专利名称：具有免疫调制活性的吡唑并喹啉的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的杂环化合物、它们的制备方法、含有它们的组合物、以及临床治疗可受益于免疫调制的医学病症，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘、移植、全身性红斑狼疮和牛皮癣的方法和用途。更具体而言，本发明涉及新的杂环化合物，其是能够抑制CD80与CD28间相互作用的CD80拮抗剂。
背景技术：
免疫系统具有在免疫反应过程中和免疫反应后，通过各种调节机理控制淋巴细胞的激活与灭活之间内环境稳定的能力。其中有特异性抑制和/或切断免疫反应的机理。因此，当由MHC分子把抗原呈递给T-细胞受体时，T-细胞仅在有其它共同-刺激信号存在的条件下被适当激活。在没有辅助信号存在的条件下，没有淋巴细胞激活且诱导被称作无变应性或耐受性的任一功能灭活状态，或T-细胞由于编程性细胞死亡而被特异性缺失。其中一个这种共同-刺激信号包括专门的抗原-呈递细胞上的CD80与T-细胞上的CD28的相互作用，其已被证实对于完全的T-细胞激活是很重要的(Lenschow等人，(1996)Annu.Rev.Immunol.，14，233-258)。
Erbe等人在J.Biol.Chem.Vol.277，No.9，pp 7363-7368(2002)中的文章描述了3种结合CD80的小分子配体，并可抑制CD80与CD28和CTLA4的结合。在所公开的配体中，有2种是结构A和B的稠合吡唑酮
发明概述根据本发明，提供一种通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐 其中R1和R3独立地代表H、F、Cl、Br、-NO2、-CN、被F或Cl任选取代的C1-C6烷基、或被F任选取代的C1-C6烷氧基；R2代表H、或任选取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基或任选取代的苯基；Y代表-O-、-S-、N-氧化物、或-N(R5)-，其中R5代表H或C1-C6烷基；X代表价键或二价C1-C6亚烷基；
R4代表-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NHR6或-NHC(＝S)NHR6其中R6代表H、或通式-(Alk)b-Q的基团，其中b为0或1且Alk是任选取代的二价直链或支链C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基或C2-C12亚炔基，其可被一个或多个不相邻的-O-、-S-或-N(R8)-基团中断，其中R8代表H或C1-C4烷基、C3-C4烯基、C3-C4炔基、或C3-C6环烷基，且Q代表H、-CF3、-OH、-SH、其中各R8可相同或不同的-NR8R8、酯基团、或任选取代的苯基、C3-C7环烷基、C5-C7环烯基或具有5-8个环原子的杂环；且R7代表H或C1-C6烷基、或当与和它们相连的原子连接在一起时，R6和R7形成具有5-8个环原子的任选取代的杂环。
通式(I)的化合物是CD80拮抗剂。它们可抑制CD80与CD28间的相互作用并因此激活T细胞，从而调制免疫反应。
因此本发明还包括(i)通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐用于治疗受益于免疫调制的病症的用途。
(ii)通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐用于制备治疗受益于免疫调制的病症的药剂的用途。
(iii)一种在人类和除人类以外的灵长类动物中进行免疫调制的方法，包括给予需要这种治疗的受治疗者免疫调制有效剂量的通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐。
(iv)一种包含通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐以及药学或兽医学可接受的赋形剂或载体的药物或兽用组合物。
受益于免疫调制的病症包括肾上腺机能不全变应性脉管炎和肉芽肿病淀粉样变关节强硬性脊椎炎哮喘自身免疫性阿狄森氏病自身免疫性脱发自身免疫性慢性活动性肝炎自身免疫性溶血性贫血自身免疫性嗜中性白细胞减少症自身免疫性血小板减少性紫癜自身免疫性血管炎贝切特氏病小脑退化慢性活动性肝炎慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病疱疹样皮炎糖尿病伊-兰肌无力综合征脑脊髓炎大疱性表皮松解结节性红斑Gluten-过敏性肠病古德帕斯彻氏综合征移植物抗宿主疾病格-巴二氏综合征桥本氏甲状腺炎甲状腺功能亢进特发性血色素沉着特发性膜性肾小球性肾炎最小改变性肾病混合型结缔组织病多灶性运动神经病发性硬化重症肌无力视性眼痉挛-肌痉挛综合征类天疱疮天疱疮恶性贫血结节性多动脉炎多肌炎/皮肤肌炎感染后关节炎原发性胆硬化牛皮癣反应性关节炎莱特尔氏病视网膜病类风湿性关节炎硬化性胆管炎斯耶格伦氏综合征Stiff-man综合征亚急性甲状腺炎全身性红斑狼疮全身性硬化(硬皮病)颞动脉炎闭塞式血栓脉管炎移植排斥I型和II型自身免疫性多腺综合征溃疡性结膜炎眼色素层炎韦格内氏肉芽肿病此处所用术语“亚烷基”是指具有两个不饱和化合价的直链或支链的烷基链，例如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH(CH2CH3)CH2CH2CH3-、和-C(CH3)3。
