专利名称：华中五味子酮在制备防治阿尔茨海默病药物或食品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是将华中五味子酮用于制备防治阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)药物或食品的用途。
背景技术：
AD是一种以记忆减退、认知障碍、人格改变为临床特征的老年中枢神经系统退行性疾病。随着全球人口老龄化，AD的防治已经成为一个突出的、亟待解决的医疗和社会问题，但由于AD的病因不完全明确，迄今尚无有效的防治药物。
β-淀粉样蛋白(Beta-Amyloid Protein，Aβ)异常沉积形成的老年斑是AD典型的病理特征。斑块周围显著的神经退行性改变和胶质细胞的活化提示Aβ可能是引起AD中神经元丢失和炎症反应的原因。在神经退行性病变中，胶质细胞的活化与神经元的死亡具有同等重要的作用，且两者之间存在一定联系(详见Bales KR，Du Y，et al.TheNF-kappaB/Rel family of proteins mediates Abeta-induced neurotoxicityand glial activation.Brain Res Mol Brain Res.1998；57(1)63-72.)。
2004年2月11日结束的国际氧化应激与神经变性病研讨会上，来自10余个国家和地区的学者一致认为，氧化应激增强和伴发的炎症反应是包括AD在内的许多神经变性病共有的两个主要特征。
华中五味子酮(Schisandrone)是从华中五味子(Schisandrasphenanthera Rehd.et Wils.)中提取分离得到的一种具有4-苯代四氢萘骨架的木脂素。有研究显示华中五味子酮对维生素C-NADPH系统或Fe2+-半胱氨酸系统诱发的脑微粒体脂质过氧化有抑制效应，对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生的超氧阴离子具有清除作用，其抗氧化活性强于维生素E，对处于活性氧应激状态下的细胞具有保护作用(详见 黄诒森、何燕、张均田.五味子三种成分的抗氧化作用.中国药理学与毒理学杂志.1990，4(4)275-277.)。但其对AD是否具有防治作用尚未见相关报道。
发明内容
本发明采用Aβ孵育原代培养的新生大鼠海马神经元细胞和小胶质细胞的方法建立Aβ诱导神经损伤的细胞模型，以及大鼠侧脑室内微量注射Aβ的方法建立AD的动物模型，采用五味子酮进行药物干预，通过生物化学、半定量逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、行为学等方法观察体外及在体条件下Aβ的神经毒性及五味子酮对Aβ所致毒性的干预作用。从细胞和动物实验结果均显示，华中五味子酮对AD具有防治作用，其表现为华中五味子酮能够减少Aβ诱导的原代培养的大鼠海马神经元细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生，降低Aβ诱导的原代培养的小胶质细胞中白细胞介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)的转录水平；并对AD样大鼠学习记忆能力的损害有一定程度的改善作用。因此可将华中五味子酮用于制备防治AD的药物或食品。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作详细描述。
实施例1.细胞实验(一)动物 新生24小时内SD大鼠，由第二军医大学实验动物中心提供。
(二)药品及试剂 DMEM培养基(Gibco公司)，Neuro-basal+B27(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，马血清(Gibco公司)，多聚-L-赖氨酸(Sigma公司)，阿糖胞苷(法玛西亚公司)，Aβ25-35(Sigma公司)，华中五味子酮(纯度＞98％)由第二军医大学药学院天然药物化学教研室陈海生教授提供(制备方法详见Li LN，Xue H.Schisandrone，a new 4-aryltetralonelignan from Schisandra sphenanthera.Planta medica.1985；(3)217.)，活性氧测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，总RNA抽提试剂Trizol(Gibco公司)，One Step RNAPCRKit(TaKaRa公司)，琼脂糖(Promega公司)。
