡C)n-、-(C(R’)(R”))n-、或删除。每一个R’及R”各自独立地代表氢、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基、氨基、硝基、氰基、卤素、或卤化烷基，且n代表1、2、或3，每一个R1、R2、R3、R4及R5各自独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基。注意，当A是氧或硫时，Ra及Rb两者被删除；且当A是氮时，Ra被删除。更进一步地，至少一个(例如，二个)Ra、Rb、Rc及Rd是如式(II)的部份，且至少二个R1、R2、R3、R4及R5是羟基、烷氧基、或烷基羰氧基，其互相间的关系是间位或邻位。式(I)化合物也可以导致减少血清营养物，例如，葡萄糖、胆固醇，及甘油三脂的水平。因此，使用式(I)化合物减少该等血清营养物水平的方法，是在本发明的范围中。注意，此新颖的式(I)化合物及包含一或更多新化合物的组合物，也是在本发明的范围中。
本发明的另一方面涉及一种在受治疗者中减少内分泌水平的方法。该方法包含提供受治疗者所需有效量的前述式(I)化合物。内分泌是一种产生在内分泌系统中的化学物质，例如，激素。该内分泌的水平会被式(I)化合物所影响的包括睪丸素、雌二醇、瘦素(leptin)、胰岛素、类似胰岛素的生长要素、以及黄体激素。借由提供式(I)化合物来抑制器官例如前列腺、精囊、凝结腺、子宫、以及卵巢生长的方法也是在本发明的范围中。
本发明的另一方面涉及一种治疗有关上面所提到的内分泌或营养物上升水平的失调或疾病的方法。该方法包括提供给受治疗者所需有效量的如上所述式(I)的化合物。一些此类的失调或疾病举例有前列腺增生开始、前列腺癌、皮肤失调(例如，粉刺)、皮脂溢、一般性秃头、多毛症、汗腺炎化脓、肥胖、乳癌、卵巢癌、第II型糖尿病、心血管疾病、血管增生、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、炎症、血管瘤，以及牛皮癣。使用式(I)化合物制造药物以治疗上述所提的失调或疾病，也是在本发明的范围中。
本发明的另一方面涉及一种脂质体(liposomal)制剂，其包括脂质体和截留在其中的前述式(I)化合物。该脂质体可以由脂质例如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰肌醇、以及胆固醇硫酸盐所形成。
下述为一些式(I)化合物的举例 (EGCG)结构E 结构F 结构G 结构H 结构I 结构J式(I)化合物医药可接受的盐类的形成例如，介于具有一羧基的式(I)化合物与一阳离子的相对离子如一碱金属阳离子例如，钠离子或钾离子的间；或一铵离子其可被有机基，例如，四甲基铵离子或二异丙基-乙基铵离子所取代。式(I)化合物的盐类也可以被形成在介于具有一质子化氨基式(I)化合物与一阴离子相对离子的间例如，硫酸根离子、硝酸根离子、磷酸根离子，或醋酸根离子。
可以了解的是该式(I)化合物可以包含对称性的碳原子。换句话说，它可以含有光学异构物或消旋体异构物。这些异构物全部在本发明的范围中。
这其中所使用的，烷基包括1到14碳原子的直链或支链烃。举例烷基包括但不限制于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、2-丁基、3-丁基、正-戊基、2-甲基己基、3-乙基辛基、及4-乙基癸基。
名词”烯基”及”炔基”，被当做是直链或支链烃，各自地包含2到14碳原子以及一或更多(例如，1-7)双或参键。一些烯基及炔基的例子有丙烯基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基、2-丁炔基、2-戊炔基、及2-己炔基。
环烷基的意指为环状的烷基，含有3到14个碳原子。一些环烷基的例子有环丙基、环戊基、环己基、环庚基、金刚基、及降茨基。杂环烷基是一环烷基，含有1-6个杂原子，例如氮、氧、或硫。杂环烷基的例子包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、及吗林基。环烯基是一环烷基，含有一个或多个(例如，1-3)双键。此基团的例子包括环戊烯基、1，4-环己-二-烯基、环庚烯基、及环辛烯基。以同样的说法，杂环烯基是一个杂环烷基、含有一个或多个双键。
此处所称的，芳香族基是一芳香族基团，含有6-14个环原子，且有时包括稠环，它可以是饱和、不饱和、或芳香族的。芳香族基的例子包括苯基、萘基、联苯基、菲基、及蒽基。杂芳香基是芳香基含有1-3个杂原子，如氮、氧、或硫，且有时包括稠环。一些杂芳香环的例子为吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基。
注意，该氨基可以是未经取代、单取代或双取代。其可以被取代的基团例如烷基、环烷基、杂环烷基、芳香基、杂芳香基、芳香烷基、或芳香烷基。卤素为氟、氯、溴、或碘。一些单糖的例子为戊糖以及己糖。
本发明的其它特征或优点将由下述详细说明，并且也由权利要求书说明。