此处所用的术语“杂环芳基”是指含有一个或多个杂原子的5-或6-元芳环。这种基团的举例是噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基。
此处所用的非限定术语“杂环基”或“杂环的”包括上面定义的“杂芳基”，且特别是指含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的5-8元芳香或非-芳香杂环，包括例如，吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、吗啉基、苯并呋喃基、吡喃基、异噁唑基、奎宁环基、氮杂-双环[3.2.1]辛基、苯并咪唑基、亚甲二氧苯基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基。
除非另有说明，本文中出现的、用于此处任何部分的术语“取代的”是指用一个或多个下列取代基取代，即(C1-C6)烷基、三氟甲基、(C1-C6)烷氧基(包括其中环在相邻环的C原子上被亚甲二氧基或亚乙二氧基取代的特殊情况)、三氟甲氧基、(C1-C6)烷基硫代、苯基、苯甲基、苯氧基、(C3-C8)环烷基、羟基、巯基、氨基、氟、氯、溴、氰基、硝基、氧代、-COOH、-SO2OH、-CONH2、-SO2NH2、-CORA、-COORA、-SO2ORA、-NHCORA、-NHSO2RA、-CONHRA、-SO2NHRA、-NHRA、-NRARB、-CONRARB或-SO2NRARB，其中RA和RB独立地是(C1-C6)烷基。在其中“取代的”是指被(C3-C8)环烷基、苯基、苯甲基或苯氧基取代的情况下，其环本身可被除(C3-C8)环烷基、苯基、苯甲基或苯氧基外的前述任何一个取代。
此处所用的非限定术语“碳环基”或“碳环的”是指环原子全部是碳的5-8元环。
本发明某些化合物由于不对称碳原子的存在而含有一个或多个手性中心。不对称碳原子的存在可产生在每个手性中心具有R或S立体化学的立体异构体或非对映异构体。
形成本发明化合物盐的盐包括生理可接受的酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐和马来酸盐；及碱加成盐，例如钠、钾、镁、和钙盐。当化合物含有氨基时，季氨盐也是可取的，且包括在本发明内。
在本发明的化合物中，下列是若干结构变量的例子R1可以是，例如H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。目前，优选R1是H、Cl或特别是F；R2可以是，例如H、甲基、甲氧基、环丙基、苯基、或氟-、氯-、甲基、或甲氧基取代的苯基。H或环丙基目前是优选的；R3可以是，例如，H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。目前优选R3是F或Cl，且最优选R3是H；Y可以是，例如，-O-、-S-、或-N(R5)-其中R5代表H或甲基。-NH-或-S-目前是优选的。
X可以是，例如，价键、或-CH2-或-CH2CH2-基团。目前优选价键。
R4代表-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NHR6、或-NHC(＝S)NHR6。这些之中，-NR7C(＝O)R6，且特别是-C(＝O)NR6R7和-NHC(＝O)NHR6目前是优选的。R7优选H，但R6取代基的宽范围可产生十分有效的本发明化合物。许多举例性R6取代基在下面实施例的化合物中出现。
R6可以是，例如H或通式-Alkb-Q的基团，其中b为0或1且Alk可以是，例如，-(CH2)n-、-CH((CH2)mCH3)(CH2)n-、-C((CH2)mCH3)((CH2)pCH3)(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-、-(CH2)n-NH-(CH2)m-、或-(CH2)n-NH-(CH2)m-NH-(CH2)p-基团其中n为1、2、3或4且m和p独立地为0、1、2、3或4，且Q可代表H、-OH、-COOCH3、苯基、环丙基、环戊基、环己基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、或噁唑基；且R7可以是，例如H，或当与和它们相连的原子连接在一起时，R6和R7可形成5、6或7元杂环。
R4基团的具体例子包括在此处实施例的化合物中给出的那些。
本发明的化合物可通过文献中已知的合成方法自商业得到的或很容易商业得到的化合物制备。例如，其中R4是基团-NR7C(＝O)R6的通式(I)化合物可通过用通式(III)的酰基氯使通式(II)的胺酰化而制备 其中R4是基团-NHC(＝O)NHR6的本发明化合物可通过使通式(IIA)的胺与通式(IIIA)的异氰酸酯反应而制备 O＝C＝NR6(IIIA)其中R4是基团-C(＝O)NHR6的本发明化合物可通过使通式(IIB)的酰基氯与胺NHR6R7反应而制备
其中R4是基团-NR7C(＝O)OR6的本发明化合物可通过使通式(II)的胺与氯甲酸酯ClC(＝O)OR6反应而制备。
下列实施例举例说明本发明化合物的制备中间体1的制备2-(4-硝苯基)-6-氟-2，5-二氢吡唑并[4，3-c]-喹啉-3-酮 室温下，将部分4-硝苯肼(2.28g，0.014mol)加入到4-氯-8-氟-喹啉-3-羧酸乙酯(3.58g，0.014mol)溶于无水正-丁醇(50ml)的搅拌溶液中。在氮气条件下，使该混合物回流16小时，冷却至室温，然后过滤，剩下橙色固体。通过用醋酸乙酯(20ml)和庚烷(20ml)顺序洗涤而纯化该固体，然后抽吸干燥，得到深橙色固体吡唑酮(3.93g，87％)，LCMS m/z325.24[M+H]+@RT1.47分。
