专利名称：包含肽和电解质排泄促进剂的组合物以及包含该组合物的食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含肽和电解质排泄促进剂的组合物以及包含该组合物的食品。更具体地说，本发明涉及包含肽和电解质排泄促进剂的组合物，该组合物包含一种肽或肽的混合物，该肽或肽的混合物通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到并具有抑制血管紧张素转化酶的活性；以及一种或多种选自壳聚糖、藻酸及其盐的电解质排泄促进剂。本发明还涉及包含该组合物的食品。
背景技术：
近来，在日本人们正在积极地进行健康生活的运动，目标是要改进生活方式，减少危险因素，或是减少疾病。在世界范围内人们对健康生活的意识也在提高。
特别地，在循环系统疾病方面，例如假定将日本人的血压平均降低2mmHg，那么由于脑卒中引起的死亡人数将减少约10000人，而且3500人将不必再减少日常生活中的活动(ADL)。
由于如上所述的境况，人们已经研制出各种食品，这些食品中都包含具有降血压活性的食源性蛋白肽。
例如，据报道通过用胰岛素或胃蛋白酶溶解牛乳源性酪蛋白所得到的肽或肽的混合物包括一种或多种肽或其酸加成盐，这些肽具有如下所示的序列(a)Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys(下文中有时称为“C12”)，(b)Ala-Val-Pro-Thy-Pro-Glu-Arg(下文中有时称为“Cβ7”)，(c)THr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp(下文中有时称为“C6”)；并且其对血管紧张素转化酶(下文中简写为“ACE”)具有抑制作用(参见JP-B-60-23085，JP-B-61-51562和JP-B-61-51564)；还报道了一种主要包含上述肽或肽的混合物的粗组合物(这种粗组合物也包括在本发明所述的肽中)，其具有类似的ACE阻断活性(参见JP-B-5-21092)。人们期望这种肽或肽混合物不仅在治疗高血压而且在预防高血压方面都是有用的材料(参见JP-B-4-58947，JP-A-64-9938和JP-A-1-187067)。另外，已知胃蛋白酶溶解的牛乳酪蛋白的产物具有镇静活性(JP-B-5-81220)；已知胰岛素溶解的牛乳源酪蛋白的产物具有预防高血脂的活性(参见JP-A-6-211690)或预防脑卒中的活性(参见US专利5,703,212)。
也已知的是上述的食源性肽或肽混合物通常都有很浓的苦味和/或涩味。
人们曾经通过加入各种添加剂来尽量减少或调整食源性肽或肽混合物的苦味和/或涩味。例如，JP-A-9-249694公开了一种适于口服给药的水剂，该水剂包含(a)有苦味和/或涩味的肽或肽混合物，(b)一种糖醇，(c)一种酸性香料和(d)一种李子型香料。
另一方面，已知就本发明中用到的电解质排泄促进剂而言，壳聚糖具有结合在包含于食物中的氯上以将其排出体外的活性，而藻酸或其盐具有结合在包含于食物中的钠上以将其排出体外的活性，因此，这些物质被用作制备低盐健康食品的材料。
人们已经在不同的领域对壳聚糖(β-1，4’-聚-D-葡萄糖胺)进行了研发，并将其用于多种产品。壳聚糖通过对多糖类甲壳质(β-1，4’-聚-N-乙酰基-D-葡萄糖胺)进行部分或全部去乙酰化而得到，多糖类甲壳质包括贝类或海螵蛸的壳，具有不同分子量的各种产物均有市售。藻酸是一种天然的多糖，多包含在棕色海草如海带和裙带菜海藻中。