详细说明本发明是关于使用一种前述式(I)的含多羟基化苯化合物以减少食物吸收；降低特定内分泌(例如睪丸素、雌二醇、瘦素、胰岛素、类似胰岛素样的生长要素-I(IGF-I)，以及黄体激素(LH))与营养物(例如，葡萄糖、胆固醇，及甘油三脂)在血液中的水平；治疗或预防任何因为该等内分泌或营养水平上升所引起的不适的失调或疾病；并减缓受治疗者特定器官(例如前列腺、子宫以及卵巢)的增长。EGCG或其衍生物可以被以各种的方法提供，包括以形成脂质体制剂提供腹膜内注射或口服给药。
式(I)化合物可以从自然的来源中获得。例如(-)表棓儿茶素-3-棓酸盐(EGCG)及(-)表儿茶素-3-棓酸盐(ECG)可以被从绿茶(Camelliasinensis)中，根据Liao等人在Biochem.Biophys.Res.Commum 214833-838(1995)中所描述的步骤离析。一些式(I)化合物例如，单宁酸，也可以商业性地买到，从已知的化学品卖主，如Sigma化学公司(St.Louis，MO)。另一方面，式(I)化合物可以被以如下述方法合成制备。
如上所描述的式(I)化合物，含有多羟基苯部分，其经由连接基L被连接到A部分上。参见上述式(II)化合物。式(I)化合物，其中L包含一氨基键者可以经由反应一含氨基的A’与一含羟基的Ra’而形成。注意，A’及Ra’为相互反应后可以分别产生A和Ra部分的化合物。请参考如下第一个反应所示的反应流程I化合物A’是棓酸，且化合物Ra’是6-羟基多巴胺。这二种化合物在一般的偶合试剂中例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、苯三偶氮-1-基氧基三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)，或O-苯三偶氮-1-基-N，N，N’，N’-四甲基糖醛酸六氟磷酸盐(HBTU)的存在下被偶合以形成化合物X。同样地，咖啡酸与3-O-甲基多巴胺可以被偶合以形成化合物XII。参见反应流程I的最后反应式，化合物XI，其中L包含一个羰基，可以被以甲基3，4，5-三甲基苯甲酸酯与4-二甲基氨基苯甲醛在碱性介质中反应制备。参见反应流程I的第二个反应式。
反应流程I 棓酸6-羟基多巴胺 化合物X 3，4，5-三甲基苯甲酸甲酯4-二甲基氨基苯甲醛 化合物XI 咖啡酸 3-O-甲基多巴胺 化合物XIIEDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺下述反应流程II-V描述制备式(I)化合物的方法，其中A是烯基或芳香族基。
反应流程II下列反应流程显示没食子酸衍生物复合物，例如可合成化合物K。氧化偶合该3’，4’，5’-三甲氧基乙酰苯(1)的烯醇盐，得到1，4-二酮(2)，将化合物2施以溴化反应，接着去溴化氢反应而转化成3。3被以BBr3去甲基化而得到反式-K，它在丙酮溶液中照射光而可被转变成顺式-K。 反应流程III具有四羟基苯化合物，类似化合物J可以被依如下描述的反应流程合成，如被描述在下反应流程中。3’，4’，5’-三甲氧基苯甲醇(1)以四个步骤被转化成3’，4’，5’-三甲氧基苯基醋酸酯(5)。化合物5被以LDA处理，然后水解以得到1，3-双(3’，4’，5’-三甲氧基苯基)丙酮(6)。6以低价钛还原偶合得到相对应的四苯甲基乙烯(7)，它被以BBr3去甲基化得到化合物(结构J)。 反应流程IV进行3’，4’，5’-三甲氧基乙酰苯(1)与乙基3’，4’，5’-三甲氧基苯甲基酯(2)的缩合反应得到1，3-双(3’，4’，5’-三甲氧基苯基)-1，3-丙烷二酮(3)。加4-苯基三唑啉二酮到3而得到2-尿唑基-1，3-丙烷二酮，其再被以叔丁基次氯酸盐(t-BuOCl)氧化成相对应的N-苯基三唑啉二酮产生(4)。所产生的(4)被以3的烯醇盐处理，以得到相对应的四苯甲酰基乙烯(5)，它被去甲基化，以得到化合物J2。 反应流程V将EGC乙酰化，接着进行选择性地在三倍缓冲剂pH8.2中去乙酰化，得到单乙酸酯2。硅化该苯酚羟基，并随后去乙酰化，可得到五硅化的表棓儿茶素4。4的十四烯酸酯(MOA)的制备是在DCC(二环己基碳化二亚胺)及DMAP(9-二甲基氨基吡啶)存在下以MOA转移酯化反应而得到。用三乙基胺三氟化氢去保护5使在令人满意的产率中得到EGC-MOA6。 依上述合成方法而制备的式(I)化合物可以被快速柱色层、制备型高性能液相色谱、或结晶而纯化。
如上述所提起，式(I)化合物，减少食物吸收并抑制器官成长，例如前列腺、精囊、凝结腺、子宫、以及卵巢。它也减少受治疗者的特定内分泌或营养物的循环水平。这些内分泌或营养物包括睪丸素、雌二醇、瘦素、胰岛素、类似胰岛素的生长要素-I、黄体激素、葡萄糖、胆固醇、及甘油三脂。有关上述内分泌或营养物的水平升高的疾病或病症，包括前列腺增生开始、前列腺癌、皮肤失调(例如粉刺)、皮脂溢、一般性秃头、多毛症、汗腺炎化脓、肥胖、乳癌、卵巢癌、第II型糖尿病、心血管疾病、血管增生、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、炎症、血管瘤，以及牛皮癣。所有上述这些病症或疾病是能够提供给受治疗者所需要的有效量的式(I)化合物或是它的盐类而加以治疗的。