中间钛2的制备2-(4-氨苯基)-6-氟-2，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮 室温下，将部分氯化锡(II)二水合物(12.5g，0.055mol)加入到2-(4-硝基-苯基)-6-氟-2，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮(中间体1)(3.59g，0.011mol)溶于乙醇(110ml)的搅拌溶液中。然后加热该混合物至80℃共8小时，冷却至室温并过滤，剩下黄色固体。将该固体混悬于醋酸乙酯的二相溶液(1L)中，即罗谢尔盐饱和溶液(500ml)和碳酸氢钠饱和溶液(500ml)，室温搅拌2小时。过滤该混合物并用水洗涤剩余的固体，真空干燥得到嫩黄色固体的标题化合物(3.39g，99％)，LCMS m/z295.30[M+H]+@RT0.84分。
实施例1N-[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-2-甲基-丁酰胺 室温下，在30秒内，将(±)-2-甲丁酰氯(13.6μl，0.11mmol)滴加到2-(4-氨基-苯基)-6-氟-2，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮(中间体2)(30mg，0.10mmol)、三乙胺(14μl，0.11mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.4mg，0.02mmol)溶于二氯甲烷(1ml)的搅拌溶液中。室温搅拌该混合物16小时。然后滤出黄色固体并通过用碳酸氢钠饱和溶液(1ml)、醋酸乙酯(1ml)和乙醇(0.5ml顺序洗涤而纯化，最后抽吸干燥得到嫩黄色固体的标题化合物(10mg，26％)，LCMS m/z 379.36[M+H]+@RT1.18min.δH(400MHz，(CD3)2SO)9.89(1H，s)，8.52(1H，s)，8.15(2H，d J9.0Hz)，8.01(1H，d J 7.0Hz)，7.69(2H，d J 9.0Hz)7.57-7.46(2H，m)，2.46-2.39(1H，m)，1.69-1.36(2H，m)，1.11(3H，d J 6.8Hz)，0.91(3H，t J 7.3Hz).
在下面测定部分描述的测定法中测试标题化合物，以及后面实施例的化合物，以测定它们作为CD80-CD28相互反应的抑制剂的活性。本发明标题化合物具有***的活性等级。
实施例2-49下列化合物是通过实施例1描述的路径合成的，其中用适宜的酰基氯取代(±)-2-甲丁酰氯实施例22-甲基-戊酸[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-酰胺 δH(400MHz，(CD3)2SO)9.92(1H，s)，8.53(1H，s)，8.12(2H，d J 9.2Hz)，8.05(1H，d J 7.6Hz)，7.70(2H，dJ 9.2Hz)，7.63-7.53 2H，m)，1.68-1.58(1H，m)，1.38-1.28(3H，m)，1.11(3H，d J 6.6Hz)，0.91(3H，t J 7.1Hz).
活性***实施例31-甲基-1H-吡咯-2-羧酸[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-酰胺
δH(400MHz，(CD3)2SO)9.76(1H，s)，8.50(1H，s)，8.26(2H，d 9.0Hz)，7.97-7.94(1H，m)，7.73(2H，d J 9.0Hz)，7.39-7.28(2H，m)，7.07-7.01(2H，m)，3.91(3H，s).
活性*实施例4N-[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-3-甲基-丁酰胺 δH(400MHz，(CD3)2SO)9.92(1H，s)，8.52(1H，s)，8.14(2H，d J 9.2Hz)，8.01(1H，d J 7.3Hz)，7.67(2H，d J 9.2Hz)，7.57-7.47(2H，m)，2.21(2H，d J 6.8Hz)，2.14-2.07(1H，m)，0.96(6H，d J 6.6Hz).
活性**实施例52-丙基-戊酸[4-(6-氟-3-氧-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-酰胺
δH(400MHz，(CD3)2SO)9.93(1H，s)，8.53(1H，s)，8.11(2H，d J 9.0Hz)，8.05(1H，d J 7.8Hz)，7.70(2H，dJ 9.0Hz)，7.59-7.46(2H，m)，2.46-2.35(1H，m)，1.63-1.27(4H，m)，0.90(6H，t J 7.1Hz).
活性*实施例65-[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)苯基氨基甲酰基]-戊酸甲酯 δH(400MHz，(CD3)2SO)9.85(1H，s)，8.47(1H，s)，8.25(2H，d J 9.0Hz)，7.91-7.90(1H，m)，7.59(2H，d J9.0Hz)，7.29-7.20(2H，m)，3.61(3H，s)，2.38-2.28(4H，m)，1.64-1.50(4H，m).