已知壳聚糖也具有降血压作用。如JP-A-6-56674公开了一种食物添加剂，其包含壳聚糖作为一种活性成分，在促进食物中氯的排出中很有用；还公开了一种食物添加剂，其包含壳聚糖作为一种活性成分，在降血压方面很有用。然而，这种产品的降血压活性仅在阻止由于摄入高盐食品后血液中氯的增加而引起的血压升高有效，但是，摄入普通的食物后这种产品的降血压程度不能达到像摄入高盐食品后的效果。(参见Chitin-to-Chitosan Kiso-to-Yakuri(甲壳质和壳聚糖基础及药理学)，第3版，28-35页，Takumichi OKUDA，YakkyokuShinbunsha编，1997)另外，也已知藻酸是海带中的一种成分，很早以前人们已经知道海带的降血压作用。也就是说，人们认为海带的降血压作用通过藻酸与包含在摄入的食物中的钠结合并将其排出体外而表现出来。因此，由于去盐作用而表现出降血压活性，这样，就间接地预防了盐敏性高血压。
上述的任何专利出版物及文献都从未公开过包含肽或肽混合物和电解质排泄促进剂的组合物，这种肽或肽混合物通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到，并且具有对ACE的抑制活性发明内容本发明的目的是提供一种组合物，该组合物包含一种肽或肽混合物和一种或多种选自壳聚糖、藻酸或其盐的电解质排泄促进剂，这种肽或肽混合物通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到，其具有对ACE的抑制活性。该组合物具有优良的阻止高血压的活性，在改进生活方式、减少危险因素和减少疾病方面很有用。本发明还提供了包含该组合物的食品。
依据本发明人的研究，发现将通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到，并对ACE具有抑制活性的一种肽或肽混合物和一种或多种选自壳聚糖、藻酸及其盐的电解质排泄促进剂相组合，它们表现出优良的协同作用；与每一种单独的成分表现出的降血压活性相比，它们表现出强得多的抗高血压活性。依据这些新发现，完成了本发明。
附图简述
图1是一张图表，该图表显示了在原发性高血压的大鼠(SHR)体内尾动脉每周平均收缩压的变化，其中，符号○表示使大鼠摄食样品“a”进行给药的病例，符号△表示使大鼠摄食样品“b”进行给药的病例，符号●表示使大鼠摄食对比样品“c”进行给药的病例，符号▲表示使大鼠摄食对比样品“d”进行给药的病例，符号◆表示使大鼠摄食参照样品“e”进行给药的病例。
本发明的最佳实施方式本发明中用到的肽或肽混合物包括通过使用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到的具有ACE抑制活性的任何产物，并不限于特定的产物。但是优选低分子量的产物(例如分子量不超过5000的肽组份，优选分子量不超过3000的肽组份)，该产物通过用蛋白酶胰岛素溶解酪蛋白，然后将该蛋白水解产物进行部分纯化得到。
这种低分子量的肽用如下方法进行制备。
用市场上销售的胰岛素，优选高纯度的胰岛素对被广泛用作食物添加剂的酪蛋白(如牛乳源性酪蛋白、酸酪素、酪蛋白盐、皱胃酪蛋白等)进行水解。用胰岛素对酪蛋白的水解通常是通过调整酪蛋白水溶液到中性或碱性，并使该水溶液(优选具有浓度为约10重量％的蛋白质)在PH约7.5反应2-5小时来进行。该水解反应可通过在121℃加热反应液10分钟使酶失活而停止反应。反应完成后，通过离心或过滤除去不溶的部分，上清液或滤液用超滤膜(例如SEP1013，由AsahiKasei公司制造；Amikon H10P3-20，由Grace Japan制造；UFP-3-E-9A，由A/G Technology制造，等)或用凝胶渗透色谱(GPC)配体(例如Sephadex G-25，由Pharmacia制造，Sephacryl S-100HR，由Pharmacia制造；Bio-Gel P-6，由Bio-Rad实验室制造；ToyopearlHW-40，由Tasoh公司制造，等)来分离分子量为约3000-5000的肽。
这种低分子量的肽部分包含分子量不超过5000的肽，优选分子量不超过3000。具体的例子是一种或多种如前所述的选自C12、Cβ7、C6或其酸加成盐的肽或肽混合物。
上述C12、Cβ7和C6的每一种肽或主要包含以上肽中的一种的粗产物(下文中，指代为“肽粗产物”)都通过在JP-B-60-23085、JP-B-61-51562、JP-B-61-51564、JP-B-5-21092、JP-B-60-23087中公开的方法制得。