(三)制备神经元细胞和小胶质细胞 取新生24小时内SD大鼠，无菌条件下取脑，剔除脑膜和血管，分离出双侧海马，冰浴解剖液洗2次，剪碎，加入1.25g/L胰酶2ml，置37℃、5％(V/V)CO2培养箱中消化15分钟，终止消化后用尖端已被火焰抛光的滴管吹打成悬液，以1000转/分钟离心5分钟，弃去上清液，沉淀用完全培养液(含100g/L胎牛血清和100g/L马血清的DMEM培养液)吹打成细胞悬液，过200目不锈钢筛网，并将滤液细胞数调至1×106个/ml，以5ml/瓶接种于预先涂有多聚赖氨酸的75cm2培养瓶中，置37℃、5％CO2培养箱中贴壁24小时后全量换液，以后每2天半量换液1次，此为混合细胞。第5天，取部分混合细胞，加入含终浓度为5μmol/L阿糖胞苷的上述完全培养液培养以抑制胶质细胞生长，得到神经元细胞备用；其余混合细胞置37℃空气恒温浴中低速振荡4小时，收集脱落细胞悬液，接种于直径3.5cm培养皿中，贴壁1小时，弃去未贴壁细胞，加入上述完全培养液继续培养，得到小胶质细胞备用。
(四)观察华中五味子酮对神经细胞受Aβ损伤的保护作用1.溶液配制①配制含Aβ的无血清培养液a.将Aβ25-35溶于Neuro-basal+B27无血清培养液，使Aβ浓度为50μmol/L，用于培养神经元细胞；b.将Aβ25-35溶于DMEM无血清培养液，使之浓度为50μmol/L，用于培养小胶质细胞。
上述配制好的含Aβ的无血清培养液需置37℃恒温箱内孵育3天进行老化后才能使用，可置37℃储存备用。
②配制含华中五味子酮的无血清培养液同法将华中五味子酮分别溶于上述两种无血清培养液，浓度均为10mmol/L，置37℃备用。
2.细胞分组 将上述(三)所制备并培养7天的神经元细胞和小胶质细胞各分为3组空白对照组、Aβ损伤组和华中五味子酮干预组。
①神经元细胞a.空白对照组用Neuro-basal+B27无血清培养液换液；b.Aβ损伤组用上述配制的含Aβ25-35的Neuro-basal+B27无血清培养液换液，Aβ终浓度为1μmol/L；c.华中五味子酮干预组用上述配制的含Aβ25-35的Neuro-basal+B27无血清培养液和含华中五味子酮的Neuro-basal+B27无血清培养液换液后共孵育，培养液中Aβ终浓度为1μmol/L，华中五味子酮终浓度为100μmol/L。
经上述换液后的神经元细胞置培养箱中继续培养48小时后，检测神经元细胞内ROS的含量。
②小胶质细胞a.空白对照组用DMEM无血清培养液换液；b.Aβ损伤组用上述配制的含Aβ25-35的DMEM无血清培养液换液，Aβ终浓度为1μmol/L；c.华中五味子酮干预组用上述配制的含Aβ25-35的DMEM无血清培养液和含华中五味子酮的DMEM无血清培养液换液后共孵育，培养液中Aβ终浓度为1μmol/L，华中五味子酮终浓度为100μmol/L。
经上述换液后的小胶质细胞置培养箱中继续培养48小时后，检测小胶质细胞IL-1β、iNOS的转录水平。
3.对神经元细胞内ROS含量的影响 将上述培养48小时后的神经元细胞用生理盐水冲洗3遍，加入1.25g/L胰蛋白酶2ml，置37℃、5％(V/V)CO2培养箱中消化15分钟，显微镜下见细胞变为圆形，震荡培养瓶使之脱落，随即加入Neuro-basal+B27无血清培养液终止消化，收集于离心管，1000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，沉淀用生理盐水2ml吹打成细胞悬液，调整细胞密度为0.5×106个/ml，超声粉碎细胞，功率15瓦，5秒/次共3次，间歇10秒，2000转/分钟离心10分钟，取上清进行ROS的测定和计算，具体方法详见试剂盒说明书。结果见表1。
表1 各组神经元细胞内的ROS含量(x±s)例数(n)ROS含量(U/ml)空白对照组 325.46±1.58Aβ损伤组3244.58±3.86★华中五味子酮干预组 3215.70±2.13☆※★Aβ损伤组与空白对照组比较，P＜0.01☆华中五味子酮干预组与空白对照组比较，P＜0.01※华中五味子酮干预组与Aβ损伤组比较，P＜0.01由表1可见，Aβ损伤组神经元细胞内ROS含量明显高于空白对照组(P＜0.01)，说明Aβ对神经细胞有毒害；而华中五味子酮干预组由于华中五味子酮的干预，使神经元细胞内ROS含量明显低于Aβ损伤组(P＜0.01)，虽较空白对照组为高，但仍显示出华中五味子酮对神经细胞有保护作用。