活性***
实施例7N-[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯基]-2，2-二甲基-丙酰胺 δH(400MHz，(CD3)2SO)9.26(1H，s)，8.52(1H，s)，8.15(2H，d J 9.2Hz)，8.03(1H，d J 8.8Hz)，7.71(2H，dJ 9.2Hz)，7.56-7.47(2H，n)，1.26(9H，s).
活性**实施例8-28也是使用适宜的酰基氯通过实施例1的方法制备的
中间体3的制备3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸 室温下，将部分3-肼苯甲酸(1.91g，0.013mol)加入到4-氯-8-氟-喹啉-3-羧酸乙酯(2.93g，0.011mol)溶于正-丁醇(60ml)的搅拌溶液中。将该溶液加热回流16小时，冷却至室温并滤出所得黄色固体，用叔-丁基甲醚洗涤，然后干燥。将该固体再次溶于四氢呋喃∶水(2∶1；21ml)的溶液中，然后加入氢氧化锂(1.27g，0.031mol)。室温搅拌16小时后，向混合物中滴加浓盐酸(3ml)，沉淀出黄色固体，将其滤出并真空干燥，得到嫩黄色固体的标题化合物(中间体3)(2.32g，63％)。
中间体4的制备3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯 室温下，在2分钟内，将草酰氯(20ml，0.2mol)滴加在3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸(中间体3)(2.0g，6.1mmol)溶于二氯甲烷(10ml)的搅拌溶液中。然后加入N，N-二甲基甲酰胺(50μl)并加热所得混合至50℃共1小时。然后将该溶液冷却至室温并真空浓缩，剩下淡棕色固体的标题化合物(中间体4)(2.0g，96％)。
实施例503-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-N-(3-甲氧基-丙基)-苯甲酰胺
将3-甲氧基丙胺(0.026g，0.29mmol)加入到3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯(中间体4)(26mg，0.29mmol)溶于四氢呋喃(2ml)的搅拌溶液中，并室温下搅拌该混合物15分钟。然后加入三乙胺(0.2ml，1.4mmol)并搅拌所得混合物过夜。滴加1M盐酸(3-4ml)，沉淀出黄色固体，过滤并抽吸干燥，得到黄色固体酰胺(79mg，0.20mmol)，LCMS m/z395.25[M+H]+@RT1.04min；δH(400MHz，(CD3)2SO)8.59(1H，m)，8.57(1H，s)，8.39(1H，app d J 9.3Hz)，8.08(1H，app d J 7.3Hz)，7.66-7.53(5H，m)，3.37-3.33(4H，m)，3.27(3H，s)，1.83-1.77(2H，m).
活性**实施例51N-乙基-3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]-喹啉-2-基)-苯甲酰胺 通过实施例53的方法，用乙胺取代3-甲氧基丙胺而制备。
δH(400MHz，(CD3)2SO)主要转子记录(major rotomer quoted)；8.56(1H，br s)，8.47(1H，m)，8.21(2H，d J 8.5Hz)，7.94(2H，d J 8.5Hz)，3.96(3H，s)，3.31(2H，q J 7.3Hz)，2.58(3H，s)，1.15(3H，t J 7.4Hz)活性**
实施例52N-苯甲基-3-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺 通过实施例53的方法，用苯甲胺取代3-甲氧基丙胺而制备。
LCMS m/z 427.16[M+H]+@RT1.28分活性*实施例53-64是使用适宜的胺，通过实施例50的方法制备的。
实施例65N-(3-二甲氨基丙基)-4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺步骤12-环丙基-4-氧代-1，4-二氧-喹啉-3-羧酸乙酯 将3-环丙基-3-氧代-丙酸甲酯(6.2g，0.038mol)、2-氨基苯甲酸乙酯(4.95g，0.03mol)和对-甲苯磺酸(0.04g，0.2mmol)溶于甲苯(25ml)的溶液125℃加热2小时；然后蒸馏15ml溶剂。将乙醇钠(2M，15ml)的乙醇溶液加入到残余的橙色溶液中(反应混合物变红)。120℃下搅拌该红色混合物2小时；再次蒸馏15ml溶剂。将反应混合物冷却至室温，用醋酸乙酯(1升)稀释，用0.1M HCl和水萃取。在硫酸钠上干燥结合的有机萃取物，并真空浓缩，剩下橙色残渣，用冷醋酸乙酯洗涤，得到黄白色固体的2-环丙基-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(3.87g，53％)。LCMSm/z 244.14[M+H]+@RT0.78分，89％，m/z 230.11[酸+H]+@RT1.27，11％。
δH(400MHz，(CD3)2SO)11.04(1H，s)，8.06(1H，dd，J11.1，J28.1)，7.76-7.66(2H，m)，7.36(1H，td，J11.1，J27.5)，3.89(3H，s)，2.16(1H，m)，1.18(4H，d，J7.0).