有效量被定义为给予受治疗者所需要的式(I)化合物的量，而可以使该被治疗的受治疗者产生医疗的效果。该有效量被提供给受治疗者的标准是基于身体表面区域、接受实验者的重量、以及受治疗者的情况。剂量对受治疗者的关系(以毫克每身体表面积的平方米为基础)，被Freireich等人在Cancer Chemother.Rep.1966，50，219中描述。身体的表面区域可以被大概的从受治疗者的高度与重量决定。参见例如，ScientificTables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。式(I)化合物的有效量被用于本发明的实施中，可能的范围从1毫克/公斤到大约2克/公斤，例如，从大约1毫克/公斤到大约1克/公斤、从大约1毫克/公斤到大约500毫克/公斤，或是从大约1毫克/公斤到大约150毫克/公斤。效果的呈现也将多样化，以在该技艺中的这些技能被认可，依据提供的途径、使用的剂型，以及可能共同使用的，其它具疗效的治疗。
包含式(I)化合物的药物组合物可以经由非肠胃途径，包括皮下、腹膜内、肌肉内、以及通过静脉给药。肠胃剂型式的例子包括活化剂的水溶液、在等渗压盐水中、5％葡萄糖、或其它已知制药可接受的赋型剂。溶解促进剂如环葡聚糖，或其它在该技艺中这些常见已知的溶解促进剂，有时会被用作制药的赋型剂以投递该有疗效的化合物。
式(I)化合物有时也会被利用已知的方法配制剂型，以用于其它提供途径。它们可以被配制例如，在剂量型式中，以胶封、糖浆、胶囊、或片剂用于口服给药。胶囊可以包含任何已知制药可接受的物质、例如凝胶或纤维素衍生物。片剂可以依据传统的步骤以压缩含有本发明的化合物与固体媒介物以及润滑油的混合物而配制。固体载体的例子有包含淀粉与糖胶。本发明的类固醇衍生物，也可以被以硬壳药片或胶囊的型式给药，含有黏结剂(例如，乳糖或甘露糖醇)以及传统的填充剂。
式(I)化合物可以经由任何适当的途径，例如，通过静脉、动脉内、局部、以注射、腹膜内、肋膜内、口服、皮下、肌肉内、舌下、表皮内、或直肠地而施用。它可以被配制成溶液、悬浮液、栓剂、片剂、颗粒、粉剂、胶囊、软膏、或乳霜。在这些组合物的配制中，溶剂(例如，水或生理食盐水)、溶解促进剂(例如，乙醇、聚山梨酸酯，或Cremophor EL7)、用于使稳定的试剂、防腐剂、抗氧化剂、赋型剂(例如，乳糖、淀粉、结晶的纤维素、甘露糖醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻硅酸酐，或碳酸钙)、黏结剂(例如，淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、乙基纤维素、羟基甲基纤维素，或阿拉伯胶)、润滑剂(例如，硬酯酸镁、滑石粉，或硬质子油)，或稳定剂(例如，乳糖、甘露糖醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、巨胶，或聚氧乙烯硬海狸油)有时会被添加。如果需要，甘油、二甲基醋酸胺、70％乳酸钠、表面活性剂，或基本的物质例如氢氧化钠、乙烯二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、甲基葡萄糖胺，或三氨基甲烷有时会被添加。制药的配制例如溶液、片剂、颗粒，或胶囊可以被用这些成分而形成。
一种以口服给药式(I)化合物的方法，是以给药脂质体制剂其含有脂质体和截留在其中的式(I)化合物。脂质体是由脂质双层囊，在水存在下自然地形成。脂质体可以以各种两亲媒性脂质来制造。卵磷脂是被用于制造微脂球的最普通磷脂，但其它两亲脂质，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、心磷脂、磷脂酰肌醇以及胆固醇硫酸盐也会被使用。脂质体可以使用单一型式的脂质或以组份的混合物来构成而加以备制。举胆固醇为例(或其它固醇类)是常被加到卵磷脂的脂质体组成中，以使它们在生物的液体中稳定。依据配制所使用的方法，多层及/或单层囊被形成。这些囊的直径可以是大的(0.1-100毫米)或小的(0.025-0.1毫米)。被使用在此研究项目中的多层脂质体型式，其制备是借由溶解脂质及非极性药物在有机溶剂中，然后该混合物在减压下，被干燥在玻璃囊的壁上。一水性缓冲溶液含有式(I)化合物例如，EGCG然后被加入，且该混合物被剧烈震荡以分散该脂质。对脂质因子组合物，此步骤的实施必须高于胶体-液体-结晶相转移温度。此温度依据脂质体的个别成分与在脂质体中磷脂的脂肪酸上而决定。另一方面，脂质体加载所需的化合物其制造是以溶解磷脂及化合物在溶剂中例如丙酮，然后以在溶剂中沉淀它们离析该二者的复合物例如己烷或冻干或喷干该成分。当此物质被分散在水溶液中时，脂质体复合物是被自然地形成。式(I)化合物干燥的脂质体制剂是稳定的，特别是当储存在真空及低温下。添加抗氧化剂，例如抗坏血酸或丁基酯羟基甲苯(BHT)，可以允许该制剂在室温及大气压力下储存。
不需更进一步详细阐述，相信本领域普通技术人员可以基于上述的揭露以及下面的描述，利用本发明而达到其最完整的范围。下述实施例，描述式(I)化合物合成、生物活性以及处方，将被理解为，只是说明本领域普通技术人员如何能实施本发明，且并非对所揭露的其余部份做任何的限制。任何出版物被引证在此揭露中亦合并做为参考文献。