本发明中用到的电解质排泄促进剂选自壳聚糖、藻酸或其盐，这些物质都能够减少血清中的钠和氯，而血清中的钠和氯是导致血压升高的因素之一，所说的物质可单独使用或以两个或多个的混合物形式使用。
本发明中用到的壳聚糖可以是将甲壳质部分或完全脱乙酰化得到的任何产物，通过用浓碱液如40-50％的氢氧化钠水溶液对甲壳质进行热处理来得到壳聚糖，甲壳质来自蟹、虾等的壳，海螵蛸、真菌细胞。考虑到本发明的目的，优选的壳聚糖是如下文中提到的低粘度的产物。优选的壳聚糖市场有售，如Koyo壳聚糖FL-80、Koyo壳聚糖FM-80、Koyo壳聚糖FH-80、壳聚糖寡糖(全部由Koyo Chemical有限公司制造)；Kirin高分子量壳聚糖(由Kirin Brewery有限公司制造)；Kimitsu壳聚糖LL、Kimitsu壳聚糖L、Kimitsu壳聚糖M、Kimitsu壳聚糖H(全部由Kimitsu Chemical有限公司制造)KirinHigh Molecular Weight Chitosan(manufactured by Kirin BreweryCo.，Ltd)；Kimitsu Chitosan LL，Kimitsu Chitosan L，KimitsuChitosan M，Kimitsu Chitosan H(which are all manufactured byKimitsu Chemical Industry Co.，Ltd)。
这些壳聚糖可能具有不同的粘度，但优选的壳聚糖具有的平均分子量使它在0.5％的水溶液中在20℃的粘度不超过100mPa·s。更优选的壳聚糖具有的平均分子量使它在1％的水溶液中在20℃的粘度不超过15mpa·s。优选的例子是前已述及的Koyo壳聚糖FL-80。
本发明中用到的藻酸或其盐包括藻酸和藻酸盐如藻酸钠、藻酸钾、藻酸铵，它们常被用作食物添加剂。市售的产品有如Duck Acid(藻酸)，Duck Algine NSP(藻酸钠)，Duck Algine K(藻酸钾)，DuckAmmone(藻酸铵)，(这些都由Kibun Food Chemifa有限公司制造)。
本发明中包含肽和电解质排泄促进剂的组合物可能仅是一种肽或上面提及的C12或Cβ7的肽混合物与一种或多种选自壳聚糖和藻酸或其盐的电解质排泄促进剂的混合物，但其通常与常用的食用赋形剂(如结晶纤维素，蔗糖脂肪酸酯，白糖等)相混合并将混合物制成颗粒状，例如可用干法制粒或湿法制粒。
另外，可通过将组合物溶在常用的食用液态赋形剂中(如酸化剂或糖醇等)而制成液态组合物。
包含一种肽和一种电解质排泄促进剂的本发明组合物中，所包含的肽和电解质排泄促进剂的数量不同，这依赖于所用的肽和电解质排泄促进剂的种类，但肽通常的含量为10-1000重量份，优选20-500重量份，更优选20-200重量份，电解质排泄促进剂的含量为50-5000重量份，优选100-4000重量份，更优选200-2000重量份。肽和电解质排泄促进剂的比例通常是1重量份的肽对应1-500重量份，优选2-200重量份，更优选4-100重量份的电解质排泄促进剂。
本发明中的组合物或者直接使用或以食品的形式使用，用量为使它表现出所希望的降血压活性为宜。如在一个实施方案中，在一个单剂量单位的组合物中包含10mg-1000mg的肽或肽混合物以及50mg-5000mg的电解质排泄促进剂。
例如，在C12的情况下，肽或肽的混合物优选以50-200mg作为成人的每日剂量包含在组份或食物中。在本情况中，组合物或食物中可能只包含C12作为肽，但是优选包含含有它与其它肽的混合物的肽粗产物。另外，组合物或食物中包含50-500mg的壳聚糖和藻酸。
本发明的食物可以按如前所述的方法制备、以其本身的颗粒状直接使用，也可以压缩品的形式使用，该压缩品通过用压片机压缩颗粒而制得，还可以液态的形式使用。
本发明中用到的肽或肽混合物通常都有苦味和/或涩味，因此通常在通过加入常用的甜味剂来调整口味后使用，如用于上述颗粒、压缩物或液态形式的食品。