步骤24-氯-2-环丙基-喹啉-3-羧酸乙酯
将部分磷酰氯(0.77ml，0.082mol)加入到2-环丙基-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-羧酸乙酯(1.0g，0.041mol)溶于乙腈的混悬液中，并在75℃下加热该混合物90分钟(高于65℃时变为澄明的溶液)。将所得浅棕色溶液注入到饱和碳酸氢钠(100ml)中；用醋酸乙酯萃取该混悬液并干燥结合的有机萃取物，真空浓缩，剩下黄白色固体的4-氯-2-环丙基-喹啉-3-羧酸乙酯(1.15g，106％)。Rf(AcOEt)＝0.73步骤34-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸 将4-氯-2-环丙基-喹啉-3-羧酸乙酯(1.15g，0.0041mol)和4-肼基-苯甲酸(1.0g，0.0068mol)在乙醇(30ml)中回流搅拌16小时。用庚烷稀释该浅黄色混悬液，过滤，用冷叔-丁基甲醚洗涤，并抽吸干燥，得到含肼的粗固体。将该固体混悬于1M HCl中，过滤，用水洗涤，然后真空干燥，得到黄色固体4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸(1.135g，80％)，LCMS m/z 346.20[M+H]+@RT1.05分96％纯度。
δH(400MHz，(CD3)2SO) 11.4(1H，s)，8.43(2H，d，J8.1)，8.21(1H，dd，J11.2，J28.1)，8.07(2H，d，J8.1)，7.92(1H，d，J 8.1)，7.67(1H，t，J 6.6)，7.52(1H，t，J 6.5)，3.43(1H，m)，1.59(2H，m)，1.43(2H，m).
步骤44-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]-喹啉-2-基)-苯甲酰氯 将草酰氯(1.6ml，0.01mol)加入到精细研磨的4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸(0.19g，0.55mmol)溶于二氯甲烷(4ml)的混悬液中，接着滴加二甲基甲酰胺。在氮气、45℃条件下搅拌该混合物8小时。真空除去溶剂，得到淡黄色固体4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基]-苯甲酰氯，LCMS m/z[M+MeOH-Cl]+@RT1.46分95％纯度。没有进一步纯化使用。
步骤5N-(3-二甲氨基丙基)-4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺
在氮气条件下，向部分4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯(0.1g，0.28mmol)溶于四氢呋喃(6ml)的溶液中加入3-二甲氨基-丙胺(0.03g，0.3mmol)溶于四氢呋喃(3ml)的溶液。RT搅拌该混合物3小时。减压除去溶剂并用少量饱和碳酸氢钠、水洗涤黄色固体，真空干燥得到黄色固体N-(3-二甲氨基丙基)-4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]-喹啉-2-基)-苯甲酰胺(57mg，47％)。LCMS m/z 430.11[M+H]+@RT0.99分100％纯度。
活性***中间体5的制备4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯
向精细研磨的4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酸(1.1g，3.4mmol)溶于二氯甲烷(6ml)的混悬液中加入草酰氯(2.4ml，29mmol)，接着滴加二甲基甲酰胺。在氮气、45℃条件下搅拌该混合物3小时。真空除去溶剂得到浅黄色固体4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯(1.15g，定量的)，无需进一步纯化使用。
实施例66N-(3-二甲氨基丙基)-4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺盐酸盐 在氮气条件下，向4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰氯(0.1g，0.3mmol)溶于四氢呋喃(5ml)的部分溶液中加入3-二甲氨基-丙胺(0.03g，0.3mmol)溶于四氢呋喃的溶液。室温搅拌该混合物90分钟。减压除去溶剂并经由FCC硅胶(梯度洗脱，MeOH∶H2O，FlukaC18反相)纯化黄色固体，得到黄色固体N-(3-二甲氨基丙基)-4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺盐酸盐(70mg，53％)。
LCMS m/z 408.39[M+H]+@RT0.89分90％纯度活性***
实施例67-141是自适宜的苯甲酰氯和适宜的胺类似制备的。
实施例142{3-[4-(6-氟-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]-喹啉-2-基)-苯基]-脲基}醋酸乙酯 将部分氰酰乙酸乙酯(31mg，0.24mmol)加入到2-(4-氨苯基)-6-氟-2，5-二氢吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮(中间体2)(50mg，0.17mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(2ml)的搅拌溶液中，室温搅拌该混合物16小时。然后向该混合物中加水(1ml)，使固体沉淀，过滤，用水(1ml)和醋酸乙酯(1ml)洗涤，最后抽吸干燥，剩下黄色固体的脲，LCMS m/z 424.40[M+H]+@RT1.06分。