实施例式(I)化合物由下面描述的方法制备制备N-叔丁基-N，N’-二-2，3，4-三羟基苯甲酰基酰肼将2，3，4-三羟基苯甲酸(10mmol)与亚硫酰氯(20mol)回流3小时。减压蒸馏过量的亚硫酰氯以后，2，3，4-三羟基苯甲酰氯被以蒸馏纯化。将2，3，4-三羟基苯甲酰氯(10mmol)及50％氢氧化钠(20mmol)水溶液，在冰浴上同时搅拌，同时逐滴加到分散在100毫升的1，4-二噁烷水(2∶1，v/v)中的叔丁基酰肼盐酸盐(10mmol)。在室温下搅拌2天以后，二噁烷在减压下被除去，且该残余物被以乙醚萃取。该有机相被以1N的氢氧化钠与饱和食盐水洗一次，然后以无水硫酸镁干燥。减压蒸馏乙醚得到的残余物被纯化，使用硅胶柱色层用己烷/乙酸乙酯(1∶1，v/v)纯化以得到N-叔丁基-N，N’-二-2，3，4-三羟基苯甲酰基酰肼。
制备N，N’-二-乙基-N，N’-二-2，3，4-三羟基苯甲酰基酰肼使用如上面描述的相同步骤，但将叔丁基酰肼盐酸盐被取代为二乙基酰肼二盐酸盐。
式(I)化合物的活性，(-)表棓儿茶素-3-棓酸盐(EGCG)，经使用下述物质及方法而可以发现动物。成熟的Sprague-Dawley(SD；Harlan)老鼠(雄性体重170-190克；雌性体重125-145克)与精瘦的及过胖的Zucker(查理斯河实验室)老鼠(精瘦雄性体重240-260克；过胖雄性体重420-440克)，除非指出，其给予自由进食标准老鼠食物所指定的饮食与水。动物实验草案经由芝加哥大学动物保护学会及使用委员会认可。老鼠被维持在室温25℃，在曝光周期12小时亮及12小时暗的条件下。
体内处理。EGCG以及其它的儿茶素(纯度大于98％)在我们的实验室中被从绿茶(Camellia sinensis)中离析，Liao等人描述在Biochem.Biophys.Res.Commum 214833-838(1995)中。儿茶素被溶解在水中以供口服以及在无菌的磷酸盐缓冲溶液盐水中供ip注射。在控制群的老鼠中，只接受载体。睪丸素丙酸酯(TP)及5α-二氢睪丸素丙酸酯(DHTP)被溶解在芝麻油中，以及当指出时，4毫克在0.5毫升芝麻油中(16毫克/公斤体重)每天被皮下注射。
食物的限制，雄性SD老鼠每天被给予12克的老鼠食物，大约为每一控制鼠每天消耗量的50％。体重以及食物量与水的消耗量均每天监控。食物消耗量已关在笼子里的老鼠中，以3到5只动物为一组，用每24小时秤重食物丸来监控。在最后的日子，老鼠被以甲氧氟烷麻醉，且以心脏穿刺收集血液。血清在离心(在4℃，10,000g进行20分钟)后被收集作生物化学分析。
生物化学分析。用于生物化学分析，商业上的各种放射性同位素标识免疫检定法的工具用于IGF-I与睪丸素(Diagnostic Systems Laboratory，Inc)、LH与GH(Amersham)、瘦素与胰岛素(Linco Research Inc)、以及皮质固酮(INC)与分析工具用于甘油及甘油三脂(Sigma)与脂肪酸(Roche Molecular Biochemicals)被使用。最近老鼠的组成分析由COVANCE Laboratory(Madison Wisconsin)进行。完整血液计数及血清化学(例如，胆固醇、葡萄糖，以及酶活性)由在芝加哥大学动物来源中心进行。
统计分析。数据被以平均值±标准差表达。该不成对学生的t-试验被用于检查介于控制组与EGCG注射组间的差别。变异分析及学生-新人-熟手多种范围试验被用于检验不同组的差异量。0.05概率水平被用来表示为显著。
用EGCG治疗的受治疗者体重。SD雄性与雌性老鼠经EGCG腹膜内注射经治疗2到7天内导致体重急遽减少。对于雄性SD老鼠，EGCG在体重上效果是决定于剂量。每天注射EGCG剂量5或10毫克(26及53毫克/公斤体重)在体重减少上比起15毫克(大约85毫克/公斤体重)并不会影响或仅有影响。雄性SD老鼠每天腹膜内注射26及53毫克EGCG/公斤体重，经七天治疗之后，相对于它们开始时的身体重量，获得的体重大约17-24％，但是相对于控制组减少5-9％。反的，雄性SD老鼠每天腹膜内注射85毫克EGCG/公斤体重，经治疗七天的后，它们的体重相对于它们开始时的体重减少15-21％以及相对于控制组减少30-40％。控制组老鼠继续成长，相对于它们开始时的体重，它们增加的体重大约25-34％(见表一)。雌性SD老鼠每天腹膜内注射12.5毫克EGCG(大约92毫克/公斤体重)，经七天的治疗后，相对于它们开始时的体重，它们的体重减少10％，以及相对于控制组减少29％。因此，70-92毫克/公斤体重的EGCG剂量被使用在大部分实验中。
性器官及其它器官的重量改变。EGCG的有效剂量在性器官重量上的影响也被观察到。对男性激素敏感器官的重量，例如腹面及背面的前列腺、精囊、凝结腺、以及包皮腺，经以EGCG(大约85毫克/公斤身体重量)治疗7天以后，被减少大约50-70％。在儿茶素特效药方法中，这些性器官重量被改变调整。相对于杀死的控制组动物在实验开始的时候，这些性器官(尤其是包皮腺)，在雄性SD老鼠中，经7天的EGCG治疗以后，减少大约30-50％的重量。同样地，对雌激素敏感器官的重量，例如雌性SD老鼠的子宫及卵巢，经7天的EGCG治疗以后，被减少大约50％。每一个肝脏及肾脏的重量也被减少大约20％。在雄性SD及精瘦的Zucker老鼠中，以EGCG治疗7-8天，当该脾脏重量被减少大约15-30％，每一个肝脏、肾脏及睪丸的重量被减少大约10-20％。无论如何，所述的这些器官的重量在雄性过胖的Zucker老鼠中，以EGCG治疗4天都没有改变。