对于销售的组合物，进一步优选在颗粒或压缩物的表面包衣后使用。通常使用在日本食品添加剂标准中的包衣剂进行包衣，如甲基纤维素(例如商标名“Metrose”，由Shin-Etsu Chemical有限公司制造)、虫胶(例如商标名“Lac Graze 32E”，由Nippon Shellac有限公司制造)、对包裹食品有效的大豆多糖(例如由Fuji Oil有限公司制造的半纤维素)或玉米蛋白。
本发明的食品通常对成人每日口服给药1-3次，目的是为了抗高血压和/或预防脑卒中。
当将包含肽和电解质排泄促进剂，如一种肽和一种壳聚糖的组合物用药后，该组合物与用肽单独给药和用壳聚糖单独给药相比，表现出显著更高的对血压升高的抑制作用(参见下文中公开的实施例1)。至于藻酸，象实施例1一样进行了同样的试验，与壳聚糖一样，其在与肽结合使用时表现出显著更高的对血压升高的抑制作用。
因此，包含肽或电解质排泄促进剂的本发明组合物对于改进生活方式、减少危险因素及由高血压引起的疾病是有用的。
下文将通过实验对本发明进行更详细的说明。
实验1对患原发性高血压的大鼠血压升高的抑制作用(1)试验样品(对大鼠给药样品的制备)a)对大鼠给药的样品“a”实施例1中的组合物(40g)(包含100g肽粗产物和300g壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80)的组合物)与粉状饲料(960g)均匀混合制得对大鼠给药的样品“a”。
b)对大鼠给药的对比样品“b”肽粗产物(10g)(相当于0.625g C12)与粉状饲料(990g)均匀混合制得对大鼠给药的对比样品“b”。
c)对大鼠给药的对比样品“c”
肽粗产物(30g)(相当于1.875g C12)与粉状饲料(970g)均匀混合制得对大鼠给药的对比样品“c”。
d)对大鼠给药的对比样品“d”将壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80)(30g)与粉状饲料(970g)均匀混合制得对大鼠给药的对比样品“d”。
e)对大鼠给药的参照样品“e”粉状饲料本身被用作对大鼠给药的参照样品“e”。
(2)试验方法每组使用6只患原发性高血压的大鼠(7周大，下文中称为“SHR”)，对五组大鼠预先喂食一周粉状饲料，再分别用样品“a”，对比样品“b”到“d”以及参照样品“e”对每组大鼠给药。开始喂食后的每一周用箍尾法在没有麻醉的情况下对SHR尾动脉收缩血压进行测量，持续一个月。
(3)试验结果用样品“a”，对比样品“b”到“d”以及参照样品“e”对大鼠给药后，尾动脉的平均收缩压如图1所示。试验期间，给予受试样品和给予参照样品的各组大鼠在食入样品的量和体重方面没有显著差异。
从图1可以很清楚看到，当将含有肽和电解质排泄促进剂的组合物进行给药时，与将肽或壳聚糖单独给药的大鼠相比，可看到前者对血压升高的抑制作用明显优越。
由下面的实施例将对本发明进行更详细的说明。
实施例1将肽粗产物(100g)(在混合物中包含6.25g C12)和壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80，由Koyo化学有限公司制造)(300g)均匀混合，得到实施例2将肽粗产物(100g)(在混合物中包含6.25g C12)和藻酸(DuckAcid，由Kibun Food Chemifa有限公司制造)(300g)均匀混合，得到实施例2的组合物。