4.对小胶质细胞IL-1β、iNOS转录水平的影响①设计并合成引物 引物由上海生工生物有限公司设计并合成。引物序列见表2。
表2 人工合成引物序列目标产物引物序列产物片断上游引物5’-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AGG-3’IL-1β 245bp下游引物5’-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3’上游引物5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCA TG-3’iNOS317bp下游引物5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’β-actin上游引物5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’764bp(内参照)下游引物5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCTAG-3’②制备细胞总RNA 用Trizol试剂按照说明书抽提上述培养48小时后的小胶质细胞的总RNA。
③RT-PCR 以引物为介导、总RNA为模板使mRNA逆转录生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增反应。反应体系的建立详见One Step RNA PCR Kit的说明书。反应条件逆转录50℃30分钟，灭活逆转录酶94℃2分钟；进入循环变性94℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟，共40个循环。
④产物分析 将得到的扩增产物用2％琼脂糖(含0.5μg/ml溴化乙锭)凝胶电泳，并置于自动凝胶成像仪中，用随机软件分析各条带的光密度值，得到IL-1β或iNOS mRNA的相对表达量(内参照为β-actin)。结果见表3。
表3 各组小胶质细胞IL-1β及iNOS的mRNA水平(x±s)例数(n)IL-1β iNOS空白对照组 15 0.3066±0.09830.4553±0.0975Aβ损伤组 15 0.8474±0.11341.0080±0.1058★华中五味子酮预组15 0.4240±0.10540.5138±0.1053☆※★Aβ损伤组与空白对照组比较，P＜0.01☆华中五味子酮干预组与Aβ损伤组比较，P＜0.01※华中五味子酮干预组与空白对照组比较，P＞0.01由表3可见，Aβ损伤组小胶质细胞的IL-1β或iNOS转录水平较空白对照组有明显升高(P＜0.01)，说明Aβ对神经细胞有毒害作用；而华中五味子酮干预组由于华中五味子酮的干预，使IL-1β、iNOS的转录水平明显低于Aβ损伤组(P＜0.01)，并与空白对照组无明显差异(P＞0.01)，说明华中五味子酮对神经细胞具有保护作用。
实施例2.动物实验(一)动物及饲养 雄性SD大鼠，鼠龄8-12周，体重250-300g，由第二军医大学实验动物中心提供。标准环境下饲养温度(23±0.5)℃，湿度(50±0.5)％，自然光线，自由进食进水。
(二)溶液配制1.脑室内注射用Aβ溶液的配制 将Aβ25-35溶于无菌生理盐水，使Aβ浓度为10mmol/L，置37℃恒温箱内孵育3天老化后备用。
2.灌胃用华中五味子酮溶液的配制 将华中五味子酮溶于玉米油，使之浓度为1mmol/L备用。
(三)实验方法 将SD大鼠随机分为3组空白对照组、Aβ损伤组和华中五味子酮干预组。
1.空白对照组 大鼠予玉米油灌胃7天，方法为用灌胃针将2ml玉米油灌入大鼠胃内，1次/天，第8天侧脑室内注射无菌生理盐水，再继续用玉米油灌胃7天；2.Aβ损伤组 大鼠予玉米油灌胃7天，方法同上，第8天侧脑室内注射上述配制的Aβ溶液，再继续用玉米油灌胃7天，；3.华中五味子酮干预组 大鼠予上述配制的含华中五味子酮的玉米油灌胃7天，方法同上，第8天侧脑室内注射上述配制的Aβ溶液，再继续用含华中五味子酮的玉米油灌胃7天。