性激素、瘦素、IGF-I、胰岛素、LH及GH水平的改变。被以EGCG治疗的老鼠，在各种内分泌参数中均有显著的改变。经以EGCG(大约85毫克/公斤体重)治疗7天以后，雄性老鼠睪丸素的循环被减少大约75％。同样地，在雌性经以EGCG治疗7天以后，雌性17β-雌二醇的循环水平被减少大约34％。雄性及雌性SD老鼠经7天的EGCG治疗，导致显著减少血液中瘦素、IGF-I、以及胰岛素的水平。在雄性SD老鼠血清中的睪丸素、瘦素、IGF-I、以及胰岛素水平也观察到了EGCG的剂量依存效应。如对雄性及雌性SD老鼠以EGCG治疗7天后，当它的GH在雄性中增加或在雌性中被减少时，血清中的LH水平仍旧是显著的减少(40-50％)。无论如何，GH内分泌变动的本质，阻止我们对这些老鼠中的GH循环水平改变做成明确的结论。EGCG的效果在性激素及各种缩氨酸上的调查，不是模仿比EGCG少一个羟基的ECG。
精瘦及过胖的雄性Zucker老鼠以EGCG治疗，在该血清中的睪丸素、瘦素、IGF-I、胰岛素以及GH水平与前列腺重量也显示相似的改变。对SD及Zucker老鼠两者，用每公斤体重为70-92毫克EGCG者也观察到显著的效果。
外源性雄激素的作用改变了EGCG在副性器官上的效果。为了决定在副性器官重量的减少是否由于EGCG-诱导而减少雄性激素水平，我们对雄性SD老鼠注射雄性激素及/或EGCG。我们发现EGCG并不会导致每天注射TP或DHTP的雄性老鼠的前列腺重量减少；因此，在这些老鼠中EGCG在前列腺重量上的影响似乎次于EGCG-诱导而减少睪丸素的水平。无论如何，提供雄性激素并不能防止EGCG-诱导而减少体重、食物吸收限制、减少在循环中的瘦素、IGF-I、胰岛素、以及LH、并增加在循环中的GH。
在血清营养物及邻近身体组成中的改变。经EGCG治疗的雄性SD老鼠，其血清中蛋白质、脂肪酸、以及甘油并没有改变，但血清中的葡萄糖(-32％)、瘦素(-15％)、甘油三脂(-46％)、以及胆固醇(-20％)观察到有显著减少。在精瘦及过胖的雄性Zucker老鼠中的血清营养物中也观察到相似的改变。动物邻近的组成分析显示，经每天以EGCG治疗7天后的SD老鼠，水与蛋白质含量的百分比并没有改变，而碳水化合物含量(2.5％在控制组，以及1.3％在EGCG治疗组)有中度的减少，但在脂肪含量上则有很大的减少(从控制组的4.1％到EGCG治疗组的1.4％)。雄性SD及精瘦的Zucker老鼠经EGCG治疗的7至8天内，减少皮下脂肪约40-70％及腹部脂肪约20-35％，但在附睪脂肪则无。过胖的雄性Zucker老鼠经以EGCG治疗4天内，腹部脂肪减少20％。
EGCG在食物吸收上的效果。我们发现经EGCG治疗过的雄性及雌性老鼠所消耗的食物要比控制组老鼠少大约50-60％。在食物吸收上，在过胖的雄性Zucker老鼠亦观察到相似的EGCG效果。因此，体重损失是由于食物吸收减少。因为食物限制会改变丘脑下部功能，并减少LH与性类固醇的水平，我们限制该SD雄性老鼠(没有注射EGCG)的食物吸收大约50％为期7天，经与给予自由接近食物的动物相比发现，其血液中睪丸素的水平被确实的减少大约60％，且腹面的前列腺重量被减少大约50％。血清中的瘦素、IGF-I、胰岛素、LH、以及GH在限制食物后也减少了。提供雄性激素给雄性SD老鼠并不能阻止EGCG-诱导食物吸收减少。当EGCG以口服给药为腹膜内给药时，这些EGCG的效果将被减少或失去。
血液中组成的改变。雄性SD老鼠被以EGCG及ECG治疗7天，然后它们的血清及全部血液被分析各种成分。EGCG或相对结构的ECG均不会导致在血清中的总蛋白质、白蛋白、血液尿素氮、肌酸、PO43-、Na+、K+、Ca2+、Cl-、以及酶水平的显著改变，它们显示出肝脏及其它器官的严重损坏，例如乳酸脱氢酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰基转酞酶。无论如何，在血液胆红素以及碱性磷酸酶活性物的量上观察到显著的改变。经以EGCG治疗的老鼠血液中，红血球以及血红素浓度增加大约20％，在此同时，白血球、淋巴球、以及单核白血球的浓度分别各自地减少大约10％、31％、以及24％。嗜伊红血球以及血小板浓度减少约100％。
下述实施例描述形成以及试验含EGCG脂质体制剂的步骤配制EGCG-酱油卵磷脂(PC)复合物(SPC)。7.6克PC与4.58克EGCG的悬浮物在150毫升的丙酮中被制备。在室温下混合三小时后，该溶液在真空下被浓缩至30毫升，然后以300毫升的己烷慢慢稀释。沉淀物在静置18小时以后形成，经过滤收集、真空下干燥以及在真空下于-20℃的黑暗中储存。
使用培养细胞测定EGCG-SPC的生体可用率。EGCG-SPC复合物以12毫克/毫升的浓度(相当于10mmol的EGCG)悬浮在PBS介质中。HEK293表现型式1或2人类的5α-还原酶的HEK293細胞，以浓度为50,000细胞/板，被植入于24平板上。隔天添加各种剂量的EGCG被添加，使EGCG的浓度将相当于0-100μM。一控制组的脂质体被配制，该控制组脂质全是做成将含有SPC而无EGCG，且将被试验在PC的浓度等于所使用的EGCG-SPC。一小时培养后，[14C]-睪丸素(55mci/mmol)被加入(最后浓度1μM)，且该细胞在37℃下培养1小时。然后培养基被移除，并以乙酸乙酯萃取。浓缩后，该萃取物以使用硅胶板的TLC分离，其使用的溶剂为二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(85∶15∶3)。然后该板被以分子动力激发磷光影像器/扫描仪做放射性扫描。然后该相对应于T与DHT的即时放射剂量可以被测定。该EGCG-SPC的浓度抑制5α-还原酶活性50％(IC50)活性，可以用图形定出。