实施例3将肽粗产物(400g)(在混合物中包含25g C12)、壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80)(250g)，结晶纤维素(Avicel PH-101，Asahi Kasei公司制造)(500g)和蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W，由Dai-ichiKogyo Seiyaku有限公司制造)(25g)均匀混合，将该混合物用带有一个活塞(直径为15mm)的旋转压片机进行重压压片(每片重500mg)，将所得的片剂用冲击式制粒控制器加工以得到颗粒。所得的颗粒(1000g)与蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W)(21.3g)均匀混合，混合物用带有一个活塞(直径为8mm)的旋转压片机进行压片，得到实施例3的片剂(每片重200mg)。
实施例4用与实施3相同的方法进行制备，只是用结晶纤维素(AvicelPH-101)(480g)和羧甲基纤维素钙(ECG-505，由Gotoku化学有限公司制造)(20g)代替了结晶纤维素(Avicel PH-101)(500g)，用带有一个活塞(直径为10mm)的旋转压片机进行压片(每片重500mg)，从而制备出实施例4的片剂。
实施例5将肽粗产物(400g)(在混合物中包含25g C12)、壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80)(250g)，结晶纤维素(Avicel PH-101)(632.5g)和蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W)(34g)均匀混合，将该混合物用带有一个活塞(直径为15mm)的旋转压片机进行重压压片(每片重500mg)，将所得的片剂用冲击式制粒控制器加工以得到颗粒。所得的颗粒(1000g)与蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W)(25.4g)均匀混合，混合物用带有一个活塞(直径为9mm)的旋转压片机进行压片，得到实施例5的片剂(每片重300mg)。
实施例6将肽粗产物(400g)(在混合物中包含25g C12)、壳聚糖(Koyo壳聚糖FM-80，由Koyo化学有限公司制造)(250g)，结晶纤维素(AvicelPH-101)(557.5g)，碳酸氢钠(由Tosoh公司制造)(75g)和蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W)(34g)均匀混合，将该混合物用带有一个活塞(直径为15mm)的旋转压片机进行重压压片(每片重500mg)，将所得的片剂用冲击式制粒控制器加工以得到颗粒。所得的颗粒(1000g)与蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W)(25.4g)均匀混合，混合物用带有一个活塞(直径为9mm)的旋转压片机进行压片，得到实施例6的片剂(每片重300mg)。
实施例7用与实施例6相同的方法进行制备，只是用结晶纤维素(AvicelPH-101)(632.5g)代替了结晶纤维素(Avicel PH-101)(557.5g)和碳酸氢钠(75g)，从而制备出实施例7的片剂。
实施例8将肽粗产物(400g)(在混合物中包含25g C12)，壳聚糖(Koyo壳聚糖FM-80)(250g)和白糖(Frost Sugar FS-2，由Nisson糖类制造有限公司制造)(537.5g)的混合物用90％的乙醇水溶液作为粘合剂用一般的搅拌器制粒，并在流体床制粒机上干燥，接着通过一个18目的筛而得到颗粒。将该颗粒(940g)与蔗糖脂肪酸酯(DK EsterF-20W)(20g)均匀混合，混合物用带有一个活塞(直径为8mm)的旋转压片机进行压片，得到实施例8的片剂(每片重200mg)。
实施例9将虫胶溶于95％的乙醇水溶液中制成含10重量％虫胶的水溶液，用作包衣液。
将实施例3中制备的片剂放入平底包衣机中，将上述包衣液喷在片剂上，将所得的片剂干燥而得到实施例9的包衣片。
实施例10将含有8重量％甲基纤维素和2重量％甘油的水溶液用作包衣液。
将实施例4中制备的片剂放入平底包衣机中，将上述包衣液喷在片剂上，将所得的片剂干燥而得到实施例10的包衣片。