上述第8天侧脑室注射的方法；先将大鼠用2％戊巴比妥钠腹腔麻醉(40-50mg/kg体重)后，固定于脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，碘酊消毒后切开皮肤，参照Paxinos的《大鼠脑立体定位图》选择右侧侧脑室为注射靶区，于前囟向后1.0mm，中线旁开1.7mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，再用微量注射器以15μm秒的速度自脑表面垂直进针3.8mm，将10mmol/L Aβ25-35溶液5μl缓慢注入，留针2分钟后缓慢撤针，缝合切口。空白对照组则注入等体积无菌生理盐水。
(四)观察华中五味子酮对大鼠学习记忆能力的改善作用 将各组大鼠进行Y型电迷宫测试。选用电压30V，设A臂为起步区，按B→C→A臂顺序轮流作为安全区。大鼠在A臂起步区停留1分钟后，予以电击致其逃至安全区，再以此区作为起步区，作连续循环电击，两次电击之间休息1分钟。
1.学习测试 规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应，以达到连续10次中有9次正确反应前所需的电击次数(即尝试次数)表示其学习获得能力。若尝试次数超过35次则不再测试，并以35次为最大值计数。
2.记忆测试 大鼠休息24小时后，同法检测记忆力。以达到连续10次中有9次正确反应前所需的电击次数作为记忆成绩，同样以35次为最大值。结果见表4。
表4 各组大鼠学习记忆水平(x±s)例数(n) 学习成绩(次) 记忆成绩(次)空白对照组 88.25±11.76 5.75±6.43Aβ损伤组 834.17±10.03 25.83±14.37★华中五味子酮干预组 814.63±11.92 6.38±12.85☆※★Aβ损伤组与空白对照组比较，P＜0.01☆华中五味子酮干预组与Aβ损伤组比较，P＜0.01※华中五味子酮干预组与空白对照组比较，P＞0.01由表4可见，Aβ损伤组大鼠的学习记忆水平明显较空白对照组差(P＜0.01)，说明Aβ对大鼠学习记忆能力的损害；而华中五味子酮干预组由于华中五味子酮的干预，大鼠的学习记忆水平明显优于Aβ损伤组(P＜0.01)，且与空白对照组无明显差异(P＞0.01)，说明华中五味子酮对大鼠学习记忆能力的损害有改善作用。
上述各实验结果表明，华中五味子酮能够减少Aβ诱导的原代培养的大鼠海马神经元细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生，降低Aβ诱导的原代培养的小胶质细胞中白细胞介素-1β(Interleukin-1 beta，IL-1β)和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase，iNOS)的转录水平；并对AD样大鼠学习记忆能力的损害有一定程度的改善作用。因此可将华中五味子酮用于制备防治AD的药物或食品。
权利要求
1.华中五味子酮在制备防治阿尔茨海默病药物或食品中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是华中五味子酮用于制备防治阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)药物或食品的用途。华中五味子酮(Schisandrone)是从华中五味子中提取分离得到的一种具有4－苯代四氢萘骨架的木脂素。本发明通过细胞和动物实验，显示华中五味子酮对AD具有防治作用，其表现为华中五味子酮能够减少Aβ诱导的原代培养的大鼠海马神经元细胞中活性氧(ROS)的产生，降低Aβ诱导的原代培养的小胶质细胞中白细胞介素－1β(IL－1β)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的转录水平；并对AD样大鼠学习记忆能力的损害有一定的改善作用。因此华中五味子酮可用于制备防治AD的药物或食品。本发明为华中五味子酮的应用开辟了一个新途径。
文档编号A61K31/075GK1561975SQ20041001764
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月13日 优先权日2004年4月13日
发明者拓西平, 陈海生, 贾丽艳, 周俊, 朱嘉琦 申请人:中国人民解放军第二军医大学