EGCG-SPC对老鼠给药。
将2毫升(相当于92毫克)浓度为120毫克/毫升悬浮于PBS中的EGCG-SPC，强迫喂食一群35只(190-200克)雄性Sprague Dawley老鼠群只每一老鼠。而另一群老鼠则接受相同剂量(92毫克)在PBS中的纯EGCG做比较。在0、0.5、1、2、3、4，以及5小时时，五只老鼠先使用甲氧氟烷麻醉再以心脏穿刺抽血。血液被收集到肝素化试管，并将该血浆离心后，混合到0.1体积的20％抗坏血酸，以及-0.05％EDTA。这将降低酸碱值及螯合铁但因此也稳定EGCG。如果给药的剂量与EGCG血中浓度有线性的剂量-反应关系时，则使用不同剂量的EGCG-SPC并重复以上程序以进行测定。
分析老鼠血浆中的EGCG。
血浆在冰上被解冻，取1毫升等分试样与0.1体积的PSB或含葡萄糖酸酶(2500U)及硫酸酯酶(200U)的0.1体积PSB混合。样品在37℃下培养1小时，然后以等体积的乙酸乙酯萃取二次。该乙酸乙酯在真空下被移除，然后以等体积的乙酸乙酯萃取二次。该乙酸乙酯在真空下被移除，然后将干燥的萃取物溶解在100μl的HPLC溶液中，该溶液由乙腈/乙酸乙酯/0.05％磷酸(12∶2∶86)组成。该样品于C18分析管柱中分离，其在40℃使用等渗压洗脱，并以UV在273nm侦测。纯的EGCG被用于配制标准溶液作为EGCG在血中的定量，以比较标准物与未知物的峰高度。因为EGCG有时会以非酶，并通过在血液中非特定酯酶的活化，被分解成EGC与棓酸盐，EGCG与EGC峰将被以HPLC监控。
其它实施方案当本发明被描述在相关联的详细说明中，它可以了解到上述的详细说明描述是用于阐明而非限制本发明的范围，它被以所附的权利要求书限定。其它方面、优点、以及改进都在本发明的范围内。
权利要求
1.一种用于减少食物在受治疗者中吸收的方法，该方法包括给予受治疗者所需要的的有效量的下式化合物 其中A为烃、氧、硫、或氮；该烃选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基以及杂芳香基，其每一个被任意地以烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代；以及每一个Ra、Rb、Rc及Rd各自独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、杂芳香基、芳香基烷基、杂芳香基烷基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式的部分 其中L是-L1-L2-L3-，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R’)-、-CO-、-N(R’)-CO-、-CO-N(R’)-、-N(R’)-SO2-、-SO2-N(R’)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或删除，且每一个L1及L3，各自独立地，代表-(CR’＝CR”)n-、-(C≡C)n-、-(C(R’)(R”))n-、或删除；每一个R’及R”各自独立地代表氢、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基、氨基、硝基、氰基、卤素、或卤化烷基，且n代表1、2，或3；以及每一个R1、R2、R3、R4、及R5各自独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；条件是当A是氧或硫时，Ra及Rb两者被删除；且当A是氮时，Ra被删除；以及进一步地条件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二个为如下式的部份 其中至少二个R1、R2、R3、R4、及R5是羟基、烷氧基、或烷基羰氧基，而其互相的关系是在间或邻位；或其医药上可接受的盐类。
2.如权利要求1所述的方法，其中A为环烷基、杂环烷基、芳香基、或杂芳香基。
3.如权利要求2所述的方法，其中A为单糖类。
4.如权利要求2所述的方法，其中Ra及Rb二者皆为下式 且每一个Ra及Rb都键结到A互相邻接的环原子上。
5.如权利要求4所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-O-CO-、或删除。
6.如权利要求5所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
7.如权利要求5所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
8.如权利要求5所述的方法，其中R1、R2以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