实施例11将含有9重量％大豆多糖和2重量％甘油的10％的乙醇水溶液用作包衣液。
将实施例5中制备的片剂放入平底包衣机中，将上述包衣液喷在片剂上，将所得的片剂干燥而得到实施例11的包衣片。
实施例12将玉米蛋白溶于70％的乙醇水溶液中制备含有5重量％玉米蛋白的水溶液，用作包衣液。
将实施例6中制备的片剂放入平底包衣机中，将上述包衣液喷在片剂上，将所得的片剂干燥而得到实施例12的包衣片。
实施例13将肽粗产物(400g)(在混合物中包含25g C12)和藻酸(DuckAcid)(250g)，结晶纤维素(Avicel PH-101)(500g)，和蔗糖脂肪酸酯(DK Ester F-20W，由Dai-ichi Kogyo Seiyaku有限公司制造)(50g)均匀混合，将该混合物用带有一个活塞(直径为7mm)的旋转压片机进行压片，得到实施例13的片剂(每片重200mg)。
实施例14将肽粗产物(41g)(在混合物中包含2.5g C12)，壳聚糖(Koyo壳聚糖FL-80)和酸化剂(50g)加热溶于纯化的水中(5kg)，向其中加入天冬氨酸(由Tanabe Seiyaku有限公司制造)(10g)，甜味剂(1.8g)，糖醇(50g)，再加入适量的纯净水以溶解上述物质。冷却后，向混合物中加入香料(15g)，再加入纯净水使总重量达到10Kg。将这样制得的溶液装入容器中(每个装有200g)即得实施例14的饮品。
工业应用依据本发明，通过将用蛋白激酶溶解食源性蛋白干酪素而得到的低分子量肽或肽混合物与选自一种或多种壳聚糖，藻酸及其盐的电解质排泄促进剂结合而得到一种组合物或食品，其在对人体给药时，由于各个组分的协同作用而表现出优良的抑制血压升高活性。因此，为了保证健康的生活，该组合物和食品可每日使用，尤其适用于容易出现高血压的老人。
权利要求
1.一种组合物，其包含通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到并具有抑制血管紧张素转化酶活性的肽或肽混合物，和一种或多种选自壳聚糖、藻酸或其盐的电解质排泄促进剂。
2.权利要求1的组合物，其中食源性蛋白为牛乳源性蛋白。
3.权利要求1的组合物，其中通过用蛋白酶溶解牛乳源性蛋白而得到的肽或肽混合物是具有分子量不超过5000的肽或低分子量肽的混合物，它们通过用胰岛素溶解酪蛋白并除去高分子量肽组分而得到。
4.权利要求3的组合物，其中低分子量肽是分子量不超过3000的肽或其混合物。
5.权利要求1的组合物，其中肽或肽混合物是一种或多种选自具有如下序列的肽(a)Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys，(b)Ala-Val-Pro-Thy-Pro-Glu-Arg，和(c)Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp，或其酸加成盐，或上述肽的混合物。
6.权利要求1-5任一项的组合物，其中的壳聚糖具有的平均分子量使其在0.5％的水溶液中在20℃的粘度不超过100mPa·s。
7.权利要求1-6任一项的组合物，其中藻酸是一种或多种选自藻酸、藻酸钾、藻酸铵、藻酸钠的成分。
8.一种加入了权利要求1-7任一项所说的包含肽和电解质排泄促进剂的组合物的食品。
9.权利要求8的食品，其是压制品的形式。
10.权利要求8的食品，其是液态产品的形式。
11.权利要求9的食品，其表面进行了包衣。
全文摘要
一种包含肽和电解质排泄促进剂的组合物，该组合物包含一种肽或肽的混合物，该肽或肽混合物通过用蛋白酶溶解食源性蛋白而得到并具有抑制血管紧张素转化酶的活性；以及一种或多种选自壳聚糖、藻酸或其盐的电解质排泄促进剂。本发明还涉及包含该组合物的食品。所说的组合物通过两种成分的协同作用而显示出优良的抑制血压升高的活性。
文档编号A61K38/01GK1431870SQ01809291
公开日2003年7月23日 申请日期2001年5月8日 优先权日2000年5月11日
发明者高桥隆二, 与茂田敏 申请人:钟纺株式会社