活性***实施例143和144 实施例143实施例144LCMS m/z 438.41[M+H]+@RT 1.13分LCMS m/z 514.46[M+H]+@RT 1.35分活性**活性*下列化合物是通过实施例142的方法，用适宜的异氰酸盐、异硫氰酸盐或氯甲酸盐取代氰酰醋酸乙酯而合成的。
中间体6甲基4-氧代二氢苯并噻喃-3-羧酸盐的制备 在氮气下下冷却无水四氢呋喃(60ml)至-50--60℃。加入1M双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂溶于己烷(56ml，56mmol)的溶液。温度保持在-50--60℃，在20分钟内滴加二氢苯并噻喃-4-酮。低温下继续搅拌60分钟。在5分钟内向反应混合物中滴加氰基甲酸甲酯(4.84ml，60.9mmol)。-50--60℃搅拌所得混悬液80分钟，然后温热至室温。加入饱和氯化铵溶液(100ml)。分离各相，用醋酸乙酯(2×100ml)萃取水相。用水(50ml)洗涤结合的有机相，在硫酸镁上干燥，过滤并真空浓缩。得到橙色的油并通过柱色谱纯化。分离出黄色固体的标题化合物(4.70g，21.1mmol，42％)。LCMSm/z 221[M-H]+。
中间体74-(3-氧代-3a，4-二氢-3H-二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)-苯甲酸 将4-氧代二氢苯并噻喃-3-羧酸盐(0.50g，2.25mmol)和肼基苯甲酸(0.377g，2.48mmol)在醋酸(6ml)中混合。回流加热该混合物30分钟。蒸馏掉过量的醋酸，得到棕色的油。加入二乙醚，通过过滤并在真空下干燥收集所形成的沉淀物。分离出红/棕色固体的粗产物(797mg)。LCMSm/z 325[M+H]+。没有进行纯化。
中间体84-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酸的制备 将粗4-(3-氧代-3a，4-二氢-3H-二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)-苯甲酸(250mg，0.77mmol)溶于二甲基亚砜(6ml)中。加入O-氯醌(189mg，0.77mmol)，并在室温下搅拌该混合物过夜。加水(20ml)并过滤收集固体，用水洗涤。用甲苯研磨滤饼，过滤并真空干燥。分离出深棕色固体的标题化合物(230mg，0.71mmol，92％)。LCMSm/z 323[M+H]+可选择性地，可在与空气接触的条件下，在二甲基亚砜中搅拌粗4-(3-氧代-3a，4-二氢-3H-二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2-基)-苯甲酸。发现空气氧化可提供干净的产物，然而反应更慢。
实施例165N-[3-(二甲氨基)丙基]-4-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备
将4-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酸(55mg，0.17mmol)混悬于无水二甲基乙酰胺(1ml)中。加入二异丙基-乙胺(46.5mg，0.36mmol，62μl)，接着加入3-二甲氨基丙胺(17.5mg，0.17mmol)和[(苯并三唑-1-氧基)-二甲氨基-亚甲基]-二甲基-六氟磷酸铵(65mg，0.17mmol)。室温搅拌该混合物4小时，并通过制备型HPLC纯化。分离出棕色固体的标题化合物。LCMSm/z 407[M+H]+活性**实施例166N-[(环己氨基)丙基]-4-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备
如上所述进行反应。LCMSm/z 461[M+H]+活性***实施例167N-(吡咯烷-1-基-丁基)-4-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备 如上所述进行反应。LCMSm/z 447[M+H]+活性*实施例1684-(3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)-N-1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基苯甲酰胺的制备
如上所述进行反应。LCMSm/z 475[M+H]+活性**中间体93-[(2-氟苯基)硫烷基]丙酸的制备 在氮气条件下，将2-氟硫苯酚(5.0g，39mmol)溶于四氢呋喃(50ml)中。加入三乙胺(3.94g，5.33ml，85.8mmol)。室温下，将丙烯酸(2.81g，2.67ml，39mmol)溶于四氢呋喃中，并在2小时内滴加到反应溶液中。室温搅拌该混合物过夜。加入1M盐酸(50ml)并分离各相。用醋酸乙酯(2×50ml)洗涤水相。在硫酸镁上干燥结合的有机相，过滤并真空浓缩。获得黄色的油，其在室温下贮藏后固化。用己烷研磨固体，过滤并真空干燥。分离出黄白色固体的标题化合物(4.19g，20.9mmol，54％)。