9.如权利要求8所述的方法，其中每一个R2、R3以及R4，独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
10.如权利要求1所述的方法，其中A为烯基。
11.如权利要求10所述的方法，其中Ra及Rb二者皆为下式 且每一个Ra及Rb都键结到双键的同一边。
12.如权利要求11项所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-O-CO-、-CH2-、或删除。
13.如权利要求12所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
14.如权利要求12所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
15.如权利要求12所述的方法，其中每一个R1、R2以及R3；或是每一个R2、R3以及R4；或是每一个R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
16.如权利要求15所述的方法，其中每一个R2、R3以及R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
17.如权利要求1所述的方法，其中A为氮。
18.如权利要求17所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-CH2-、或删除。
19.如权利要求18所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
20.如权利要求19所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
21.如权利要求20所述的方法，其中每一个R1、R2以及R3；或是每一个R2、R3以及R4；或是每一个R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
22.如权利要求21所述的方法，其中每一个R2、R3以及R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
23.如权利要求1所述的方法，其中该化合物为 (EGCG)结构E
24.如权利要求1所述的方法，其中该化合物为 结构F 结构G 结构H 结构I，或 结构J
25.一种用于减少在受治疗者中的内分泌水平的方法，该方法包括给予受治疗者所需要的有效量的下式化合物 其中A为烃、氧、硫、或氮；该烃选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基以及杂芳香基，其每一个任意地被以烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代；以及每一个Ra、Rb、Rc及Rd独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、杂芳香基、芳香基烷基、杂芳香基烷基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式的部分 其中L是-L1-L2-L3，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R，)-、-CO-、-N(R’)-CO-、-CO-N(R’)-、-N(R’)-SO2-、-SO2-N(R’)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或删除，且每一个L1及L2独立地代表-(CR’＝CR”)n-、-(C≡C)n-、-(C(R’)(R”))n-、或删除；每一个R’及R”独立地代表氢、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基、氨基、硝基、氰基、卤素、或卤化烷基，且n代表1、2、或3；以及每一个R1、R2、R3、R4、及R5，独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；条件是当A是氧或硫时，Ra及Rb两者被删除；且当A是氮时，Ra被删除；以及进一步地条件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二个为如下式的部分 其中R1、R2、R3、R4、及R5中至少有二个是羟基、烷氧基或烷基羰氧基，其互相间的关系是间位或邻位；或其医药上可接受的盐类。
26.如权利要求25所述的方法，其中A为环烷基、杂环烷基、芳香基、或杂芳香基。
27.如权利要求26所述的方法，其中A为单糖类。
28.如权利要求26所述的方法，其中Ra及Rb二者皆为下式 且每一个Ra及Rb都键结到A互相邻接的环原子上。
29.如权利要求28所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-O-CO-、或删除。
30.如权利要求29所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
31.如权利要求29所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
32.如权利要求29所述的方法，其中R1、R2以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
33.如权利要求32所述的方法，其中每一个R2、R3、以及R4独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
34.如权利要求25所述的方法，其中A为烯基。
35.如权利要求34所述的方法，其中Ra及Rb二者皆为下式 且每一个Ra及Rb都键结到双键的同一边。
36.如权利要求35所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-O-CO-、-CH2-、或删除。
37.如权利要求36所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
38.如权利要求36所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
39.如权利要求36所述的方法，其中R1、R2、以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
40.如权利要求39所述的方法，其中每一个R2、R3、以及R4独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
41.如权利要求25所述的方法，其中A为氮。
42.如权利要求41所述的方法，其中L是-CO-、-N(R’)-CO-、-CH2-、或删除。
43.如权利要求42所述的方法，其中不是R1与R2就是R3与R4独立地代表羟基、烷氧基、或烷基羰氧基。
44.如权利要求43所述的方法，其中不是R1与R3就是R2与R4独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
45.如权利要求44所述的方法，其中每一个R1、R2以及R3；或是每一个R2、R3以及R4；或是每一个R3、R4以及R5，独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
46.如权利要求45所述的方法，其中每一个R2、R3以及R4独立地代表羟基、烷氧基或烷基羰氧基。
47.如权利要求25所述的方法，其中该化合物为 (EGCG)结构E
48.如权利要求25所述的方法，其中该化合物为 结构F 结构G 结构H 结构I，或 结构J
49.一种脂质体制剂，其包括脂质体和截留其中的化合物，该化合物具有下式 其中A为烃、氧、硫、或氮；该烃选自烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、以及杂芳香基，其每一个任意地被以烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基取代；以及每一个Ra、Rb、Rc、及Rd各自独立地，代表氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基、芳香基、杂芳香基、芳香基烷基、杂芳香基烷基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或下式的部分 其中L是-L1-L2-L3-，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R’)-、-CO-、-N(R’)-CO-、-CO-N(R’)-、-N(R’)-SO2-、-SO2-N(R’)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或删除，且每一个L1及L3，独立地代表-(CR’＝CR”)n-、-(C≡C)n-、-(C(R’)(R”))n-、或删除；每一个R’及R”各自独立地代表氢、烷基、烷氧基、羟基烷基、羟基、氨基、硝基、氰基、卤素、或卤化烷基，且n代表1、2、或3；以及每一个R1、R2、R3、R4、及R5独立地代表氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基、羟基烷基、羧基、卤素、卤化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；条件是当A是氧或硫时，Ra及Rb两者被删除；且当A是氮时，Ra被删除；以及进一步地条件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二个是如下式的部分 其中至少二个R1、R2、R3、R4及R5中至少有二个是羟基、烷氧基或烷基羰氧基，其互相间的关系是间位或邻位；或医药上可接受的盐类。
全文摘要
一种用于减少食物在受治疗者中吸收的方法，以及一种用于减少在受治疗者中的内分泌水平的方法。该方法包括给予受治疗者所需要的有效量的下式化合物也揭露一脂质体制剂，其包括一脂质体及一截留在其中的化合物。该被截留的化合物的化学式如上所示。
文档编号A61K31/045GK1392796SQ01800259
公开日2003年1月22日 申请日期2001年2月15日 优先权日2000年2月18日
发明者廖述宗, 理查·A·西巴卡, 高永旭 申请人:亚其发展公司