中间体108-氟-2，3-二氢-4H-二氢苯并噻喃-4-酮的制备 0-5℃下，将3-[(2-氟苯基)硫烷基]丙酸(4.0g，20mmol)与浓硫酸(20ml)混合。在0-5℃下搅拌反应溶液3小时，然后温热至室温过夜。将混合物滴加到冰中骤冷，得到白色混悬液。用醋酸乙酯(1×200ml，1×100ml)萃取水相。用饱和碳酸氢钠溶液(1×50ml)、水(1×50ml)、1M盐酸(50ml)和水(2×50ml)洗涤结合的有机相。将有机相在硫酸镁上干燥，过滤并真空浓缩。分离出黄色固体的标题化合物(2.10g，11.5mmol，58％)。
中间体11甲基8-氟-4-氧代二氢苯并噻喃-3-羧酸酯的制备 在氮气条件下，将1M六甲基二硅杂叠氮(silazide)锂的己烷溶液(13.2ml)溶于无水四氢呋喃(20ml)中。将溶液冷却至-78℃。将8-氟-2，3-二氢-4H-二氢苯并噻喃-4-酮(2.00g，11mmol)溶于四氢呋喃(40ml)中，将溶液转移到滴液漏斗中，并在30分钟内滴加到维持在低于-60℃的反应混合物中。在-78℃至-65℃下搅拌2小时得到橙色的澄明溶液。将氰基甲酸甲酯(0.935g，0.87ml)溶于四氢呋喃(2ml)中并滴加到反应溶液中。低温下持续搅拌1小时，然后使混合物温热至室温。加入饱和氯化铵溶液(20ml)和水(10ml)，混合各相5分钟并分离。用醋酸乙酯(2×100ml)洗涤水相并在硫酸镁上干燥结合的有机相。过滤该混合物，并真空除去溶剂，得到橙色的油。通过柱色谱纯化粗油；流动相己烷，梯度至己烷/醋酸乙酯[90∶10]。分离出黄色固体的标题化合物(1.19g，4.95mmol，45％)。
中间体124-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酸的制备 将甲基8-氟-4-氧代二氢苯并噻喃-3-羧酸盐(1.19g，4.95mmol)和4-肼基苯甲酸(755mg，4.95mmol)与冰醋酸(10ml)混合。回流加热该混合物4小时。真空除去过量醋酸，产生橙色的油。加入醋酸乙酯(10ml)并声波处理该混合物。观察到橙色固体的沉淀。过滤收集该固体并用醋酸乙酯洗涤。将滤饼溶于二甲基亚砜(10ml)中，并在室温下空气氧化1周。向反应混合物中加水(20ml)，过滤收集固体，在醋酸乙酯中调成浆，过滤并真空干燥。分离出橙色粉末的标题化合物(175mg，0.51mmol，10％)。
LCMSm/z 341实施例169N-[3-(二甲氨基)丙基]-4-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备
将4-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酸(41mg，0.12mmol)溶于无水二甲基乙酰胺(1ml)中。加入二异丙基-乙胺(46mg，0.36mmol，62μl)，接着加入[(苯并三咪-1-氧基)-二甲氨基-亚甲基]-二甲基-六氟磷酸铵(65mg，0.17mmol)和3-二甲氨基丙胺(12mg，0.12mmol)。室温搅拌该混合物过夜并通过制备型HPLC纯化。分离出棕色固体的标题化合物。LCMSm/z 425[M+H]+活性**实施例170N-[(环己氨基)丙基]-4-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备
按照上面所述进行反应。LCMSm/z 479[M+H]+活性**实施例171N-(吡咯烷-1-基-丁基)-4-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)苯甲酰胺的制备
按照上面所述进行反应。LCMSm/z 465[M+H]+活性***实施例1734-(6-氟-3-氧代二氢苯并噻喃并[4，3-c]吡唑-2(3H)-基)-N-1，2，2，6，6-五甲基哌啶-4-基苯甲酰胺的制备 按照上面所述进行反应。LCMSm/z 493[M+H]+活性***测定部分在没有细胞的Homogenous Time Resolved Fluorescence(HTRF)测定法中测试上述实施例，以测定它们作为CD80-CD28相互作用的抑制剂的活性。
在测定法中，铕和别藻蓝蛋白(APC)与CD28和CD80间接相关(通过抗体连接体)形成复合物，其使铕和APC紧密接触，从而产生信号。该复合物包含下列六种蛋白荧光标记1、连接抗体1、CD28融合蛋白、CD80融合蛋白、连接抗体2、和荧光标记2。下表更详细地描述这些试剂。
在形成复合物时，铕和APC紧密接触并产生信号。
非特异性相互作用是通过用小鼠Fab片段(C215)取代CD80小鼠Fab片段融合蛋白(1.9μg/ml)而测量的。在30μl终体积的黑色384孔平板中进行测定。测定缓冲液50mM Tris-HCl、150mM NaCl pH7.8，含使用前才加入的0.1％BSA(w/v)。
以100μM-1.7nM的浓度系列将化合物加入到上述试剂中。室温培养反应物4小时。双重测量是使用Wallac Victor 1420 Multilabel Counter进行的。第一次测量激发340nm、发射665nm、延迟50μs、窗口时间200μs。第二次测量激发340nm、发射615nm、延迟50μs、窗口时间200μs。计数是相对于荧光交叉、淬火和背景自动校正的。
通过举例说明，实施例15、21、29、35和83化合物的EC50结果分别为8μM、1.9μM、950nM、148nM和90nM。为了方便，以概括形式记录上面所测试化合物的EC50如下EC50*＝＞10μM、**＝1-10μM、***＝＜1μM
权利要求
1.一种通式(I)的化合物或其药学或兽医学可接受的盐 其中R1和R3独立地代表H、F、Cl、Br、-NO2、-CN、被F或Cl任选取代的C1-C6烷基、或被F任选取代的C1-C6烷氧基；R2代表H、或任选取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基或任选取代的苯基；Y代表-O-、-S-、N-氧化物、或-N(R5)-，其中R5代表H或C1-C6烷基；X代表价键或二价C1-C6亚烷基；R4代表-C(＝O)NR6R7、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NHR6或-NHC(＝S)NHR6，其中R6代表H、或通式-(Alk)b-Q的基团，其中b为0或1且Alk是任选取代的二价直链或支链C1-C12亚烷基、C2-C12亚烯基或C2-C12亚炔基，其可被一个或多个不相邻的-O-、-S-或-N(R8)-基团中断，其中R8代表H或C1-C4烷基、C3-C4烯基、C3-C4炔基、或C3-C6环烷基，且Q代表H、-CF3、-OH、-SH、其中各R8可相同或不同的-NR8R8、酯基团、或任选取代的苯基、C3-C7环烷基、C5-C7环烯基或具有5-8个环原子的杂环；且R7代表H或C1-C6烷基、或当与和它们相连的原子连接在一起时，R6和R7形成具有5-8个环原子的任选取代的杂环。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是H、F、Cl、甲基或甲氧基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R2是H、甲基、甲氧基、环丙基、苯基、或氟-、氯-、甲基、或甲氧基-取代的苯基。
4.根据前述权利要求任何一项所述的化合物，其中R3是H、F、Cl、甲基、甲氧基或亚甲二氧基。
5.根据前述权利要求任何一项所述的化合物，其中Y是-O-、-S-、或-N(R5)-，其中R5代表H或甲基。
6.根据前述权利要求任何一项所述的化合物，其中X是价键、或-CH2-或-CH2CH2-基团。
7.根据前述权利要求任何一项所述的化合物，其中R4代表-C(＝O)NHR6、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6、-NHC(＝O)NHR6或-NHC(＝S)NHR6，且这些之中R6是H或通式-Alkb-Q的基团，其中b为0或1且Alk是-(CH2)n-、-CH((CH2)mCH3)(CH2)n-、-CH((CH2)mCH3)((CH2)pCH3)(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-、或-(CH2)n-O-(CH2)n-O-(CH2)m-，基团其中n为1、2、3或4且m和p独立地为0、1、2、3或4，且Q代表H、-OH、-COOCH3苯基、环丙基、环戊基、环己基、吡啶基、呋喃基、噻吩基或噁唑基，且R7是H，或当与和它们相连的氮原子连接在一起时，R6和R7形成吡咯烷-2-酮或吡咯烷-2，5-二酮环。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是H、F、或Cl；R2是H；R3是H、F、或Cl；Y是-NH-；X是价键；且R4代表-C(＝O)NHR6、-NR7C(＝O)R6、-NR7C(＝O)OR6或-NHC(＝O)NHR6其中R6是H或通式-Alkb-Q的基团，其中b为0或1且Alk是-(CH2)n-、-CH((CH2)mCH3)(CH2)n-、-CH((CH2)mCH3)((CH2)pCH3)(CH2)n-、-(CH2)n-O-(CH2)m-、或-(CH2)n-O-(CH2)n-O-(CH2)m-，基团其中n为1、2、3或4且m和p独立地为0、1、2、3或4，且Q代表H、-OH、-COOCH3苯基、环丙基、环戊基、环己基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、或噁唑基，且R7是H，或当与和它们相连的氮原子连接在一起时，R6和R7形成吡咯烷-2-酮或吡咯烷-2，5-二酮环。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是F，R2是H或环丙基，R3是H，X是价键，且R4是-C(＝O)NHR6、-NRHC(＝O)R6、或-NHC(＝O)NHR6。
10.N-(3-二甲氨基丙基)-4-(4-环丙基-3-氧代-3，5-二氢-吡唑并[4，3-c]喹啉-2-基)-苯甲酰胺，或其药学或兽医学可接受的盐。
11.根据权利要求1-10任何一项所述的化合物用于治疗受益于免疫调制的病症的用途。
12.根据权利要求1-10任何一项所述的化合物用于制备治疗受益于免疫调制的病症的药剂的用途。
13.一种在人类和非人灵长类中进行免疫调制的方法，包括给予需要这种治疗的受治疗者免疫调制有效剂量的权利要求1-10任何一项所述的化合物。
14.一种含有权利要求1-10任何一项所述的化合物以及药学或兽医学可接受的赋形剂或载体的药物或兽用组合物。
全文摘要
本发明涉及新的杂环化合物、它们的制备方法、含有它们的组合物、以及临床治疗可受益于免疫调制的医学病症，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、哮喘、移植、全身性红斑狼疮和牛皮癣的方法和用途。更具体而言，本发明涉及新的杂环化合物，其是能够抑制CD80与CD28间相互作用的CD80拮抗剂。
文档编号A61K31/4745GK1729191SQ200380106669
公开日2006年2月1日 申请日期2003年11月21日 优先权日2002年11月22日
发明者I·R·马修斯, T·S·库尔特, C·吉龙, C·J·布伦南, M·K·乌丁, L·O·G·彼得松, D·D·G·思里格, P·赫克斯利 申请人:活跃生物技术股份公司